DE2544843A1

DE2544843A1 - 3-carbonsaeuren und 4-desacetyl-3- carbonsaeuren sowie ester von vinblastin, vincristin und leurosidin

Info

Publication number: DE2544843A1
Application number: DE19752544843
Authority: DE
Inventors: George Joseph Cullinan
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1974-10-16
Filing date: 1975-10-07
Publication date: 1976-04-29
Also published as: US4012390A; ZA756424B; BE834364A; AU8556275A; IE42132B1; FR2287905A1; GB1521053A; HU174569B; IE42132L; CH618983A5; DK464275A; DD122538A5; IL48257A; SE7511570L; JPS5186500A; ES441860A1; FR2287905B1; AR208330A1; CA1061785A; NL7512120A

Description

PFENNING - MAAS - SEiLER HiNICi - LSiViKH - SPOTT SCCO ftfONCi-Ii=N 40 HaivteRSTR. 299

X-4180

Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, V.St.A.

3-Carbonsäuren und 4-Desacetvl-3~carbonsäuren sowie Ester von Vinblastin, Vincristin und Leurosidin

Gegenstand der Erfindung sind 3-Carbonsäuren und 4-Desacetyl-3-carbonsäuren sowie Ester von Vinblastin, Vincristin und Leurosidin und Verfahren zu deren Herstellung.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben die Formel I

ι ι r ι

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C-O-R"

R für CH₃, CH=O oder Wasserstoff steht,

R' Wasserstoff oder Acetyl bedeutet,

R¹¹ Wasserstoff, C₂-C₅-Alkyl, Mono- oder Dihydroxy-(C₀-Cj.) alkyl, Monohalogen(C₀-C₁.) alkyl, Mono-(C₀-C .)-alkanoyloxy(C₃-C₅)alkyl, Crotyl, Methallyl, Allyl, Propargyl oder 2-Butin-1-ol ist,

einer der Substituenten

R¹' ' oder

R¹'¹¹ Hydroxy und der andere Äthyl bedeutet,

mit der Maßgabe, daß lediglich einer der Substituenten R¹ oder R¹' für Wasserstoff steht, wenn R Methyl ist,

oder sind Säureadditionssalze mit nichttoxischen Säuren, und diese Verbindungen können dadurch hergestellt werden, daß man Vinblastin, Vincristin oder Leurosidin oder ein Gemisch aus 4-Desacetylvincristln und 1-Desformyl-4~desacetylvincristin mit verdünnter Base zu 4-Desacetylvinblastincarbonsäure, 1-Desformyl-4-desacetylvincristincarbonsäure oder 4-Desacetylleurosidincarbonsäure umsetzt, und, falls der Substituent R¹ beim gewünschten Produkt Acetyl sein soll, die dabei erhaltenen Säuren in Gegenwart von Pyridin acetyliert, und die Stellung 1 der Vincristincarbonsäure gegebenenfalls vor oder nach der Acetylierung formyliert, und die auf diese Weise erhaltenen Säuren gegebenenfalls verestert oder die erhaltenen Säuren oder Ester gewünschtenfalls mit einer zur Bildung eines pharmazeutisch unbedenklichen Säureadditionssalzes geeigneten Säure umsetzt.

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Es zeigte sich, daß mehrere in der Natur vorkommende Alkaloide, die aus Vinca rosea erhältlich sind, Wirkstoffe zur Behandlung experimenteller Malignitäten bei Tieren sind. Zu solchen Alkaloide^ gehören Leurosin (US-PS 3 370 057), Vincaleukoblastin (Vinblastin) (US-PS 3 097 137) Leurosidin (Vinrosidin) und Leurocristin (Vincristin) (US-PS 3 205 220). Zwei dieser Alkaloide, nämlich Vinblastin und Leurocristin, befinden sich als Heilmittel zur Behandlung von Malignitaten, insbesondere Leukämien und damit verwandten Krankheiten beim Menschen, auf dem Markt. Von diesen Handelsprodukten ist Leurocristin eines der wirksamsten und besten Mittel zur Behandlung von Leukämien, diese Verbindung stellt jedoch gleichzeitig auch diejenige dar, die bei den antineoplastischen Alkaloiden von Vinca rosea die Seltenste ist.

Chemische Modifikationen der Vincaalkaloide sind nur begrenzt möglich. Als erstes ist hierzu zu bemerken, daß die vorliegenden Molekülstrukturen äußerst komplexer Art sind und sich chemische Reaktionen, die eine spezifische Funktion des Moleküls beeinflussen, nur schwer entwickeln lassen. Ferner wird darauf hingewiesen, daß aus Vinca rosea-Fraktionen auch bereits Alkaloide gewonnen wurden, denen die gewünschten chemotherapeutischen Eigenschaften fehlen, und eine Strukturbestimmung dieser Alkaloide den Schluß erbrachte, daß diese Verbindungen mit den aktiven Alkaloiden eng verwandt sind. Die antineoplastische Wirksamkeit scheint daher auf sehr spezielle Strukturen beschränkt zu sein, so daß die Chance des Erhalts wirksamerer Heilmittel durch Modifikation dieser Strukturen entsprechend gering sein dürfte. Eine erfolgreiche Modifikation der physiologisch wirkamen Alkaloide war die Herstellung von Dihydrovinblastin (US-PS 3 352 868) und der Ersatz der Acetylgruppe in Stellung C-4 (bezüglich der Bezifferung der einzelnen Kohlenstoffatome und somit auch des Kohlenstoffatoms Nr. 4 des Vinblastinringsystems wird auf die eingangs erwähnte Formel I verwiesen) durch

