DE2554453A1

DE2554453A1 - Medikament zur glykaemieregulierung

Info

Publication number: DE2554453A1
Application number: DE19752554453
Authority: DE
Inventors: Henri Dr Laborit
Original assignee: EXPERIMENTALES ET CLINIQUES DE
Current assignee: EXPERIMENTALES ET CLINIQUES DE
Priority date: 1974-12-18
Filing date: 1975-12-04
Publication date: 1976-06-24
Also published as: US4035486A; FR2294712A1; FR2294712B1

Description

CENTRE D'ETUDES EZPERItIENTALSS ET CLINIQUES DS ΡΗΪ3Ι0-BIOLCGIE DE PHA3KAC0L0GIE ET I)'EÜTONOLOGIE C.E.P,B.E.P.E., 78 rue de la Convention, 75015 Paris, Frankreich

Iled i kam ent zur Glykämieregulierung

Die Erfindung "betrifft ein Medikament zur Glykämieregulierung.

Es ist bekannt, daß man seit den Arbeiten von SUTHERLAND et al. (1960) den Veränderungen der intrazellulären Konzentration des 3', 5'-Adenosin-monophosphates (zyklisches Ädenosin-monophoaphat oder cAIlP) beträchtliche Bedeutung beimißt. Diese Verbindung, die in den Zellen unter der Einwirkung zahlreicher Hormone, biologischer oder

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ORIGINAL INSPECTED

BOEHMERT & BOEHMERT

pharmakologischer Moleküle entsteht, scheint der "zweite Bote" für deren metallische Wirkung zu sein. Die Verbindung greift in das System der Phosphorylierung des Glykogens ein, indem sie die Bildung von Glukose-1-Phosphat ermöglicht, und beeinflußt die Aktivität der Gewebelipase.

In neuester Zeit hat man sich der Untersuchung eines verwandten Moleküls zugewandt, nämlich des 3'5'-Guanosin-monophosphates (zyklisches Guoanosin-monophosphat oder cGMP), bei des man Eigenschaften gefunden hat, die allgemein denjenigen von cAMP entgegenwirken. Bestimmte Ergebnisse legen den Schluß nahe, daß eine starke intrazelluläre Konzentration der einen Verbindung die Bildung, den Metabolismus oder die Wirkung der anderen verhindert (vergleiche hierzu "Nature", 1973, 246, Seiten 186-18?). Die Bildung des cGMP unter der Einwirkung einer Guanosinzyklase wird nun aber durch die cholinergischen Agentien (GEORGE, POLSOST et al. 1970) und Insulin im Hirn, im Herzen, dem Muskel und dem intestinalen Muskel von Säugetieren (LEE, EUO et al. 1972; ILLIANO, TELL et al. 1973) gefördert, ebenso wie die Bildung von cAMP durch Einwirkung von katecholaminergischen Agentien, wie ACTH und Glukagon, gefördert wird*

Die Zugabe von Adenosin steigert die Ansammlung von cAMP in Cerebral gewebe schnitten (SATTIN und RALL, 1970; J'ESRENDELLI, KINSCHER? und CHANG, 1973). Man hat angenommen, daß die Wirkung der Verabreichung von Guanosin in vivo an Tiere, wodurch ein überschußraaterial für die cGMP-Synthese geschaffen wird, darin bestehen

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BOEHMERT & EOEHMERi

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könnte, daß die intrazelluläre Bildung durch Wirkung der cholinergischen Stimulation oder von Insulin vergrößert wird. Die Rolle zentraler Neuromodulatoren, insbesondere katecholaminergischer und cholinergischer, "beherrscht die Verhaltensaktivität. OLDS und MILLNER (1954·), sowie MARGULES und STEIN (1969) haben die Bedeutung in der Zentralnervenfunktion von zwei Nervbündeln gezeigt: Im medialen Vorderhirnbündel (MFB) und im periventrikulären System (PVS). Das MFB soll das Nervenbündel für Bestätigung und Verstärkung sein; es ist katecholaminergisch. Das PVS soll für die Reaktion auf negative Stimulationen verantwortlich sein, also für die Abschreckung; es ist cholinergisch. Man kann annehmen, daß dann, wenn man die Bildung des zweiten chemischen 3oten vergrößert, nämlich des cGMP, man dadurch die Erregbarkeit des PVS und die Intensität der organischen Reaktion auf Aggressionen verstärken kann. Aus diesem Grunde sind die pharmakologisehen Eigenschaften des Guanosins untersucht worden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Medikament der eingangs genannten Gattung zu schaffen, bei dem die metabolischen Aktivitäten des Insulins und des Acetylcholins vergrößert werden:

