DE2554850A1 - Glucamylase, verfahren zu ihrer herstellung, naehrmedium zur durchfuehrung des verfahrens und verwendung der glucamylase zum hydrolysieren von staerke - Google Patents

Description

"Glucamylase, Verfahren zu ihrer Herstellung, Nähnnediuin zur Durchführung des Verfahrens und Verwendung der Glucainylase

zum Hydrolysieren von Stärke"

Die Erfindung betrifft Glucamylase bzw. Glucamylasepräparate, ein Verfahren zu ihrer Herstellung· durch Fermentieren eines zur Bildung von Glucainylo.se befähigten Mikroorganismus in oinem mindestens eine Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium und gegebenenfalls Reinigen und Aufarbeiten des glucamylasehaltigen Fermentationsgemisches, durch das die Ausbeute beim Fer— inentationsvorgang verbessert wird, ein Nährmedium zur Durchführung dieses Verfahrens und die Verwendung der Glucainylase bzw. Glucamylasepräparate zum Hydrolysieren von Stärke,

Glucamylase ist bekanntlich ein Enzym, das Stärke in Glucose umwandeln kann. Die Verwendung von Glucamylase zur Herstellung von Glucose und glueοsehaltigen Sirupen ist dem Fachmann wohlbekannt. Die Verfahren, bei denen Glucamylase zur Anwendung kommt, lassen sich allgemein in drei Kategorien einordnen, nämlich Säureverflüssigungs-Enzymumwandlungs—Verfahren, Enzym— verflüssigungs-Enzymumwandlungs-Verfehren und das sogenannten "Enzymsolubilisierungs-Enzymumwandlungs-Verfahren"(das in den

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US-PS 3 922 197, 3 922 198, 3 922 199 und 3 922 200 beschriebene Verfahren zur Hydrolyse von körniger Stärke).

Beim Säure/Enzym-Verfahren wird Stärke in einer wäßrigen Suspension verflüssigt und hydrolysiert, die 2O bis 40 "/> Stärke und eine Säure, wie Salzsäure, enthält. Diese Suspension wird bei einem pH-Wert zwischen etwa 1 und 4,5 auf eine hohe Temperatur, d.h. eine Temperatur zwischen etwa 70 und etwa 160 C erhitzt, um die Stärke zu verflüssigen und teilweise zu hydrolysieren. Die verflüssigte und teilweise löslich gemachte Stärke besitzt im allgemeinen einen Dcxtroseäquivalcnt-Wert (ΠΙΟ) von bis zu etwa 20 und vorzugsweise bis zu etwa 15. Typische Säure/Enzym— Verfahren sind aus den US-Patentschriften 2 305 i68, 2 531 999, 2 893 921, 3 O42 584 und 3 012 944 bekannt.

Beim sogenannten "Enzym/Enzym—Verfahren" wird Stärke bei einer · Temperatur von etwa 85 bis etwa 105 C in Form einer wäßrigen Suspension verflüssigt und hydrolysiert, die 2O bis 4θ 96 Stärke und ein verflüssigendes Enzym, wie bakterielle $-Amylase, enthält. Der Dextroseäquivalent-Wert der verflüssigten und partiell hydrolysierten Stärke liegt im allgemeinen unter etwa 20 und vorzugsweise unter etwa 15« Ein revolutionierendes Verfahren zur Herstellung partieller Hydrolysate, die sich für die Umwandlung von Stärke in Glucose und glueοsehaltige Sirupe eig— nen, ist die Verflüssigung von Stärke in Wasser mit einem bakteriellen Cf-Amylaseenzympräparat bis zu einem Dextroseäquiva— lent-Wert von etwa 2 bis etwa 15t Erhitzen der die verflüssig-

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te Stärke enthaltenden Aufschlämmung auf über etwa 95 C und weitere Umwandlung der verflüssigten Stärke mit einem bakteriellen CX-Amy1aseenzympraparat bis zu einem DE von bis zu etwa 20 (US-Patentanmeldung Nr. 107 Vj6 bzw.US-Patentschrift 3 863 706).

Beim von körniger Stärke ausgehenden Enzym/Enzym-Verfahren wird eine Aufschlämmung körniger Stärke durch Einwirkung bakterieller Oi—Amylase, vorzugsweise eines von einem Mikroorganismus der Art Bacillus lichen!formis stammenden bakteriellen ^Λ-Amylaseenzympräparats unter Bedingungen solubilisiert, die so gewählt sind, daß die Stärke nicht gelatiniert oder verdünnt wird. Die solubilisierto Stärke kann dann mit Hilfe ander.er Enzyme, wie Glucamylase, in Glucose oder glucoselialtige Sirupe umgewandelt werden.

Die nach einem der vorstehenden drei Verfahren hergestellten partiell hydrolysierten oder solubilisierten Stärkeprodukte können dann mit Glucamylase—Enzympräparaten behandelt werden, um das Stärkehydrolysat in Glucose oder glucosehaltige Sirupe umzuwandeln·

Die enzymatisch umgewandelten Hydrolysate werden dann bekannten Reinigungsverfahren mit Aktivkohle und Ionenaustauschern unterworfen, um Farbkörper, geruchsentwickelnde Stoffe und Bestandteile zu entfernen, die zum Aschegehalt des Hydrolysates beitragen. Zu diesen bekannten Behandlungen gehören die Behandlung dos Sirups mit Aktivkohle bei einem sauren pH-Wert, d.h. einem pH-Wert von etwa k bis 6, bei dem die pH-aktivierte Kohle am

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wirksamsten ist, und nachfolgende Behandlung des mit Kohle behandelten Sirups mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz in der Wasserstofform und einem schwach basischen Anionenaustauscherharz in der freien Basenform.

Glucamylase ist dem Fachmann auch unter verschiedenen anderen Bezeichnungen, wie Glucoaniylase, Glucogenenzym usw. bekannt.

Glucamylase wird von vielen Arten von Mikroorganismen erzeugt. Bestimmte Pilzstämme der Gattung Aspergillus, wie als "Asper— gillus niger" bekannte Stämme und bestimmte Stämme der Gattungen Rhiζοpus und Endomyces erzeugen Glucamylase. Die vorstehend genannten Mikroorganismen erzeugen auch Enzyme wie r"^—Amylase und Transglucosidase, Die Transglucosidaseenzyme können Saccharid— polymere bzw. Polysaccharide erzeugen, die nicht fermentierbar sind. Die Anwesenheit von Transglucosidase in Glucamylase— Enzympräparaten ist daher im allgemeinen unerwünscht.