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höhere Alkanoylgruppen oder durch damit nicht verwandte Acylgruppen (US-PS 3 392 173). Einige dieser Derivate verlängern auch das Leben von Mäusen, die man mit P1534-Leukämie inokuliert hat. Eines der Derivate von Vinblastin, bei dem die in Stellung 4 befindliche Acetylgruppe durch eine Chloracetylgruppe ersetzt ist, eignet sich ferner als Zwischenprodukt zur Herstellung strukturell modifizierter Vinblastinverbindungen, bei denen die in Stellung 4 befindliche Acetylgruppe von Vinblastin durch eine N,N-Dialkylglycylgruppe ersetzt ist (US-PS 3 387 001) . Während der chemischen Reaktionen zu den letztgenannten Derivaten entstand als Zwischenprodukt auch 4-Desacetylvinblastin. Dieses Zwischenprodukt, das anstelle der in Stellung 4 befindlichen Acylgruppe eine nichtveresterte Hydroxygruppe aufweist, wurde in Lloydia 27, 340 (1964) als toxisches Material bezeichnet, das bei der mit P1534-Leukämie infizierten Maus in vivo nur gering chemotherapeutisch wirksam ist. In dieser Veröffentlichung wird auch Desacetylvinblastincarbonsäure beschrieben, nämlich ein Vinblastin, dessen in Stellung 3 befindliche Methylestergruppe durch eine Carboxylgruppe ersetzt ist und das in Stellung 4 anstelle der Acetoxygruppe eine Hydroxygruppe aufweist.

In Tetrahedron Letters 1968, 783-787 ist die Bildung von Deoxyvinblastin, das in Stellung 4¹ keine Hydroxygruppe enthält, und Derivaten hiervon, die am Kohlenstoffatom 18' keine Carbomethoxygruppe enthalten, beschrieben.

Neue C-3-Amide von Vinblastin wurden von Sweeney, Cullinan, Poore und Gerzon am 65th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research in Houston, Texas, 27. bis 30. März 1974 (Proceedings, Abstract 146) beschrieben.

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Als Äusgangsmaterialien für das vorliegende Verfahren werden ' Vinblastin, Leurosidin oder Vincristin verwendet. Unter Bezugnahme auf die oben erwähnte Formel I ist Vinblastin diejenige Verbindung, bei der das Kohlenstoffatom 1 durch Methyl substituiert ist, sich am Kohlenstoffatom 3 als Substituent Methylcarboxylat befindet, am Kohlenstoffatom eine Acetoxygruppe vorhanden ist, der am Kohlenstoffatom befindliche Substituent in Stellung R¹" für Hydroxyl steht und der andere Substituent in dieser Stellung Äthyl bedeutet .

Leurosidin und Vinblastin sind Stereoisomere, die sich lediglich in der Orientierung der am Kohlenstoffatom 4' befindlichen Äthyl- und Hydroxygruppen unterscheiden.

Das Vincristin unterscheidet sich vom Vinblastin lediglich durch den am Kohlenstoffatom C-1 befindlichen Substituenten, wo beim Vincristin dieser am Kohlenstoffatom 1 enthaltene Substituent Formyl ist.

Die neue Verbindung Vinblastincarbonsäure ist eine Verbindung der Formel I, bei der R für Methyl steht, R¹ Acetyl bedeutet, R" Wasserstoff,darstellt, R^lfl für Hydroxy steht und R¹'^f· Äthyl ist.

Leurosidincarbonsäure ist eine Verbindung der Formel I, bei der R Methyl bedeutet, R¹ Acetyl ist, R" für Wasserstoff steht, R"¹ Äthyl bedeutet und R¹¹¹¹ Hydroxy darstellt.

Vincristincarbonsäure ist eine Verbindung der Formel I, bei der R für Formyl steht, R¹ Acetyl bedeutet, R¹¹ Wasserstoff darstellt, R"¹ Hydroxy ist und R¹¹" Äthyl darstellt.

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_ CL «.

Die Ester, bei denen R¹ · für (C₂-C₅)Alkyl, Mono- oder Dihydroxy (C₂-C₅) alkyl, Monohalogen(C₂-C₅) alkyl, Mono-(C₂-C₄)alkanoyloxy(C₃-C₅) alkyl, Crotyl, Methallyl, Allyl, Propargyl oder 2-Butin-1-ol steht und einer der Substituenten R¹" oder R"" Hydroxy bedeutet und der andere Äthyl ist, können als 3-Desmethyl-3-äthyl-/pder -3-propyl-, -3-(2-chlorbutyl) oder -3-(2-hydroxypentyl)_/-vinblastin oder -leurosidin oder -vincristin oder 4-Desacetylvlnblastin bezeichnet werden, sie werden vorzugsweise jedoch als Äthylvinblastinoat oder Propylvincristinoat oder Butyl-4-desacetylvinblastinoat oder Äthyl-4-desacetylleurosidinoat bezeichnet.