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Medikament gelöst, welchss dadurch gekennzeichnet ist, daß es in Zusammensetzung Guanosin sowie eines der aus der aus Insulin und Acetylcholin gebildeten Gruppe bestehenden Agentien enthält.

Die durchgeführten Untersuchungen haben also zu dem

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Ergebnis geführt, daß die Zusamrnenfügung von Guanosin und von Acetylcholin (ACh) oder Insulin eine vergrößerte metabölisehe Aktivität der letztgenannten hervorruft.

In der Kombination von Guanosin mit Acetylcholin oder Insulin besteht also das charakteristische Merkmal des erfindungsgeniäßen Medikamentes.

Die experimentellen Untersuchungen haben sich auf drei unterschiedliche Gebiete erstreckt.

1. Eine Untersuchung an Gehirnschnitten von Ratten, die mit KCl stimuliert worden waren, wobei Änderungen im Sauerstoffverbrauch, in der Produktion von Milchsäure und im Verbrauch von Glukose durch die konventionelle Technik von WARBURG geprüft wurden, woraufhin die Schnitte der Einwirkung von Guanosin, ACh, Insulin oder von ACh und Insulin in Kombination mit Guanosin unterworfen wurden.

2. Die Untersuchung des Glykogengehaltes im Hirn von Mäusen unter Einwirkung von Guanoain, Insulin oder von den beiden kombinierten Agentien.

3. Untersuchungen der Änderungen der Glykämie bei Kaninchen nach Injektion von Insulin oder aber von Insulin

in Kombination mit Guanosin.

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BOEHMERT & BOE"ME*?T

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I. Einwirkung von Guanosin in vitro, allein oder zusammen mit Acetylcholin oder Insulin, auf den Säuerst off verbrauch, die Ansammlung von Milchsäure und den Glukoseverbrauch von Schnitten des zerebralen Cortex von Ratten, die durch KGl stimuliert wurden

Methoden:

Die verwendeten Tiere waren männliche Hatten der Gattung Wistar Vag mit einem mittleren Gewicht von 225/250 g, den Standardbedingungen der Laborhaltung unterworfen.

Die Gewebeschnitte, die zwischen 15 und 20 mg wogen, wurden am Zerebralcortex der Ratte ausgeführt und eine Stunde bei 37°ΰ in einer Phiole inkubiert, die einen Krebs-Ringer-Phosphatpuffer enthielt, dessen Konzentration an KCl 10 p.100 betrug. Ein i5-/iaolarss Glukosesubstrat wurde verwendet. Das Guanosin wurde in die Phiole mit einer Konzentration von 1,66 χ 10 Il gleichzeitig mit der Glukose und dem Puffer eingegeben,

—1D —4.

während 2,7 χ 10 M Acetylcholin sowie 66 χ 10 u/Liter

Insulin (Endopankrin) in die seitliche Kammer eingebracht und mit dem Gewebeschnitt zum Zeitpunkt 0 in Kontakt gebracht wurden. Das Gesamtvolumen der Mischung beträgt 3 ml.

Der Sauerstoffverbrauch wird nach der herkömmlichen Warburg-Methode nach einer Stunde Inkubation bei 37°C gemessen. Er wird in ,uliol Sauerstoff pro Stunde und pro Gramm Gewebe ausgedrückt.

Die Milchsäure und die Glukose werden im entproteinisierten

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BOEHiMERT & BOEHMERT

• fr.