Zur Herstellung von Glucamylase sind dem Fachmann viele Methoden bekannt. Viele Methoden beziehen sich auf die Entfernung von in Glucaiuylaso-Enzympräparaten enthaltene Transglycosidase (US-PS 2 976 804, 3 042 584, 3 075 886, 3 117 063 und 3 254 003). Ein signifikanter Fortschritt der Herstellung von Glucamylase ist in der US-PS 3 012 944 offenbart, in der ein Verfahren zum Mutieren eines zur Erzeugung von Glucamylase befähigten Mikroorganismus beschrieben ist. Bei diesem Verfahren werden höhere Glucamylaseausbeuten erzielt und geringere Mengen an Transglucosidase erzeugt,

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Die Ilei-s tol Lung von Glucuinylase in technischem Maßstab wird in einer Vielzahl von Stufen durchgeführt, wobei man zunächst mit einer sogenannten Vermehrungsstufe beginnt, die man durch üe— impfen eines sterilisierten Nährmodiunis, das gewöhnlich in einem Schüttelkolben vorgelegt wird, mit Sporen aus einem KuIturabschnitt einleitet. Das Wachstum wird beschleunigt, indem man das Nährmedium belüftet und darin geeignete pH-Wert- und Temporaturbedingungen aufrechterhält. Die ersten Stufen werden zusammenfassend als "Kulturentwicklungsstufen" bezeichnet. Die Mikroorganismen aus der letzten Kulturentwicklungsstufe (der "Impfkulturstufe") werden zum Beimpfen einer großtechnischen Fermentationsvorrichtung vorwendet, um Glucamylase in technischen Mengen zu erzeugen.

Das Nührmodium enthält zumindest in der letzten Kulturentwick— limgsstufe als Hauptnährstoffe eine Kohlenstoffquelle in Form eines Kohlenhydrats und eine Stickstoffquelle, z.B. Nitrate oder Proteinmaterialien. Als Kohlenstoffquelle enthält das Nährmedium im allgemeinen gemahlenen Mais (Malsmehl) in Mengen von bis zu etwa 10 Gew.-'/o_t sowie Stärke in variablen Mengen, Vor dom Beimpfen mit dem Glucamylase erzeugenden Mikroorganismus wird das Nährmedium sterilisiert, indem man es auf mindestens etwa 120 C erhitzt und mehrere Minuten bei dieser Temperatur hält. Durch das Erhitzen des Nährmediums wird das Maismehl verflüssigt. Wenn der Gehalt an Maismehlfeststoffen jedoch übei' 10 ¹Jo liegt, so entwickelt sich eine so hohe Viskosität,· daß die normale Funktion der Rührer in der Fermentationsvorrichtung (Fermentator) behindert wird. Erhitzen des Nährmediums

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auf die Sterilisationstemperatur ohne Unterstützung bzw. Mitverwendung eines Ilydrolysekatalysators, z.B. eines Verflüssi— gurigsonzyms, führt zu einer Erscheinung, die der Fachmann als "Dampf s toßen" bezeichnet. Daher wird bei technischen Verfahren zur Erzeugung von Glucamylaso vor dom Sterilisieren im Nührmedium ein Όί—Amy läse enzym verwendet, um die Verflüssigung des Maismehls zu unterstützen und das Problem des sogenannten DampfStoßens zu Vermeiden.

Wonn die Zugabo von (X-Amylase während des Sterilisationsverfahrons auch dio Verflüssigung des Maismehls fördert, so ist trotzdem die Verwendung von mehr als 10 Gew.— °/o Maismehl in der Praxis wegen dos dadurch verursachten Viskositätsauf— baus nicht möglich.

Dor Erfindung lag diihur die Aufgab« zugrunde, Glucamylase bzw. Glucamylasepräparate sowie ein Verfahren zur Herstellung von Glucamylase bzw. Glucamylasepräparaten zur Verfügung zu stellen, die diese Nachteile des Standes der Technik vermeiden. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Glucamylase der eingangs bezeichneten Art gelöst, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie durch Fermentieren des Mikroorganismus in einem Nährmedium hergestellt worden ist, das als einzige oder Hauptkohlenstoffquelle enzymatisch verflüssigten, gemahlenen Mais (Maismehl) in einer Menge enthält, die einem Maismehltrockens üb s tanz gehalt von mindestens 16 Gew.— "/>, bezogen auf das Gesamtgewicht des Nährmediums, entspricht.

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Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Glucamylase durch Herstellen eines mindestens eine Kohlenstoff quelle enthaltenden Niihrmediums, Beimpfen des Nährmediums mit einem zur Bildung von Glucamylase befähigten Mikroorganismus und Fermentieren des beimpften Nährmediums, sowie gegebenenfalls Reinigung und Aufarbeiten des dabei erhaltenen glucamylasehaltigen Fermentationsgemischs, das dadurch gekennzeichnet iat, daß man ein Nährmedium herstellt, das als einzige oder Hauptkohlenstoffquelle soviel enzymatisch verflüssigtes Maismehl enthält, daß sein Gehalt an Maismehl— trockensubstanz, bezogen auf das Gesamtgewicht des Nährmediums, (Maismehlgehalt TS-B) mindestens 16 Gew.-⁰Jo beträgt,

Erfindungsgemäß wird somit ein Verfahren zur Herstellung von Glucamylase in einem Nährmedium zur Verfügung gestellt, das enzymatisch verflüssigtes Maismehl in einer Menge enthält, die einem Maismehlgehalt TS-B, d.h. einem auf das Gesamtgewicht des Nährmediums bezogenen Gehalt an Maismehltrockensubstanz von mehr als etwa 16 und insbesondere bis zu etwa 25 Gew.— ⁰Jo entspricht.

Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Verfügung, bei dem das Maismehl enthaltende Nährmedium zur Herstellung von Glucamylase vor dem Sterilisieren mit einer bakteriellen Ckr-Amylase behandelt wird, die von einem Bacillus licheniformis ■stammt, wodurch das Maismehl beim Sterilisieren in Gegenwart dieses Enzyms verflüssigt wird. Diese Ausführungsform der Erfindung führt zu einer Verminderung der Viskosität in der Kultur-

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brühe und einer Senkung des Energiebedarfs für die Rührer in den Fennentatoren, ermöglicht die Verwendung höherer Gehalte an Maismehl, wodurch GlucamyJase in höheren Konzentrationen erzeugt wird, und verringert die zum !erreichen der Sterilisa— tionstemperatur erforderliche Zeit, wodurch die Durchführung des Verfahrens weniger Aufmerksamkeit und Überwachung erfordert und der Abbau bzw, die Zersetzung der Nährmediuinbestandteile verringert wird.

Beim Verfahren der Erfindung wird ein Mikroorganismus, der zur Erzeugung von Glucamyläse befähigt ist, in einem Nährmedium fermentiert, das eine StickstoffquelIe und eine Kohlenstoffquel.le enthält, wobei als Kohlenstoff quelle enzymatisch verflüssigtes Maismehl vorhanden ist, und zwar in einer Menge,
d 1.OGiUCiIi Maismehl gehalt TS-B von mehr als etwa 16 und bis zu etwa I2^r) Gew.-?o entspricht.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von Glucamylase, bei dem
ein zur Bildung von Glucamylase befähigter Mikroorganismus
in einem Nährmedium fermentiert wird, das eine Stickstoffquelle und eine Kohl enstof fquelLo enthält, wobei als Kohlenstoffqualle Maismehl vorgesehen ist, das durch die Einwirkung von Wärme, Wasser und einem ^fY-Amylase-Enzympräparat, das von einem Mikroorganismus der Art Bacillus Iicheniformis stammt, verflüssigt worden ist.