Falls der Substituent R" bei obiger Formel I für (C₂-C₅)Alkyl steht, dann kann es sich dabei um Äthyl, n-Propyl, Isopropyl, η-Butyl, Isobutyl, sec.-Butyl, 1-Pentyl, Isopentyl, 2-Pentyl, 3-Pentyl, 3-Methyl-2-butyl oder Neopentyl handeln. Unter mono- oder dihydroxysubstituiertem (C₃-C₅)Alkyl, das der Substituent R¹¹ ebenfalls bedeuten kann, werden beispielsweise 2-Hydroxyäthyl, 2,3-Dihydroxypropyl, 2-Hydroxy-2-methylathy1, 2-Hydroxy-1-methyläthy1, 2-Hydroxy-2,2-dimethylathy1, 2-Hydroxy-1,1-dimethylathy1, 2-Hydroxybutyl, 3-Hydroxypropyl, 4-Hydroxybutyl, 5-Hydroxypentyl oder 2,3-Dihydroxy-2-methylpropyl verstanden. Die Angabe Halogen(C₃-C₅)alkyl beim Substituenten R¹' bedeutet beispielsweise 2-Chloräthyl, 2-Bromäthyl, 2-Chlorpropyl, 2-Brombutyl, 3-Chlorpropyl, 2-Chlorpentyl, 2-Brom-3-methylbutyl oder 4-Brombutyl. Mono(C₃-C₄)alkanoy10Xy(C₂-C₅)-alkyl beim Substituenten R^1r bezieht sich beispielsweise auf 2-Acetoxy-1-äthyl, 2-Propionoxy-1-propyl, 3-Acetoxy-ipropyl, 2-Isobutyloxy-2-butyl, 2~Acetoxy-2-pentyl, 2-Butyloxy-1-pentyl, 2-Propionoxy-3-methyl-1-propyl, Isobutyloxy-2-butyl, 2-Acetoxy-2-pentyl, 2-Butyloxy-1-pentyl oder 2-Propionoxy-3-methy1-1-penty1.

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Zur Herstellung pharmazeutisch unbedenklicher Säureadditionssalze der Aminbasen aus der oben angegebenen Formel I geeignete nichttoxische Säuren sind beispielsweise anorganische Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Bromwasserstoffsäure, Jodwasserstoffsäure, salpetrige Säure oder phosphorige Säure, oder auch entsprechende organische Säuren unter Einschluß aliphatischer Mono- und Dicarboxylate, phenylsubstituierter Alkanoate, Hydroxyalkanoate und Hydroxyalkandioate, aromatischer Säuren, aliphatischer Sulfonsäuren oder aromatischer Sulfonsäuren. Pharmazeutisch unbedenkliche Salze dieser Art sind beispielsweise die Sulfate, Pyrosulfate, Bisulfate, Sulfite, Bisulfite, Nitrate, Phosphate, Monohydrogenphosphate, Dihydrogenphosphate, Metaphosphate, Pyrophosphate, Chloride, Bromide, Jodide, Acetate, Propionate, Decanoate, Caprylate, Acrylate, Formiate, Isobutyrate, Caprate, Heptoanate, Propiolate, Oxalate, Malonate, Succinate, Suberate, Sebacate, Fumarate, Maleate, Butin-1,4-dioate, Hexin-1,6-dioate, Benzoate, Chlorbenzoate, Methylbenzoate, Dinitrobenzoate, Hydroxybenzoate, Methoxybenzoate, Phthalate, Terephthalate, Benzolsulf onate, Toluolsulfonate, Chlorbenzolsulfonate, Xylolsulfonate, Phenylacetäte, Phenylpropionate, Phenylbutyrate, Citrate, Lactate, 2-Hydroxybutyrate, Glycollate, Malate, Tartrate, Methansulfonate, Propansulfonate, Naphthalin-1-sulfonate oder Naphthalin-2-sulfonate.

Die neuen Verbindungen lassen sich nach folgenden allgemeinen Verfahren herstellen. Vinblastin, Leurosidin oder Vincristin werden mit verdünnter Base behandelt, wodurch die in Stellung 3 befindliche Estergruppe unter Bildung einer Carbonsäuregruppe in Form eines Basensalzes hydrolytisch abgespalten wird und gleichzeitig die in Stellung befindliche Estergruppe unter Bildung einer Hydroxygruppe hydrolysiert wird. Im Falle von Vincristin wird auch die in Stellung 1 befindliche Formylgruppe hydrolysiert. Als Hydrolyseprodukte erhält man somit 4-Desacetylvinblastincarbonsäure, 4-Desacetylleurosidincarbonsäure oder

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i-Desformyl-4-desacetylvincristincarbonsäuren. Durch Acetylierung in Pyridin wird in Stellung 4 wiederum die Acetylgruppe eingeführt, wodurch man Vinblastincarbonsäure, Leurosidincarbonsäure oder 1-Desformylvincristincarbonsäure erhält. Die letztgenannte Verbindung läßt sich mit 97-prozentiger Ameisensäure und Essigsäureanhydrid unter Bildung von Vincristincarbonsäure formylieren. In umgekehrter Weise kann man i-Desformyl-4-desacetylvincristincarbonsäure auch vor einer Acetylierung formylieren, wodurch man als Zwischenprodukt 4-Desacetylvincristincarbonsäure erhält. Die Bildung der höheren Ester der oben angegebenen Säuren, beispielsweise der Äthyl-, Butyl-, 2-Chloräthyl-, 2-Acetoxypropyl- oder Hydroxyäthylester_t erfolgt durch Behandlung der freien Säure mit einer Lösung des gewünschten Alkohols in Gegenwart eines sauren Katalysators. Die Ester von Vincristincarbonsäure, Laurosidincarbonsäure und Vinblastincarbonsäure und ihre 4-Desacetylanalogen werden alle praktisch in derselben Weise hergestellt. Die Mono(C₃-C₄)alkanoyloxy(C₂-C₅)alky!ester werden im allgemeinen hergestellt durch Verestern des entsprechenden Monohydroxy(C₂-C₅)alkylesters mit einem üblichen Acy Ii er mittel, wie einem Säureanhydrid, einem gemischten Anhydrid oder einem Acylchlorid, in Gegenwart einer organischen Base. Die Ester werden im allgemeinen in Form ihrer Sulfatsalze isoliert, die man durch Ansäuern einer Lösung der Base auf einen pH-Wert im Bereich von 2 bis 4 mit verdünnter Schwefelsäure und anschließendeis Verdampfen der flüchtigen Bestandteile herstellt, wodurch man das Sulfat als Rückstand erhält. Die Sulfatsalze sind im allgemeinen amorph, und die Verbindungen werden durch ihr NMR-Spektrum sowie durch ihr Molekularionenspektrum identifiziert, die man anhand der freien Base ermittelt.