Inkubationsmilieu nach einer enzymatisehen Methode bestimmt. Die Hesultate werden ausgedrückt in /uMol/h/g des Gewebes.

Ergebnis;

-A Das Guanosin allein, in einer Konzentration von 1,66 χ 10 hat keinen Einfluß auf den Sauerstoffverbrauch, auf die Ansammlung von Milchsäure und auf den Glukoseverbrauch in den Zerebralcortexschnitten der Ratte; die Resultate sind nicht signifikant verschieden von denen der Vergleichsversuche. Das Acetylcholin allein, mit einer

-10

Konzentration von 2,7 x 10 M, steigert den Säuerst off verbrauch, wobei die Steigerung durch die Assoziierung (Guanosin + Acetylcholin) akzentuiert wird, wenn diese von 25 p.. 1.00 auf 35 p.100 geht. Die. Vergrößerung des GlukoseVerbrauchs infolge des Acetylcholins allein wird durch das Hinzufügen des Guanosins nicht modifiziert.

-A-

Die Zusammensetzung Guanosin-Insulin mit 65 χ 10 u/Liter kann den Sauerstoffverbrauch nicht signifikant steigern. Im Gegensatz hierzu geht der unter der Einwirkung des Insulins (50 p.100) schon beträchtliche Glukoseverbrauch auf 82 p.100 hoch, wenn Insulin-Guanosin in Assoziation verwendet wird.

Die erhaltenen Resultate ergeben sich aus Tabelle A, die nachfolgend noch wiedergegeben wird.

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II. Zerebrale Glykogenwerte (bei Mäusen) nach. Injizierung von an Guanosin assoziiertem Insulin

Material und Methoden:

Die verwendeten Tiere sind männliche Mäuse mit einem mittleren Gewicht von 20 bis 25 g.

Die Untersuchung wurde an fünf Gruppen von Tieren durchgeführt, die wie folgt erhalten wurden:

Erste Gruppe: Intraperitoneale Injektion einer isotonischen Salzlösung.

Zweite Gruppe: Intraperitoneale Injektion des Guanosins mit einer Dosis von 100 mg/kg.

Dritte Gruppe: Intraperitoneale Injektion des Guanosins mit einer Dosis von 200 mg/kg.

Vierte Gruppe: Subkutane Injektion von Insulin mit einer Dosis von 0,5 uI/20 g der Mäuse.

Bei diesen vier Gruppen wurde die Injektion 30 min. vor der Tötung durchgeführt.

Fünfte Gruppe: Guanosin wurde intraperitoneal mit einer Dosis von 200 mg/kg 3O min. vor der subkutanen Injektion des Insulins in einer Dosis von 0,5 uI/20 g Mäusegewicht injiziert.

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Die Tötung des Tieres erfolgte 30 min. nach der zweiten Injektion durch vollständiges Eintauchen in flüssigen Stickstoff. Die Gehirne werden entnommen, während sie sich noch im tiefen Gel zustand "befinden.

Das isolierte Glykogen wird durch das Enzym Amylo-^-i,4 1,6-Glukosidase hydrolysiert, welches die Glukose durch Hydrolyse aus den Bindungen(/.-(1 -> 6) undc^-O -> 4-) frei setzt.

Die Glukose wird sodann in einem einzigen Schritt in 6-Phosphorglukonat durch die Enzyme Hexokinase und Glukose-6-Phosphat-deshydrogenase umgewandelt.

Die Bildung von NADPH wird sodann fluorometrisch gemessen (NAHORSKI und ROGERS, 1972).

Ergebnisse:

Bei den mit Guanosin behandelten Tieren, sowohl bei der Dosis von 100 mg/kg als auch bei der Dosis von 200 mg/kg, zeigen die Glykogengehalte keine signifikanten Unterschiede gegenüber den Tieren der ■Vergleichsuntersuchungen. Im Gegensatz hierzu ist der Glykogengehalt bei den insulinbehandelten Tieren stark gesteigert im Vergleich zu den Versuchstieren. Die Steigerung ist noch lvesentlich deutlicher, wenn in Assoziation Insulin und Guanosin verwendet werden.