Das Verfahren der Erfindung führt zu vielen wirtschaftlichen

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Vorteilen, insbesondere höheren Ausbeuten bei der Herstellung von Glucaray1ase,

ICinur der wichtigeren Vorteile des Verfahrens der Erfindung ist darin zu sehen, daß es in einem wäßrigen Medium mit vergleichsweise hoher Konzentration bzw. hohem Maismehl gehalt durchgeführt worden kann. Der Gehalt an Mai sinchl feststoff en liegt Lm allgemeinen in einem Bereich von etwa \6 bis 25 und üblicherweise in einem Bereich von etwa 18 bis etwa 22 "/>, Man kann auch niedrigere Konzentrationen anwenden, wobei in der liege 1 mit abnehmender Konzentration auch die Ausbeute an Glue — amylase sinkt.

Gemäß einer bovorzugten Ausführungsform zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung wird zuerst ein zur Erzeugung des G 1 ucamy 1 ase-ICnzympräparats geeignetes Kultur- bzw. Nährtnedium hergesteL1t. Das Nährmodium wird hergestellt, indem man Maismehl als Hauptkohlenstoffquelle, Maisquellwasserfeststoffe als Haupts ticks toff quelle , ein bakterielles f^-Ainylase-Enzympräparat., vorzugsweise von Bnci 1 Ins 1 ichenif ormis abgeleitete i" ^-Ainylaso, Wasser und weitere Nährstoffe, wie Stärke und Ammoniumsalze, mischt. Diese Mischung wird in der Regel bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis etwa 60 C durchgeführt. Dann wird das Gemisch mit Dampf allmählich auf eine Temperatur im Bereich von etwa ΠO bis 130, vorzugsweise etwa 120 bis 125°C erhitzt. Die bakterie 1 Ie oi-Amyläse kann dem Nährtnedium vor oder während des Erwärmens mit Dampf zugesetzt werden. Vorzugsweise wird das Enzym jedoch während des Aufheizens des Nährmediums zu—

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AQ -

goaοtz t.

Der pH—Wert dos Nährmediuins während der Sterilisation wird so eingesteil t, daß das bakterielle cif-Amylase-linzymprüparat seine maxiiiuiJo Wii'kung hat. Dor pH-Wort liegt in der Hegel in einem Ilereich von etwa ^,5 bis 7»5» vorzugsweise in einem Bereich von etwa 5,5 bis etwa 6,5 und insbesondere zwischen etwa 5|5 und 6,0.

Die Sterilisation wird vorzugsweise so durchgeführt, daf3 man das Niilirmed i um, das Maismehl , Maisquo llwasserf eststoffe , Wasser und bakterielle o{—Aiiiylase mithält, allmählich auf eine Temperatur von etwa 55 bis HO, vorzugsweise etwa 65 bis 75 G erhitzt, wobei der pH-Wert in einem Ueroich von etwa 5»5 bis 6,5 liegt. Das Nährmedium wird vorzugsweise eine kurze Zeitspanne, d.h. etwa I "5 bis 60, vorzugsweise 30 bis h5 Minuten auf dieser Temperatur gehalten, um das darin enthaltene Maismehl im wesentlichen zu verflüssigen oder zuverdünnen. Hierauf wird das Nährniediiun durch Einwirkung von Dampf weiter auf eine Temperatur von inimloHtotia etwa 11O und vorzugsweise mindestens 120 C erhitzt und mindestens 30, vorzugsweise mindestens etwa k5 Minuten bei dieser erhöhten Temperatur gehalten. Dann wird das sterilisierte Nährmedium abgekühlt und sein pH—Wert auf etwa 5»5 bis etwa 6,0 eingestellt.

Dann wird das sterilisierte Nährmedium mit dem Glucamylase erzeugenden Mikroorganismus beimpft, worauf man die Fermentation h3 bis Ί68 Stunden lang stattfinden läßt.

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Die Vorwendung höherer Mengen an verdünntοιη Maismehl im Fermontationsmedium, die durch die Verwendung von bakteriellen d-Amy-1 a se-Enzympräparat en, die vom Bacillus 1 ichenif orniis abstammen bzw. unter Verwendung von Daci3lus lichen!formis erzeugt wurden, ermöglicht es, mehr als 30 Glucamylaseoinheiten pro ml zu erhalten.

Als Glucamylase erzeugender Mikroorganismus kann ein beliebiges bekanntes Pilz-Amylasepräparat, insbesondere ein von einem Mikroorganismus der Gattung Aspergillus, Eridomyces oder Rhizopus stammendes Enzympräparat verwendet werden. Besonders bevorzugt ist (lio nach dom aus tier US-PS 3 O'l2 5H'l bekannten Verfahren, nach dem ein Pilz-Amylasepräparat von unerwünschter Transglucosidaseaktivität durch Behandeln in einem wäßrigen Medium mit einem Tonminoral befreit wird, gewonnene Glucamylase.

Die Glucamylaseaktivitätsoinheiten werden wie folgt bestimmt: Als Substrat wird ein mit Säure hergestelltes Maisstärke-Uydrolysat mit einem 1)10—Wert von 15 bis 18 verwendet,

dass In Hnssur gelöst und bis zu einem Trockensubstanzgehalt von k Gramm pro 1OO ml Lösung verdünnt wird.

Von dieser Lösung werden genau 50 ml in einen 100 ml fassenden McUkolben pipetiert. In den Kolben gibt man dann 5»0 ml einer 1,0 molaren Natriumacetat/Essigsäure-Pufferlösung (pH: ^,3). Dann wird der Mef3kolben in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 60 C gesetzt, worauf man nach 1O Minuten eine entsprechende Menge des zu untersuchenden Enzympräparats zugibt. Genau 120 Minuten nach der Zugabe des Enzympräparats wird die Lösung mit

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ο i IUiDa^-UUi I er Nati-oii I aufje bis zinn Phenol phthaloinumschlagymnkt abgestumpft bzw. neutralisiert. Dann wird die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt und auf das (Moßkolbon-)Volumen verdünnt. Dann wJrd Jeweils der Gehalt an reduzierenden Zuckern, berechnet als Dextrose an der verdünn ten Probe (umgewandelte Probe) und einer Vergleichsprobo, die auf analoge Weise, jedoch ohne Zusatz von Enzympräparat herbes tollt wurde, bestimmt. Die Glucamylaseaktivität wird dann nach der Beziehung

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^Λ = 2 X e

berechnet, in der die verschiedenen .Symbole folgende Bedeutung haben:

Λ = Glucamylaseaktivität in Einheiten pro ml oder g Enzympräparat ;

S = Gehalt ilur mit lOnzym umgewandt; 1 ton Probe an reduzierenden Zuckern in a/iOQ ml j

B = Gehalt der Vergleichsprobe an reduzierenden Zuckern in g/l 00 ml;

10 ■= Verwendete Enzympräparatmenge in ml oder g.

S sollte 1,0 g pi'o IOO ml nicht überschreiten.