Die Herstellung von 4-Desacetylvinciristincarbonsäure und von 1-Desformyl-4-desacetylvincristincarbonsäure erfolgt nach einem anderen Verfahren. Nach diesem Verfahren wird

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das nach Lloydia 27, 340 (1964) hergestellte 4-Desacetylvinblastin mit Chromsäure in Essigsäureanhydrid bei niedrigen Temperaturen nach dem in ZA-PS 72/8535 beschriebenen Verfahren oxydiert, wodurch man ein Gemisch aus 4-Desacetylvincristin und i-Desformyl-4-desacetylvincristin erhält. Diese Umsetzung verläuft überraschenderweise ohne gleichzeitige Oxydierung der in Stellung 4 befindlichen Hydroxygruppe in das entsprechende Keton. Durch Behandeln dieses Gemisches mit verdünnter Base erhält man die gewünschte 1-Desformy1-4-desacetylvincristincarbonsäure.

Diejenigen erfindungsgemäßen Verbindungen, bei denen die Substitüenten R und R'* eine andere Bedeutung als Wasserstoff besitzen, lassen sich möglicherweise als antitumorale Mittel verwenden. Diese Wirkung äußert sich darin, daß Verbindungen obiger Art Zellkulturen aus der mitotischen Phase (Metaphase) des Zellzyklus in ihrer Entwicklung hemmen können, ohne daß dabei anscheinend andere Stufen des Zellzyklus beeinflußt werden. Die meisten bekannten Indoldihydroindolalkaloide (dimeren Alkaloide) aus Vinca rosea mit anti-

tumoraler Wirkung blockieren die Metaphase, und zwar unter Einschluß von Vinblastin „(Vincaleukoblastin), Vincristin und Leurosidin. Monomere Vincaalkaloide besitzen keine metaphaseblockierende Wirkung und sind auch keine Antimitotica. Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben sich ferner auch bei transplantierten Tumoren bei Mäusen als wirksam erwiesen. Von besonderem Interesse ist die hohe Wirksamkeit des Sthyl-4-desacetylvincristinoat-sulfats gegenüber osteogenem Rideway-Sarcom, wenn man diese Verbindung 10 Tage nach Inoculation des Tumors einer Maus intraperitoneal in einer Dosis von 0,15 bis 0,5 mg/kg Körpergewicht verabfolgt. Ähnliche Ergebnisse erhält man auch gegenüber dem Gardner-Lymphosarcom. Die obige Verbindung

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hat sich ferner in einer Dosis von 0,5 rag/kg gegenüber dem C₃H-Mammatumor .als wirksam erwiesen. Ferner ist Äthylvinblastinoat-sulfat auch beim Gardner-Lymphosarcomtumorsystem wirksam. Die unter Verwendung von Äthyl-4-desacetylvincristinoat-sulfat erhaltenen Versuchsergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengefaßt. In dieser Tabelle ist in Spalte 1 der Name der jeweiligen Verbindung angegeben. Aus Spalte 2 geht der transplantierte Tumor hervor, in Spalte 3 sind Dosis oder Dosierungsbereich und Anzahl der Tage, über die die jeweilige Dosis verabreicht wurde, angeführt, und aus Spalte 4 geht die prozentuale Inhibierung des Tumorwachstums hervor. (ROS ist dabei eine Abkürzung für Ridgeway-Qsteogensarcom, GLS stellt eine Abkürzung für Gardner-Lymphosarcom dar und mit C₃H ist ein Mammatumor angegeben). Höhere Dosierungsmengen als die in dieser Tabelle angeführten Mengen führten normalerweise zu einer Toxizität.

Tabelle I

	Tumor	Dosis	Tage	Prozentuale
Verbindung	GLS	mg/kg χ	χ 8	Inhibierung
Äthyl-		0,2	χ 8	. 85
4-desacetylvin-		0,25	x 8	87
cristinoat-		0,3	χ 8	100
sulfat		0,4	x 8	100
	ROS	0,5	χ 10	100
		0,15	χ 10	58
		0,2	χ 10	65
		0,25	χ 10	100
		0,3	χ 10	84
		0,4	χ 10	100
	C₃H	0,5	χ 9	100
	GLS	0,5	χ 8	43
2-Hydroxyäthyl-		0,5	χ 8	100
4-desacetyl-		1,0		91
vinblastinoat-
sulfat