Die erhaltenen Resultate ergeben sich aus der nachfolgend noch wiedergegebenen Tabelle B.

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BOEHMERT & EOEHMERT

III. Wirkung des Guanosins auf die Glykämie

Material und Methode:

Die verwendeten Tiere waren männliche Kaninchen mit einem mittleren Gewicht von 2,200 kg bis 2,500 kg.

Die Untersuchung erfolgte an vier Gruppen von Tieren, die durch intravenöse .Injizierung der nachfolgenden Präparate in einem Volumen von 10 ml erhalten wurden:

Erste Gruppe: Isotonische Kochsalzlösung.

Zweite Gruppe: Guanosin in einer Dosis von 100 mg/kg Kaninchengewicht.

Dritte Gruppe: Insulin mit 0,5 u.i./kg Kaninchengewicht.

Vierte Gruppe: Guanosin in einer Menge von 100 mg/kg Kaninchengewicht und Insulin in einer Menge von 0,5 u.i,/ kg Kaninchengewicht.

In die Femoralarterie wird ein Katheter eingeführt, wobei das distale Ende des Katheters in das Fell im Schwanzbereich einmündet, so daß Blut abgenommen werden kann, ohne das Kaninchen aufzuregen.

Die Substanzen wurden durch eine Ohrvene injiziert. Das Guanosin wurde in einer isotonischen Kochsalzlösung aufgelöst, der UaOH von 1,5 ρ.100 zugefügt wurde, bis das Guanoain aufgelöst war. Der pH-Wert der Lösung betrug

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BOEHMERT & BOEIiMERT

am Schluß 9-

Nach dem Eingriff konnten die Kaninchen sich ^O min. erholen.

Es wurden sechs Blutentnahmen von arteriellem Blut vorgenommen , und zwar zu den Zeiten t = O min., t = 15 min. t = 30 min., t = 60 min., t = 120 min. und t = 240 min.

Die Glykämien wurden nach einer enzymatischen Methode (BOEHRINGER) gemessen.

Ergebnisse:

Die Figuren I und II zeigen, daß die Kombination des Guanosins mit Insulin in signifikanter Form den GIykämieabfall steigert, verglichen mit demjenigen, der sich bei derselben Dosis von Insulin allein ergibt. Während außerdem im letztgenannten Fall (I) die Glykämle rasch auf ihren Ausgangswert zurückkehrt, steigt der Glykäraiewert bei kombinierter Injektion von Insulin und Guanosin bis zur 240. Minute nicht an. Venn man den Anstieg auf die Bildung von cGMP unter Einwirkung der Kombination von Insulin und Glukose zurückführt, so scheint der Anstieg mit den homöostatischen Regelprozessen der Glykämie zu interferieren.

Die zusammengestellten Ergebnisse zeigen, daß die metabolische Aktivität vonACh und von Insulin durch ihre Kombination mit Guanosin verstärkt wird. Dies läßt sich am Rattenhirn in vitro durch Messung des SauerstoffVerbrauches und des GlukoseVerbrauches messen,

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BOEHMERT & BOEHMERT

in vivo hingegen für das Insulin bei Mäusen durch die Glykogenerzeugung. Beim Kaninchen wird die Wirkung des Insulins auf die Glykämie in gleicher Weise intensiviert und verlängert. Wenn man annimmt, daß das zyklische Guanosinmonophosphat der "zweite Bote" der Aktivität dieser "beiden Hormone ist, so läßt sich denken, daß die zelluläre Bildung, mit Guanosin, eines Synthese-Vorstufenmaterials die Gewebewirkung von AGh und Insulin verstärken kann.