Zum Vordünnen des Maismehls wird vorzugsweise eine bakterielle o( -Amyläse verwendet, die bei einem verhältnismäßig niedrigen ■pH-Wert, d.h. einem pH-Wert in einem Bereich von etwa 5»0 bis etwa 8,0, und auch bei verhältnismäßig hohen Temperaturen, d.h, bis zu etwa 105 C, aktiv ist. bevorzugte Quellen für derartige

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y lasen sind u.a. bestimmte Arten der Haci 1 lus-Mikroorgttnis— men, inabosoiwloro naci. 1 Ins Lichoniformis. Geeignete <X-Ainylasen äiinl in iler österreichischen Patentanmeldung '«836/70, der britischen Patentschrift I 2^l)G 83') und der US-PS 3 697 378 beschrieben, besonders geeignet sind Amylasen, die aus B_-^ lic lie lii f ο rmi s in der in der vorstehenden österreichischen Patentanmeldung und dom vorstehenden britischen Patent beschriebenen Weise gewonnen werden. Besonders bevorzugt ist die aus bzw. mit ü. ΐ iclien.1 f orind s Stamm NCIH 8061 gewonnene C^-Amylase. Weitere speziell geeignete Mikroorganismen sind u.a. die Ii. 1 ichenif ortnis Stämme NCTIJ 8059, ATCO 6^r>⁽)8, ATCC 663Ί, ATCC 8't8O, ATCC 99Ί5Α und ATCC 11 ^l)'<5· Diese Mikroorganismen sind bei der Verflüssigung von Maismehl außergewöhnlich wirkungsvoll, Kin derartiges cX-Amylasepräparat ist von dor Fa. Novo Torapeutisk Laboratorium, Kopenhagen, Diinomark, unter der Handelsbezeichnung' "TIIERMAMYL" erhältlich. Ui öse hande I siibl i clion Präparate sollten für den vorliegenden Zweck in Koiizentaationen von etwa 1,0 bis etwa 25 Aktivitiitseinheiten pro g Maismehl TS-B bei den weiter oben angegebenen pH—Wert— und Temperaturbedingungen eingesetzt werden.

THKHMAMYL weist folgende Kennwerte und -eigenschaften auf:

(a) Es ist thermisch stabil bzw. wärmebeständig,

(b) besitzt Aktivität in einem breiten pH-Bereich und

(c) seine Aktivität und Wäx'inbeständigkeit sind nicht von der Anwesenheit zugesetzter CaIciuinionen abhängig.

0 2 b /1 α 19

IDs weist folgende Analysenlcennwerte auf:

Trockensubstanz, % 94,6 94 ,6

_t\-Amyläse-Aktivität, IO/g (Anliefe-

rungszust.) 9 124

Proteingehalt, </o (tS-B) 21,2

Aschegehalt, "Jo (TB-B) 64,4

Calciunigehalt, <fo (TS-Il) 4,9

Andere geeignete (X-Ainylasepräparato sind TIUCRMAMYL 60 (flüssig) und TUKRMiUlYL 120 (fest) mit folgenden Anulysenkennwerten:

TiIERMAMYL THERMAMYL 60 120

Trockensubstanz (l\S), ','» .'35,'»

C\-Amy laseaktivi tat, IC/g (An I ie— | 1 56

ferungszust,)

Proteingehalt, $ (TS-B) 26,5

Aschegehalt, <ß> (TS-I3) 60,1

CalciumgohaJ t, °/o (TS-U) O,O4

Natriumgehalt, ^ (TS-D) 12,3

Die Ö(-Ainy 1 aseaktivität eines Enzyms bzw. Enzympräparats wird wie folgt bestimmt:

Man läßt das Enzym unter geregelten Bedingungen mit einer Standardstärkelösuiig reagieren. Die Enzymaktivität wird anhand des Ausmaßos der Stärkohydrolyse, die sich in einer Abnahme der spektrophotometrisch gemessenen Jodfärbungskapazität widerspiegelt, bestimmt. Die Einheit der bakteriellen C^-Amylaseaktivität ist die Enzymmenge, die erforderlich ist, um unter den

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9H	,R
2 1	05
21	,2
91	,2
ü	,72
12	,2

herrschenden Tostvoi'fahrensbodingungon K) mg Stärke pro Minuto zu hydrolysieren. Die Methode ist auf bakterielle Ctf-Amylasen, einschließlich handelsüblicher Präparate, mit Ausnahme von Präpiiraten, die eine signifikante Verzuckorurigsaktivität besitzen, anwendbar.

Es werden 0,3 bis O,5 g einer festen Probe oder 0,3 bis 1,0 ml einer flüssigen l'rolic in einer ausreichenden Menge einer 0,0025—molaren, wäßrigen CalciumcliLoridlösung, um eine Knzym-Lösung zu erhal ten, die etwa 0,2'l Aktivitütseinhei ten pro ml enthalt, gelöst.

Kin Gemisch aus 10 m I oi nor I -prozontigen Li ntnor-Stärkel ösung , die auf eine Gleichgewichtstemporatur von 6ü C gebracht ist, und 1 ml der zu prüfondon ICnzymprobenl ösung wird in einem dio Temperatur konstant hai tendon Und go ium 10 Minuten lang bei ö0 C gehalten. Dann wird aus dem Gemisch eine 1—mJ-Probe entnommen und einer Mischung aus 1 ml einer 1-molaren wäßrigen SaI zsäurelo'sung und etwa 50 ml destilliertem Wasser zugesetzt. IHi; rauf wird dio Jod fiirbungKknpazi tat dor so angesäuerton Probe bestimmt, indem man 3»0 ml einer 0,05-prozentigen wäßrigen Jodlösung zugibt, das Gemisch mit destilliertem Wasser auf I00 ml verdünnt und gut durchmischt. Hierauf wird die Absorption dieser Lösung im Vergleich zu derjenigen von destilliertem Wassex* bei einer Wellenlänge von 62Onm in einer 2—cm-Zelle gemessen, Die gleiche Messung wird an einer Standardstärkelösung, der anstelle der Knzymlösung Wasser zugesetzt wurde, durchgeführt, um die Absorption einer Blindprobe zu ermitteln.

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Die Knzymaktivität in Einheiten pro Gramm oder pro Milliliter errechnet sich nach folgender Beziehung:

linzyiiiaktivitä t =

(Absorption der HJ iridprobo—Absorption der Probe) χ Verdünnungsfaktor χ

Absorption der 1) lind probe χ 10 χ 10

Die Angabe "Dextrose—Äquivalent—Wert¹¹ bzw. "DE—Wert" bezeichnet in dem Sinn, in dom sie in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen verwendet wird, den Gehalt der in einem Stärke— hydroiysat en thai tenon gelösten Feststoffe an reduzierenden Zuckern, gemessen nach der Methode von Schoorl, berechnet als Glucose und angegeben in 'fo (ICncyc loped in of Industrial Chemical Analysis, Band II, Seiten Ή-Ίίί).

Die iinclifo 1 genden ilcispiclc erläutern die Erfindung, sind jedoch in keiner Weise als Beschränkung zu verstehen. Angaben in Teilen und Prozent beziehen sich jeweils auf das Gewicht, wenn nicht etwas anderes ausdrücklich angegeben ist.