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Außer ihrer antituraoralen Wirksamkeit sind die Verbindungen der oben angegebenen Formel I mit Ausnahme der Alkyl- und Hydroxyalkylester von Vincristincarbonsäure und von Vinblastincarbonsäure auch wertvolle Zwischenprodukte. So lassen sich beispielsweise die 4-Desacety!verbindungen durch Acetylieren in die ursprünglichen Vinblastinoat- oder Vincristinoatester überführen. Verbindungen der obigen Formel I, bei denen der Substituent R Wasserstoff ist oder bei denen der Substituent R¹' Wasserstoff bedeutet, sind im allgemeinen beim Versuch der Mitosehemmung nicht wirksam und hemmen in ähnlicher Weise auch das Wachsen transplatierter Tumore bei Mäusen nicht. Diese Verbindungen stellen jedoch Zwischenprodukte dar, da sich Verbindungen, bei denen der Substituent R¹¹ für Wasserstoff steht und somit die Vinblastincarbonsäure, die Leurosidincarbonsäure und die Vincristincarbonsäure, durch Verestern in wirksame Verbindungen überführen lassen. In ähnlicher Weise können diejenigen Verbindungen, bei denen der Substituent R Wasserstoff bedeutet, nänlich die 1-Desformylvincristinderivate, zu Vincristincarbonsäure, nämlich einem anderen wertvollen Zwischenprodukt, oder zu Desacetylvincristinoatestern und Vincristinoatestern formyliert werden.

Neben ihrer oben angegebenen Wirkung als antimitotische Mittel sind die freien Säuren unter Einschluß des Desacetylsäuren auch wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung von radioaktiv markiertem Material, da sie sich nach der oben beschriebenen Arbeitsweise mit radioaktivem Methylalkohol wieder verestern lassen. Die Desmethyldesacetylvinblastincarbonsäure kann am in Stellung 1 befindlichen Stickstoffatom ferner auch mit einer radioaktiv markierten Methyloder Formylgruppe methyliert oder formyliert werden, und man kann zur Veresterung der Carbonsäuregruppe oder umgekehrt auch mit Isotopen markiertes Methanol verwenden, wodurch sich doppelt markiertes Vincristin, Leurosidin oder Vinblastin herstellen lassen.

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Beispieli 4-Desacetylvinblastincarbonsäure

10 g Vinblastinsulfat werden durch Behandeln mit Alkali, anschließende Extraktion der Base in Methylendichlorid sowie Trocknen und Verdampfen des MethylendiChlorids in die entsprechende freie Base überführt. Das zurückbleibende Vinblastin wird in einem mit Rückflußkühler versehenen 2 Liter Kolben in 200 ml wasserfreiem Äthanol gelöst. Die Äthanollösung wird erhitzt, während man über einen Tropftrichter 956 ml 1 η wässriges Natriumhydroxid zusammen mit weiteren 50 ml wasserfreiem Äthanol zugibt. Das zusätzliche Äthanol ist zur Homogenhaltung des Reaktionsgemisches erforderlich. Das Reaktionsgemisch wird nach beendeter Zugabe des Natriumhydroxids O,5 Stunden auf Rückflußtemperatur erhitzt. Die warme Lösung wird anschließend mit Natriumchlorid versetzt, und die wässrige Schicht extrahiert man viermal mit Methylendichlorid. Die Methylendichloridextrakte werden vereinigt und getrocknet. Durch Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum erhält man 6,9 g eines amorphen lohfarbenen Feststoffes, der aus einem Gemisch aus Vinblastin und 4-Desacetylvinblasincarbonsäure in' Form des Natriumsalzes besteht.

2 g des auf diese Weise hergestellten unreinen 4-Desacetylvinblastincarbonsäure-natriumsalzes werden in wasserfreiem Methanol gelöst, worauf man die Lösung bis zum Trübpunkt mit Wasser versetzt. Anschließend wird der pH-Wert der erhaltenen Lösung durch Zugabe einprozentiger wässriger Schwefelsäure auf etwa 3,9 eingestellt. Hierauf verdampft man die Lösungsmittel im Vakuum. Der zurückbleibende 4-Desacetylvinblastincarbonsäure-sulfat enthaltende Feststoff wird unter Erwärmen in einem Gemisch aus Äthanol und Wasser gelöst, worauf man die heiße Lösung filtriert. Der beim Abkühlen ausfallende hell-lohfarbene Feststoff wird durch Filtrieren

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gesammelt. Das auf diese Weise hergestellte 4-Desacetylvinblastincarbonsäuresulfat verfügt über folgende physikalische Eigenschaften: pKa = 4,65, 6,3, 7,5 und 8,5 (in 80-prozentigem Dimethylformamid). \ (C₂H₅OH, max.) = 215 m,u (E = 12,5 χ 10³) , 267 m,u (E = 4,0 χ 10³) mit Schultern bei 284 und 294 und etwa 314 m,u.

Analyse berechnet: C 60,55; H 6,62; N 6,57; gefunden: C 60,80; H 6,86; N 6,64.

Die Analyse für Natrium ergab den Wert 0.

Beispiel 2 Vinplastincarbonsäure-sulfat

Man stellt zunächst eine Suspension aus 2,1 g 4-Desacetylvinblastincarbonsäure-natriumsalz in 25 ml wasserfreiem Pyridin her. Die Suspension wird anschließend mit etwa 25 ml Essigsäureanhydrid versetzt. Das Reaktionsgefäß wird hierauf mit einem Trockenröhrchen verschlossen, worauf man das Ganze 4 Tage bei Raumtemperatur rührt. Nach Zugabe von Methanol dampft man das Reaktionsgemisch zur Trockne ein. Dieses Trockenverfahren wird mehrmals wiederholt. Der bei obiger Umsetzung entstandene Vinblastincarbonsäure enthaltende Rückstand wird in Chloroform gelöst, worauf man die Chloroformlösung viermal mit Wasser extrahiert. Die Chloroformlösung wird dann getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in Methanol gelöst, worauf man die Lösung bis zum Trübpunkt mit Wasser versetzt. Anschließend stellt man den pH-Wert der wässrigen Methanollösung durch Zugabe 1-prozentiger wässriger Schwefelsäure auf 2,2 ein. Die erhaltene Lösung wird unter Verwendung von Benzol als azeotropes Mittel zur Entfernung von