Eine derartige Interpretation der Ergebnisse führt zu der Erwägung, das Guanosin in Kombination mit cholinomimetischen Mitteln oder mit Insulin nicht nur zur Potentierung derhypoglykämierenden Wirkung zu verwenden, sondern auch in anderen Bereichen. STROM, BSAR und CARPENTER haben gezeigt, daß physiologische Konzentrationen von Insulin die Fähigkeit cytotoxischer Lymphozyte steigern, Scheibenzellen zu zerstören, wie cGMP und die cholinomimetischen Mittel. Es ist also möglich, die Verv/endung der Kombination von Guanosin mit Insulin zum Hervorrufen einer Potenzierung der Imniunabwehr in Erwägung zu ziehen. WOLBERG, ZIMMERMANN et al. haben umgekehrt festgestellt, daß die in vitro erfolgende Zerstörung von Tumorzellen durch die Lymphozyten von Mäusen, die spezifisch sensibilisiert worden waren, durch Adenosin inhibiert wird, welches die intrazelluläre Konzentration von cAMP anhebt. Die Antitumorwirkung der Assoziation Guanosin-Insulin verdient in diesem Zusammenhang beachtet zu werden. In der Kardiologie, schließlich auch bei der kardiovaskulären Wiederbelebung, hat man die Verwendung der repolarisierenden Assoziation Insulin + Glukose +

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BOEHMERT ■& BOEHMERT

Kalxumsalz (LABORIT, 1953) vorgeschlagen. Die Hinzufügung von Guanosin sollte die Wirksamkeit noch steigern.

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TABELLE A

co co

CD

O O O

	Vergleichs tiere	Guanosin 1,66x10~^M	AGh 2,7x10-¹OM	AcH ^_n 2,7x10"* ^IUM Guanosin 1,66x10 ¹^M	Insulin 66x10-^" u/1	Insulin 56x10~4"u/1. Guanosin 1,66x1O⁺M
Sauerstoffverbrauch in hol/h/g von Frischgewebe	102,8 +6,6	93,0 +6,0	134,2 +7,2	162,1+13,9	91,6+5,3	125,6+ 7,5
Milchsäur eansainm- lung in Mol/h/g von Frischgewebe	85,2 +4,5	88,2 +5,4	98,8 +3,7	102,2+ 5,8	84,6+5,0	91,8+ 4,5
Glukoseverbrauch in Mol/h/g von Frischgewebe	88,4 +8,6	99,3 ±9,1	**tr J , / +I JyJ**	138,0+10,6	168,5+17,0	194,9+17,5

9?

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Wirkung in vitro von Guanosin allein, oder in Zusammensetzung mit Acetylcholin oder Insulin, auf den Sauerstoffverbrauch, die Milchsäureansamiulung und den Glukoseverbrauch in Gehirnschnitten von Ratten, dis durch KCl stimuliert worden waren.

ro cn cn

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TABELLE B

Vergleichs tiere unter Verwendung isotonischer Kochsalzlö sung	Guanosin 100 rag/kg	Guanosin 200 mg/kg	Insulin 0,5 uI/20g Mäusegewicht	Insulin 0,5 ul/20g Mäusegewicht + Guanosin 200 mg/kg
144 + 5 (10)	151 + 7 (9)	159 -r 8 (10)	182 + 10 (10)	213 + 13 (10)

In Klammern: Anzahl der Tiere.

Die Glykogenwerte sind ausgedrückt in /ug-Glukoseäquivalenten/g von

geliertem Gewebe.

ra O

Die Wirkung des Guanosins, des Insulins, und des mit Guanosin assoziierten Insulins auf das Glykogen von Mäusehirnen.

Vergleich: Vergleich: Insulin:

Insulin

Insulin Guanosin

0,01 >P > 0,001 P < 0,001

0,1 > P y 0,05

cn cn

cn CO

Claims

& BOEHMERT

ANSPEl)CHE

CQ Medikament zur Glykamieregulierung, dadurch gekennzeichnet, daß es in Zusammensetzung Guanosin sowie eines der aus der aus Insulin und Acetylcholin gebildeten Gruppe, bestehenden Agentien enthält.
2. Medikament nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen pharmazeutisch geeigneten Träger.

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