Bei s ρ i e 1 I^

(a) luipfkul turlioratci 1 lung

Zunächst wird eine Impfkultux· zur Herstellung von Glucamylase wie folgt hergestellt:

In einem I 1 fassenden ICrlcnmeyer—Kolben werden 200 ml eines sterilen Nährnicdiums mit folgender Zusammensetzung vorgelegt:

6 Ü 9 8 2 b / 1 Ü I 9

Maisquoll wassorf es ts to ff'c 2,0 '/a (TS-B)

Gemahlener gelber Mais 5,0 ^lfo (tS-B)

Natriumhydroxid bis pll 6,0 - 6,5

Das voi'gelogte Nährmodiuin wird mit einer Schleife Sporen von einor sporenhaltigen Kulturprobo eines Mu tan tonst amins von Asper— /Ti llus nift-er gemäß US-PS 'J 012 Wl beimpft. Der beimpfte Kolbon wird auf einem Rotationsschiit tolapparat htt Stunden bei 30 bis 35°C bebrütet. Dann wird der Kolboninhalt in einen 7,5 1 fassenden Formern ta tor übex* führt, indem Ί 1 dos gleichen Impf- bzw. Kulturmediums, deis vorher 1,5 Stunden bei 121 C und pH 6,0 sterilJaiert wurde, vorgelegt sind. Dann läßt man den Impf— kitl I urformatator tih Stunden lic i einer Temperatur von '}'i C mit 500 Uindrehuiifjen ρχ·ο Minute auf einem liotat.i onsschiitt ler rotieren, wohoi in tlaa Mudluni ρι·ο Ml unto '} 1 Luft eingeleitet worden, Π i ο no Inn'coslcl lic Impfkultur wird zur Herstellung von GlucamyJaso in ^O 1 fassenden Fermentatoren verwendet.

(b) Herstellung eines sterilisierten Nührmediums

Das in diesem Beispiel für die Herstellung von Glucamylase zu verwendende s tex*i Ii sior te Nahrmedium wird in mehreren getrennten Ansätzen in jeweils 't0 1 fassenden Fermentatoren hergestellt, die jeweils mit einem 6-flugeIigen Propellerrührer mit einem Durchmesser von 11*1,3 mm und einer Breite von 22,225 mm .sowie einer Einrichtung zum Einleiten von steriler Luft mit einer Geschwindigkeit von 2^ 1 pro Minute ausgerüstet sind, hergestellt. Die Kernientatoren werden mit 6O0 UpM, 2,055 kp/cm" Kesseldruck und bei einer Temperatur von etwa 33 C gefahren.

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Die Fortneiitatoron werden jeweils mit 29 1 eines Fermentations— büw. Nährmediuins mit folgender Zusaiiunensetzui^ beschickt:

Maianiohl Nr. 2 15,9 # JTS-D), 4?7O g (TS-B),

(Fermentatoren Nr. 1, 2 und 3) 5'l5O (J (Hü)

Maismehl Nr. 2 20,0 # (TS-Π), 6000 g (TB-D),

(Fermentator Nr. Ί) 69ΟΟ g (HD)

Maisquellwaseorreststoffe 2,5 ^ (TS-B), 750 g (TS-B),

150 e (HB)

Natriumhydroxid bis pH 6,0-6,5

(vor der Sterilisation)

Das Fennontationsinodium in drei der Forniontatoron wird jeweils mit einem handelsüblichen ΓΧ -Ainylasepräparat (THERM AMYL 60J versetzt, iiiul zwiir in oinor Menge, die 1,6, 2,8 bzw. '»,0 CPC-iO-AmylaseeinJxei— ten pro g Malsmelil TS-B entspricht, während das Fermentations— medium im vierten Fermentator mit einem anderen handelsüblichen (A-AinyJ asupriiparat, nUmlich CPli-8 in einer I ,6 Λ-Ainylaseeinheiten pro {<; MaiHiiiohl TS-H ontspiOclioiuloii Mengo versetzt wird. Das Enzym wird jeweils während dos Aufheizons des Fermentators mit Dampf zugesetzt, wenn die Temperatur 6Q C überschreitet. Die Temperatur wird jeweils 30 Minuten bei 75 C gehalten, worauf man sie aiii" 121 C steigen läßt und ^5 Minuten auf diesem Wert halt, um dcis Fermentationsmedium zu sterilisieren. Nach dein Sterilisieren beträgt das Volumen der in den Fermentatoren enthaltenen Chargen jeweils 30 1.

Als bakterielle ίΛ-Amylase-Enzympräparate werden zur Verflüssigung des Maismehls in den Fermentatoren während der Verflüssigung und Sterilisation des Nährmediums THERMAMYL 60 (flüssig) mit einer Aktivität von 1270 CPC-öt-Amylaseeinhoiten pro ml, d.h. ein aus

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-AS-

Baoi 1 lua I j ehoni Γοηιι t s (;uwonneiiG« bakterielles (Tl-Ainy I aseenzytnpräpai'at, und CPH-H, ein trockenes Präpartit mit auf oinein Oalciumträger iinmobi lisi ertom Enzym und einer Aktivität von 3200 CPC-Ci-Amylaseeinhoiton pro g (Produkt der Wallerstein Division der Fa. Baxter Laboratories, Inc.) verwendet.

Die Viskosität der vorstehend beschriebenen Nährmedium wird jeweils sowohl nach dem Verdünnen als auch nach dem Sterilisieren geraessen, um die Vorzüge der Verwendung von Enzymen, die von llaci llus lichoni formis abgeleitet sind bzw. stammen, feststellen zu können. Die Verdünnung und Sterilisierung werden in dem vorstehend beschriebenen, hO 1 fassenden Formentator durchgeführt. Das Nährinediuni, dessen Maismchlgehalt TS-Ü 15»9 Gew.-^ beträgt, wird bor einem pH-Wort von 6,O mit Dampf auf 75 C erhitzt. Wenn die Temperatur 60 C überschreitet, wird die c?(,-Amylase zugesetzt. Die Temperatur wird 30 Minuten bei 75 C gehalten, worauf man Ί5 Minuten bei 121 C sterilisiert. Die Ergebnisse der Viskositätsmessungen an den sich dabei ergebenden Nährmedien sind aus der nachstehenden Tabelle I zu ersehen.

T a b ο 1 1 ο Τ

Einfluß der Enzyinverdünnung auf die Viskosität nach

d.t;m Sterilisieren

fl-Amylaso (Einheiten/g Mais (TS-B))

TIIERMAMYL 6O CPR-8

1 ,6 2,8 *U0 1 ,6

lirookf ield-Viskosität,

_cP ^a) !55 ₁₇o 155 3600

a) = gemessen bei '33 I*

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Aus don vors tollenden Versuchsergebriisseti ist IcJ ar zu erkerinun, daß man bei Verwendung einer cK-Ainylase, die von Bacillus licheniforinis abgeleitet ist, eine überlegene Verflüssigung und Verdünnung erzielt. Dieser spezielle Vorteil der Erfindung (niedrigere Viskosität im Fennentationsmodium) führt zu einem besseren Wärmeübergang (erleichtert die Sterilisierung), einem vermindertem Energieverbrauch der Rührer und zu einer Verminderung des Dampfstoüens infoJgc der !einleitung von Dampf in das Maismehl enthaltende Medium während dos Erhitzens, wenn die Stärke verflüssigt wird (der Aufheizvorgang verläuft bei der Verwendung von TMCRMAMYL glatt, während die Fermentatoren bei der Verwendung von CPR-8 während des Aufheizens stoßen). Die wirksamere Verflüssigung bei der Verwendung von TiIERMAMYL ermöglicht, ein rascheres Aufholzen auf die Sterilisationstemperatur und schnellere Abkühlung, so daß der Sterilisationsvorgang vorkür/t. und dadurch die FerniGntator] eistung gesteigert werden kann.