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Wasser zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Isopropanol gelöst, und die auskristallisierenden Verunreinigungen werden durch Filtrieren abgetrennt. Durch Eindampfen des Filtrats aus zwei solchen aufeinanderfolgenden Umkristallisationen erhält man 200 mg Vinblastincarbonsäure-sulfat in Form eines lohfarbenen amorphen Feststoffes. Die Verbindung zeigt im Infrarotspektrum eine starke Bande bei 1740 cm , was für eine Erhöhung der Estergruppen spricht. Die Verbindung verfügt über pKa-Werte von 5,2 und 7,7 (66-prozentiges Dimethylformamid).

Beispiel 3 Äthylvinblastinoat-sulfat

Bei einer Temperatur von 0 C werden 500 ml gesättigte äthanolische Chlorwasserstofflösung hergestellt. Diese Lösung versetzt man anschließend mit 3 g 4-DesacetylvinblastincarbonsSure in Form des Natriumsalzes«, Das Reaktionsgefäß wird mit einem Trockenröhrchen verschlossen, worauf man das Ganze etwa 3 Tage bei Umgebungstemperatur im Dunklen stehen läßt. Anschließend verdampft man das Sthanol und löst den erhaltenen Rückstand in Wasser. Die wässrige Schicht wird hierauf mit 14 η Ammoniumhydroxid basisch gestellt. Xthylvinblastinoat ist in der basischen Lösung unlöslich und scheidet sich daher ab. Es wird mit mehreren Mengen Methylendichlorid extrahiert. Die Methylendichloridextrakte werden abgetrennt, vereinigt und getrocknet. Durch Verdampfen des Lösungsmittels erhält man Äthyl-4-desacetylvinblastinoat in Form eines lohfarbenen amorphen Feststoffs. Die IR- und NMR-Spektren dieser Verbindung stimmen mit der postulierten Struktur überein.

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Der lohfarbene Feststoff wird in 25 ml wasserfreiem Pyridin gelöst, das man vorher mit Stickstoff gesättigt hat, und die Lösung versetzt man anschließend mit 25 ml Essigsäureanhydrid. Das auf diese Weise erhaltene Reaktionsgemisch wird in ein Reaktionsgefäß gegeben, das man hierauf dicht verschließt, und man läßt es dann 7 Tage im Dunklen bei Umgebungstemperatur stehen. Im Anschluß daran werden die flüchtigen Bestandteile durch Verdampfen im Vakuum entfernt. Hierauf wird Methanol zugegeben, worauf man die Losung erneut zur Trockne eindampft. Diese Zugabe von Methanol und das Eindampfverfahren werden mehrmals wiederholt. Der erhaltene Rückstand wird anschließend über Silicagel chroma tographiert, wozu man als Eluiermittel ein 2:1 Gemisch aus Äthylacetat und Äthanol verwendet. Diejenigen Fraktionen, die aufgrund einer dünnschichtchromatographischen Bestimmung Athylvinblastinoat enthalten, werden gesammelt und vereinigt, worauf man von den vereinigten Fraktionen durch Verdampfen das Lösungsmittel entfernt. Das Infrarotspektrum des dabei erhaltenen lohfarbenen amorphen Pulvers stimmt mit der postulierten Struktur überein, da bei 1740 cm eine verstärkte Bande zu finden ist. Die Verbindung weist folgende NMR-Maxima auf: <f = 2,11 (0OCH₃), 1,33 (Triplett für OCH₂CH₃), 4,2 8 (Quartett für OCH₂CH₃), mit J_ab= 7 Hz. Der Rest des NMR-Spektrums stimmt mit der postulierten Struktur überein. Im Massenspektrum zeigt sich ein Molekularion m/e von 824, was mit der postulierten empirischen Formel C₄₇Hg₀N₄O₉ übereinstimmt. Die auf diese Weise erhaltene freie Base von Athylvinblastinoat wird in Methanol gelöst, worauf man das Ganze bis zum Trübpunkt mit Wasser versetzt. Anschließend wird die Lösung mit 1-prozentiger wässriger Schwefelsäure auf etwa pH 3 eingestellt, worauf man die erhaltene Lösung unter Verwendung von Benzol zur azeotropen Entfernung des Wassers zur Trockne eindampft. Durch Umkristallisieren des Rückstands aus wasserfreiem Äthanol erhält man einen cremefarbenen Feststoff mit pKa-Werten von 4,6, 6,0 und 7,45 (66-prozentiges Dimethylformamid). Die Ausbeute an Äthylvinblastinoat-sulfat beträgt 204 mg.

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Nach dem oben beschriebenen Verfahren verestert man 4-Desacetylvinblastincarbonsäure-natrium mit Methanol, das mit wasserfreiem Chlorwasserstoff gesättigt ist, wodurch man Methyl-4-desacetylvinblastinoat (4-Desacetylvinblastin) erhält. Diese Verbindung stimmt in jeder Hinsicht mit einer authentischen Probe von 4-Desacetylvinblastin überein, die durch Hydrolyse von Vinblastin hergestellt wird.