Jn den vorstehend beschriebenen 'fO Liter fassenden Fermentatoren \v i rd eine weitere Versuchsreihe durchgeführt, wobei oin Nährmedxum mit einem Maismehlgehalt TS-D von 15,9 Gew.-^, verwendet wird, dem man während der Sterilisation in der vorstehend beschriebenen Weise bei einem pH-Wert von 6,0 CPR-8-Enzyinpräparat in einer 3 bis 12 CPC-Ct-Amylaseeinheiten pro g Maismehltrockensubstanz entsprechenden Menge zusetzt. Dabei entsteht in jedem Fall eine stark gelierte Masse. Bei der Durchführung von Vorgl ei chsvorsiichon unter Verwendung von THERMAMYL als Enzympräparat wird das Nährmedium dagegen sowohl bei einem

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Mai smehlgeha 1 t TS-B von 15,9 oder 2O Gew.-'/o sichtbar dünn.

(c ) G1 ncamy 1 asoi'ermontati on

In dom vorstohond bosclirJehencn ho Li tor fassenden Ferniontator worden unter Verwendung von Nährmedion mit oinorn Gelialt von
15,9 bzw. 20,0 Gow.-'/o verflüssigtem und sterilisiertem Maismehl (TS-H) inulirore G lncainy 1 asof ernientati onsversuche durchgerührt. Uoi einem MaLsmehlgehalt TS-H von 20 Gew.-'/o werden - zum Verblei ch - als fl(—Amylasepräparat sowolii CI'R—8 als auch TIIICHM-ΛΜΪ1. vorwondot. Man erhält Jeweils 30 J sterilisiertes Nährinediuiii. Jeder Charge worden 1,5 1 gemäß HeispieJ 1 (a) hergestellte Iinpi'ku 1 tür zugesetzt, wodurch sich diis OhurgenvoJ unten auf '51,5 1 erhöht. Das Maismehl wird in allen Nährmedion mi fc
v^-AmyJase in einer jeweils 1,6 CPC-(?(.-Amylaseaktivitätseinheiteii/ij Mai smehl tx'ockensubstanz entsprechenden Menge verflüssigt. Die G I ucaniylaso formen ta t i oneii läiit man während einer Zeit von bis zu I68 Stunden lauTon. Dabei werden von Zeit zu Zeit Amtlysenprobon gezogen. Hei der Verwendung eines Nährmediums mit einem Mai sinehlgehal t TS-H von 15,9 Gev,-°/o (verflüssigt mit
01Mi-H)beträt?t die Glucamylaseausbeute nach i'l'l Stunden etwa
29 AktLvitätsoinheiten pro ml, bei der Verwendung eines Nährinodiums mit einem Maismehl gehal t TS-D von 20 Gew. -⁽/o (ebenfalle mit ClMi-H verflüssigt) dagegen 32 Aktivitätseinheiten pro ml. Verwendet man ein Nährmedium, das mit TIIIiRMAMYL verflüssigtes .Maismehl in einer ei nein Maisiiiehlgeha.lt TS-B von 20 Gew. —'fo
entsprechenden Menge enthält, so betrügt die Glucamylaseausbeute nach \hh Stunden - Fermentationsdauer 37 Aktiv!tätsoinheiten pro iiii. Diese ICrgebiiLsse liissen klar erkennen, daß unabhängig

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davon, wo] dies 0{ -Amy 1 asepräparat /ur Verfliias igung des Mais— mοhüs verwendet wird, durch die Verwendung von Nährmedien mit einem Gehalt an verflüssigter Mai sinehl trockonsubstanz von mehr als 16 Gew. —fo höhere Glucarnylaseausbeuten erzielt werden können, sowie daß man noch höherere Glucamylaseausbeuten dadurch erzicleu kann, daß man Nühi'inodien verwendet, die mit einer von Baci 1 lus 1 i choni f orini s staniinonden cX,-Amy läse verflüssig tes Maismehl enthalten.

Unter Verwendung von jeweils 1,5 1 gemäß Beispiel 1 (a) hergestellter Impfkultur werden in dem vorstellend beschriebenen '(O 1 fassenden Ferinontator 10 weitere Ansätze gefahren, wobei jeweils ein Nührinediuin mit einem Maismehl ^e hai t TS-B von 20 Gew.-verwendet w.i ι·ιΙ. Hei 5 dle.ser VuthiicIh! <;nl.hälL das NUhrmedium mit CPR-8-Enzym vorflüssigtes Maismehl, während es bei den restlichen 5 Versuchen jeweils mit TIIERMAMYL 6θ (flüssig) verflüssigtes Maismehl enthält. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der nachfolgenden Tabelle II wiedergegeben.

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TABELLE

II

ο co αο

40-LITER GLUCAMYLASE-FERMENTATIONSANSÄTZE

Ergebnisse bei Ansätzen mit 20 % TS-B Maismehl, 2,5 i« TS-B Maisquellwasser unter Verwendung von CPR-8- bzw. THERMAMYL-C*. -Amylase zum Verdünnen

Max. Max. Ot-HoIo/

GA <*-Holo, GA-Ver-

Ansatz E/ml E/ml hältnis TG-Einheiten/GA-Einheit Alter, Std.

Mit CPR-3 ei -Amylase, (i,6 Einheiten pro g Mais (TS-B^verdünnte Ansätze

A	Mittel	F	35,0	78,8
B	G	35,8	80,5
C	H	37,0	67,0
D	I	31,8	52,3
E	J	34,6	66,7
34,8	69,1
33,2	70,5
36,6	65,7
33,0	69,0
36,5	71,2
34,4	77,0

2,25 2,25

1 ,81 1,65 1 ,93

1,25
1,12

2,12

1,79 1,95 2,24

1,93

0,91
0,95
0,92
1,00
,12

163 168 168 168 162

1,98 1,09 165

Mit THERMAMYL-CX-Amylase verdünnte Ansätze

Mittel 34,8 70,7 2,00 0,98

Mittelwerte für ein Medium mit einem Maisgehalt von 15,9 y (TB-B):

27,5 54,2 2,01 Nicht bestimmt 146

O^-Amylaseeinheiten pro S Mais (TS-B)

168	4,0	ro cn
14O	1,6	cn
162	1,6	00
162	2,S	cn
162	4,0	CD
159

Die in der verstehenden Tabelle II wiedorgegebenen Versuche— ergebnisse zeilen, dali der Durchschiri t Iswert der Glucamy— Jasüiuisbeute bei beiden Gruppen von jeweils 5 Chargen bzw. Ansätzen Jeweils 3h , H Gluoamylasoei nhei ten pro ml beträgt. Auch hinsichtlich des d -Ho loamy ] asc/Gliioamylase—Verhältnisses und des Transglucosidaso/G I ucamylase—Verhäl tnisses sind zwischen den beiden Versuchsgruppen keine signifikanten Unterschiode festzustellen· Die Versuchsorgebnisse zeigen ferner, daß - unabhängig davon, welches LOnzym zur Verflüssigung verwendet wurde eine Steigerung des Glucaiiiylasegehi.il ts in der filtrierten KuI-turbriihe von 27 /» erzielt wird. Durch die Verwendung von THERM— AMYL wird jedoch die Gesamtwirtschaftlichkeit des Verfahrens aufgrund dor verminderten Viskositäten, wie vorstehend beschrieben, vorbessert.