Beispiel 4 n-Butylvinplastinoat-sulfat

Nach der im vorherigen Beispiel beschriebenen Arbeitsweise werden 473 ml n-Butanol bei 0 °C mit wasserfreiem Chlorwasserstoff gesättigt. Anschließend gibt man 3 g 4-Desacetylvinblastincarbonsäure-natriumsalz zu und läßt das Reaktionsgemisch 3 Tage bei Umgebungstemperatur im Dunklen stehen. Isolierung und Reinigung des dabei erhaltenen n-Butyl-4-desacetylvinblastinoats erfolgen nach der im vorherigen Beispiel beschriebenen Arbeitsweise. Die so hergestellte Verbindung wird wie im obigen Beispiel beschrieben in trockenem Pyridin acetyliert, und das dabei erhaltene n-Butylvinblastinoat wird chromatographisch gewonnen. Die Verbindung zeigt folgende physikalische Eigenschaften: Maxima in NMR-Spektrum bei <f 2,11 (COCH₃), 0,9 4 (Multiplett für OCH₂CH₂CH₂CH₃) ~ 1,1 - 1,8 (Multiplett für OCH₂CH₂CH₂CH₃), 4,19 (Multiplett für OCH₂C₃H₇). Der Rest des NMR-Spektrums stimmt mit der postulierten Struktur überein. Die Massenspektralanalyse ergibt ein Molekularion m/e von 852, was mit der postulierten empirischen Formel C₄₉Hg₄N₄O₉ übereinstimmt.

Zur Herstellung des Sulfatsalzes von n-Butylviriplastinoat geht man wie im vorherigen Beispiel beschrieben vor, und diese Verbindung schmilzt bei 225 bis 240 ⁰C unter Zersetzung.

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Beispiel 5 4-Desacetyl-t-desformylvincristincarbons5ure

Aus 62Q rag Vincristin In 3O ml wasserfreiem Äthanol wird zunächst eine Lösung hergestellt, die man dann mit 55 ml ΐ η wässrigem Natriumhydroxid versetzt» Die erhaltene Lösung wird ΐ Stunde auf Rucfcflußtemperatur erhitzt, worauf man sie abkühlen läßt. Die Lösung wird dann dreimal mit Methylendichlorid extrahiert. Die Methylendichloridextrakte werden vereinigt und getrocknet* worauf man das Methylendichlorid durch Verdampfen entfernt. Das auf diese Weise erhaltene 4-Desacetyl-1-desformylvincristincarbonsäure—natriumsalz stellt ein lohfarbenes amorphes Pulver mit einem Gewicht von 386 mg dar. Im Infrarotspektrum zeigt sich eine Carbany!bande bei 1735 cm" und keine Bande bei 1695 cm , was beweist, daß die N-Formy!gruppe fehlt.

Beispiel 6

Äthyl—4-desacety 1-1-desformyIvincristinoat (22-&thyl—23-desmethyl—4-desacety1-1-desformyIvincristin)

Nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren verestert man DesacetyIdesformyIvincristincarbonsäure-natriumsalz mit äthanolischem Chlorwasserstoff, wodurch man Äthyl-4-desacetyl-1-desformyIvincristinoat erhält. Die Verbindung fällt als lohfarbener amorpher Feststoff an und zeigt im Infrarotspektrum bei 1735 cm"" eine verstärkte Bande. Dies beweist, daß im Molekül eine höhere Anzahl Estergruppen vorhanden ist. Die Massenspektralanalyse ergibt ein Molekularion m/e von 768, was mit der empirischen Formel ^CAA^^c^Apa übereinstimmt.

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B e i.s ρ i e 1 7 Äthyl^-desacetylvincristinoat

Xthyl—4-desacetyl-1-desforiBylvincristinoafc, hergestellt: gemäß Beispiel 6, wird in 18 ml 97-prozentiger Ameisensäure gelöst, die man alt 3 ml Essigsäureanhydrid versetzt hat. Man 15Bt das Reaktionsgemisch unter wasserfreien Bedingungen im Dunklen etwa 4 Stunden bei umgebungstemperatur stehen. Anschließend werden die flüchtigen Bestandteile durch Eindampfen entfernt, worauf man den Rückstand in Hasser lost. Die wässrige Lösung wird mit 14 η Ämmoniumhydroxid basisch gestellt« und die basische Schicht extrahiert man dreimal mit Methylendlchlorid. Die Methylendichlorldextrakte werden vereinigt und getrocknet. Durch Verdampfen des Methylendichlo— rlds erhält man 1Ο6 mg eines lohfarbenen amorphen Feststoffes, der das bei obiger Umsetzung gebildete Äthyl—4-desacetyl— vincristionat enthält. Die Verbindung wird über Silicagei unter Verwendung von Äthanol als Sluiemtittel cfxromatographisch gereinigt. Die Verbindung zeigt im Infrarotspektrum bei 174Ο cm (Estergruppe) und bei 1695 cm CN-Formylgruppe) starke Banden. Das NMR-Spektrum der Verbindung stimmt mit der postulierten Struktur überein, und die Massenspektralanalyse ergibt ein Molekularion m/e von 796, was mit der empirischen Formel C--H₅₆R,O_g übereinstimmt. Aus obiger Verbindung wird das Sulfatsalz nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren hergestellt, und hierbei handelt es sich um einen lohfarbenen amorphen Feststoff.