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt die verbesserten Ergebnisse, die bei der Verwendung einer von Baci 1 lus licheniformis stammenden^-Aniylase (THETiMAMYL 60, flüssig) im Vergleich zur Vorwendung von CPR-8 bei der Herstellung eines Glucaitiyl asenahrinediuins in einem großtechnischen Fermentator erzielt werden. In einem großtechnischen Fermentator mit einem Fassungsvermögen von 75 706 worden nacheinander zwei getrennte Vergleichsversuche gefahren, wozu der Formentator in der aus der nachfolgenden Tabelle III v. ti ersehenden Weise beschickt und gefahren wird.

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T a I» ο 1 1 ti Π Ι

Nährinodi um οί.- Amy I fuse;

OPW-H THKUMAMYi, 6O

h'assci· 'l^r> Ί2Ί l.tr. Ί 5 'l2'l Mr.

Mai aquei J wasser mi L

5Γ2 - ·>'! ',OTS 2HVJ₁I " 2K53,I "

Maismehl mit 15 '/,> H₀O-Go- . x

halt " 12 7Ο1 kg 12 701 kg ^;

TIlKWMAMY I. 60 (flüssig) — 19,28 kg

Zeit bits 12I,1°C erreicht χ

Hi ml M Std. ^; 1 , «5 Stci.

AbUiMi I zeit '} " 1,5"

a) Knt spricht 1,6 Ol'C-tX-Aiuy 1 .asoe i iihe L ten/y Mais (TS-B)

b) 1 .'2 7^1 Ufj aiiul die bei CPH-M höchste sinnvoll eiiiHOtzbaro Menge, während bei Verwendung von THERMAMYL 15 880 kg Maismehl eingesetzt worden können, was wiederum zu höheren Glucainylaseausbeuten führt,

c) Hol der Verwendung von Cl'Ii-8 sind deshalb 8 Stunden zum Ali Π10 i zoll er forderlich, weil man den Ansatz sich wegen des begrenzten Stabil! tütsbereichs vox· der Zugabe des liiizymjjräparats allein durch die Reibungswärme der liührer bis 82,2°C erwärmen lassen und auch danach nur sehr langsam Dampf zuführen darf, um heftiges Stoßen der Fermentatoreri zu vermeiden.

Hei der Verwendung von THKRMAMYL ist dagegen keine dieser Vorsichtsmaßnahmen erforderlich,

Wie aus dan vorstellenden Versuchswerten zu ersehen ist, eröffnet, die Erfindung einen verbesserten Wog zur Herstellung eines ■/.uv Fermentation geeigneten Nahrmediums durch die Verwendung von durch Einwirkung eines bakteriellen iX—Aiiiylase—Krizympräparats, das von HacilJus 1 ieheiii fornii s stammt bzw. unter Verwendung von Mikroorganismen der Art Bacillus licheniformis gewonnen

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worden ist, vcrfHissißtom Maismehl. Dieses verbesserte Vorfahren zur Herstellung eines Nährmediunis eignet sich für praktisch jedes Ferinentationsverfaliren, für das Stärke als Kohlenstoffquelle benötigt wird. Durch die Verwendung von mit aus Bacillus licheni form! s gewonnener bakterieller C{—Amy— läse verdünntem Maismehl bzw. gemahlenem Mais wird die Gesatntwirtschaftlichko.it doi' Fermentation verbessert, und zwar insbesondere bei der Herstellung von Glucamylase.

Die nacli dem Verfahren der Erfindung hergestellten Glucamylase-Enzymprüparate können zur Hydrolyse von Stärke zur .Herstellung von Glucose und/oder glucosehaltigon Sirupen verwendet werden. Uei einem geeigneten Verfahren wird zunächst Stärke mit Säure oder einem Enzym partiell hydrolysiert und dann mit der Glue— ainylase bis zum gewünschton Grad umgewandelt. Die partiell hydrolysierte Stärke wird durch die Eimvirkung eines bakteriellen iX-Amylase-Enzympräparats im wesentlichen vollständig, jedoch nur bis zu einem DE—Wert von nicht wesentlich mehr als etwa 20 vorflüssigt. Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der partiell hydrolysioz'ten Stärke ist in der US-Patentanmeldung Nr. 107 Ί36 bzw. der US-PS 3 853 706 beschrieben, auf die hiermit Bezug genommen wird. Ein anderes bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der teilweise hydrolysieren Stärke, die in Verbindung mit den Glucainylasepräparaten der Erfindung verwendet werden kann, ist in den US-PS 3 922 197, 3 922 198, 3 922 199 und 3 922 200 beschrieben, auf deren Inhalt hiermit ebenfalls Bezug genommen wird.

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-2f ·-

Die folgende Zusammenfassung zeigt die erfindungswesentlichen und bevorzugten Merkmale und Ausführungsformen der Erfindung: Die Erfindung offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Glucoamylase durch Fermentieren eines Mikroorganismus, der zur Erzeugung von Glucoamylase in einem Mhrmedium befähigt ist, -das eine Kohlenstoffquelle enthält, wobei diese Kohlenstoffquelle enzymatisch verflüssigtes Maismehl mit einem Peststoffgehalt von wenigstens etwa 16 % Trockensubstanz, vorzugsweise 18 bis etwa 22 % Trockensubstanz und insbesondere etwa 20 % Trockensubstanz aufweist. Vorzugsweise wird ein Uährmedium verwendet, daß auch eine Stickstoffquelle enthält, die hauptsächlich vom Maisquellwasserfeststoffen abgeleitet ist. Vorzugsweise wird das Maismehl mit einem Enzympräparat aus bakterieller oc-Amylase verflüssigt, die von Bacillus licheniformis stammt, insbesondere von den Bacillus licheniformis Stämmen NCIB 8061, WCIB 8059, ATCC 6598, ATCC 6634, ATCC 8480, ATCC 9945a und ATCC 11 94-5-

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird als Glucoamylase erzeugender Mikroorganismus ein solcher verwendet, der von Aspergillus niger stammt, insbesondere ein Mut ant enst amm.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren durchgeführt, indem man eine wässrige Aufschlämmung, die das Maismehl bei einem pH im Bereich von etwa 4,5 bis etwa 7,5 "und bei einer Temperatur im Bereich von etwa 55 ⁰C

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bis etwa 80 ⁰C enthält, behandelt, bis das Maismehl im wesentlichen verflüssigt ist, und dann in einer zweiten Stufe die Temperatur des Fermentationsnährmediums auf wenigstens etwa 11O⁰C erhöht, um das Nährmedium zu sterilisieren, wobei vorzugsweise die Aufschlämmung nach dem Sterilisieren abgekühlt, dann die abgekühlte Aufschlämmung mit dem Mikroorganismus beimpft wird, der zur Erzeugung von Glucoamylase befähigt ist, und die beimpfte Aufschlämmung zur Erzeugung von Glucoamylase fermentiert wird. Vorzugsweise erfolgt die Fermentation bei einem pH im Bereich von etwa 5»5 bis etwa 6,0.

Ein spezielleres Verfahren zur Erzeugung von Glucoamylase in einem Eahrmedium besteht darin, daß man dieses Nährraedium herstellt, indem man eine wässrige Aufschlämmung, die Maismehl enthält, mit einem bakteriellen a-Amylaseenzympräparat behandelt, das von dem Mikroorganismus Bacillus licheniformis abgeleitet ist, und zwar bei einem pH im Bereich von etwa 4-,5 bis etwa 7»5 und bei einer Temperatur im Bereich von etwa 55⁰O bis etwa 80⁰C um dieses Maismehl im wesentlichen zu verflüssigen, die Temperatur der Aufschlämmung auf wenigstens 110⁰C erhöht und diese Aufschlämmung so sterilisiert, sie abkühlt, mit einem Mikroorganismus beimpft, der zur Erzeugung von Glucoamylase befähigt ist, und die beimpfte Aufschlämmung zur Erzeugung von Glucoamylase fermentiert. Dabei wird vorzugsweise eine bakterielle α-Amyläse verwendet, die von Bacillus licheniformis NCIB 8061,

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NOIB 8059, ATCG 6598, ATOC 6634, ATGO 8480, ATGC 9945a und/oder ATCG 11 94-5 abgeleitet ist oder von einem zur Erzeugung von Glucoamylase "befähigten Mikroorganismus der Gattung Aspergillus niger oder einem davon abgeleiteten, insbesondere einen Mutantenstamm davon.

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Claims (16)

1. Patent ansprüche

   (T) Glucaraylase, erhalten durch. Fermentieren eines zur Bildung von Gluamylase befähigten Mikroorganismus in einem mindestens eine Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmedium und gegebenenfalls Reinigen und Aufarbeiten des glue amylas ehalt igen Fermentationsgeraischs, dadurch gekennzeichnet , daß sie durch Fermentieren des Mikroorganismus in einem Nähr— medium hergestellt worden ist, das als einzige oder Hauptkohlenstoffquelle enzymatisch verflüssigten, gemahlenen Mais (Maismehl) in einer Menge enthält, die einem Maismehltrockensubstanzgehalt von mindestens 16 Gew.-^a, bezogen auf das Gesamtgewicht des Nährmediums, entspricht.
2. 2. Verfahren zur Herstellung von Glucamylase gemäß Anspruch durch Herstellen eines mindestens eine Kohlenstoffquelle enthaltenden Nährmediums, Beimpfen des Nährmediums mit einem zur Bildung von Glucamylase befähigten Mikroorganismus und Fermentieren des beimpften Nährmediums, sowie gegebenenfalls Reinigen und Aufarbeiten des dabei erhaltenen glucamylasehaltigen Fermentationsgeraisches, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium herstellt, das als einzige oder Hauptkoh— lenstoffquelle soviel enzymatisch verflüssigtes Maismehl enthält, daß sein Gehalt an Maismehltrockensubstanz, bezogen auf das Gesamtgewicht des Nährmediums (Maismehlgehalt TS-B), mindestens 16 Gew.-^ beträgt.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein

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   Nährmedium mit einem Maismehlgehalt TS-B von 18 bis 22 Gew.-$ hergestellt wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3» dadurch gekennzeichnet, daß ein Nährmedium mit einem Maismehlgehalt TS-B von mindestens 20 Gew.-?£ hergestellt wird.
5. 5· Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Nährmedium hergestellt wird, das mit einer bakteriellen<X—Amylase, insbesondere einer von einem Mikroorganismus der Art Bacillus licheniforrois, vorzugsweise einem Stamm aus der Gruppe Bacillus licheniforniis NCIB 8θ6ΐ , NCIB 8059, ATCC 6598, ATCC 6634, ATCC 8480, ATCC 9945a und ATCC 11 945» erzeugten Öi-Amylase verflüssigtes Maismehl enthält.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung des Nährmediums eine wäßrige Aufschlämmung des Maismehls mit der bakteriellen (Λ-Amylase bei einem pH—Wert von etwa 4,5 bis 7»5 und einer Temperatur von etwa 55 bis 80 C fermentiert, bis das Maismehl im wesentlichen verflüssigt ist, und das Nährmedium dann durch Erhitzen auf mindestens etwa 110°C sterilisiert.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das Nährmedium nach dem Sterilisieren abkühlt₇bevor es mit dem zur Bildung von Glucamylase befähigten Mikroorganismus beimpft wird .

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8. 8,^v Verfahren nacti einem der Ansprüche 2 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß ein Nährmedium hergestellt wird, das außerdem Maisquellwasserfeststoffe als Haupt stickst off quelle enthält.
9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus, der zur Bildung von Glucamylase befähigt ist, ein Mikroorganismus der Art Asper-'gillus niger _t insbesondere ein Mutantenstamm von Aspergillus niger verwendet wird.
10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9» dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentierung bei einem pH-¥ert im Bereich von etwa 3»5 h±s 6,0 durchgeführt wird.
11. 11. Mittel mac Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 2 - 9 in JPorra eines Uährmediums, dadurch gekennzeichnet, daß es als einzige oder Hauptkohlenstoffquelle mindestens 16 und vorzugsweise 18 Ms 22 Gew.~% enzymatisch irerflüssiigtes Maismehl TS-B enthält.
12. 12. Nährmediura nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch einen Maismehlgehalt TS-B von mindestens etwa 20 Gew.-$.
13. 13. Nährmediiam nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich Maisquellwasserfeststoffe als Hauptstickst off quelle enthält.
14. 14. Nährmedium nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es mit bakterieller Ci-Amylase, insbesondere

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    durch von einem Mikroorganismus der Art Bacillus licheniformis , vorzugsweise einem Stamm aus der Gruppe Bacillus licheniformis NGIB 8O61, NCIB 8059, ATCC 6598, ATCC 6634, ATCC 8480, ATCC 9945a und ATCC 11 945, erzeugte il-Amylase verflüssigtes Maismehl enthält.
15. 15. Nährmedium nach Anspruch i4, dadurch gekennzeichnet, daß

    es durch Fermentieren einer wäßrigen Aufschlämmung des Maismehls mit der bakteriellend?t-Amylase bei einem pH-Wert von etwa 4,5 bis 7,5 und einer Temperatur von etwa 55 bis 80 C bis das Maismehl im wesentlichen verflüssigt ist und nachfolgendes Sterilisieren durch Erhitzen auf mindestens 110 C hergestellt worden ist.
16. 16. Verwendung von Grlucamylase nach Anspruch 1 und insbesondere nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 10 hergestellter Grlucamylase zum Hydrolysieren von Stärke, insbesondere mit Säure oder enzymatisch partiell hydrolysierter und dadurch löslich gemachter Stärke.

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