Beispiel 8 Z-Hydroxyathyl^-desacetylvinblastinoat-sulfat

!lach den in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren werden 5 g Vlnblastinsulfat in Natrium-4-desacetylvinblastinoat überführt« Das amorphe Natriumsalz wird in Äthylenglycol ge-

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löst:, und diese Lösung gibt man bei einer Temperatur von O ⁰C zu einer mit Chlorwasserstoff gesättigten Lösung von Äthylenglycol. Das erhaltene Reaktionsgeraisch wird in ein entsprechendes Reaktionsgefäß gegeben, worauf man das Reaktionsgefäß dicht verschließt und das Ganze darin bei Umgebungstemperatur 16 Stunden umsetzt. Anschließend wird das Reaktionsgefäß geöffnet und mit 750 ml Wasser versetzt. Das bei diesem Verfahren erhaltene 2-Hydroxyäthyl-4-desacetylvinblastinoat wird aus dem Reaktionsgemisch nach dem Verfahren von Beispiel 3 zur Herstellung des entsprechenden Äthylesters isoliert. Der zurückbleibende Feststoff enthält 2-Hydroxyäthyl-4-desacetylvinblastinoat, das man unter Verwendung eines 1:1-Gemisches aus Äthylacetat und Äthanol als Eluiermittel chromatographisch über Silicagel weiter reinigt. Diejenigen Fraktionen, die der dünnschlchtchromatographischen Analyse zufolge den gewünschten Ester enthalten, werden vereinigt und dann zur Entfernung des Lösungsmittels eingedampft. Die Herstellung des Sulfatsalzes von 2-Hydroxyäthyl-4-desacetylvinblastinoat erfolgt nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren. Die freie Base ergibt bei der Massenspektralanalyse ein Molekularionenspektrum m/e von 798, was mit der empirischen Formel C₄₅H₅₈N₄O₉ übereinstimmt.

Beispiel 9 4-Desacetylvincrlstin und i-Desformyl-4-desacetylvincrlstin

2 g 4-Desacetylvinblastin-sulfat werden in einem Gemisch aus 230 ml Aceton und 50 ml Eisessig gelöst. Durch Lösen von 1 g Chromtrioxid in 300 ml Essigsäureanhydrid und 30 ml Eisessig, der eine Spur Wasser enthält, wird eine zweite Lösung hergestellt. Die Chromtrioxidlösung wird auf -60 ⁰C gekühlt. Anschließend gibt man die 4-Desacetylvinblastin-sulfatlösung über eine Zeitspanne von etwa 15 Minuten langsam zu der gekühlten Chromtrioxidlösung. Das Reaktionsgemisch wird

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dann bei einer Temperatur von 60 C etwa 30 Minuten kräftig gerührt. Hierauf stellt man den pH-Wert durch langsame Zugabe von 14 η Ammoniumhydroxid auf 9,2 ein. Sodann gibt man 1 Liter Wasser zu und evakuiert die Lösung zur Entfernung von Aceton. Die wässrige Schicht wird viermal mit Methylendichlorid extrahiert. Die Methylendichloridextrakte werden vereinigt und getrocknet, worauf man das Methylendichlorid im Vakuum verdampft. Hierbei erhält man ein lohfarbenes amorphes Pulver aus einem Gemisch von 4-Desacetylvincristin und i-Desformyl-4-desacetylvincristin, das bei obiger Reaktion entstanden ist. Das als Rückstand erhaltene lohfarbene amorphe Pulver wird über Silicagel unter Verwendung eines 100:50:7,5 Lösungsmittelgemisches aus Benzol/ Chloroform/Triäthylamin Chromatograph!ert. Die Fraktionen, die einer dünnschichtchromatographischen Analyse zufolge die Vincristinderivate enthalten, werden vereinigt und durch Eindampfen im Vakuum vom Lösungsmittel befreit. Hierbei erhält man 130 mg i-Desformyl-4-desacetylvincristin mit folgenden physikalischen Eigenschaften: IR-Maximum bei 1730 cm" (was auf eine Estergruppe hinweist). Es gibt kein Maximum, das einer Formylgruppe entspricht. Das Infrarotspektrum ist mit dem Infrarotspektrum von 1-Desformyl-4-desacetylvincristin identisch, das aus Vincristin hergestellt wird. Das Molekularionenspektrum m/e beträgt 754, 413, 355, 154.

Man erhält 175 mg 4-Desacetylvincristin als lohfarbenes amorphes Pulver mit folgenden physikalischen Daten: Maxima im Infrarotspektrum bei 3560 cm (Hydroxy), 1735 cm (Estergruppe) und 1690 cm" (Amidgruppe). Das Infrarotspektrum ist mit dem Spektrum des aus Vincristin hergestellten 4-Desacetylvincristins identisch. Das Molekularionenspektrum m/e ergibt folgende Werte 782, 355, 154. Im NMR-Spektrum ergeben sich folgende Werte: $ 8,78(CHO), 6,98 (an der N-Formy!gruppe befindlicher aromatischer Wasserstoff), 6,78

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(zu der N-Formy!gruppe in Metasteilung befindlicher aromatischer Wasserstoff) und 3,86 (aromatische Methoxygruppe). Auch hier ist das NMR-Spektrum wiederum identisch mit dem Spektrum von aus Vincristin hergestelltem Desacetylvincristin.

Beispiel 1O 2-Chloräthyl-4-desacetylvinblastinoat

Nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren verestert man 4-Desacetylvinblastincarbonsäure-natriumsalz mit 2-Chloräthanol, das mit Chlorwasserstoffgas gesättigt ist. Man läßt das Veresterungsgemisch 3 Tage im Dunklen bei Raumtemperatur stehen, worauf die flüchtigen Bestandteile im Vakuum entfernt werden. Das zurückbleibende öl wird in Wasser gelöst, und die saure Lösung stellt man mit 14 η Ammoniumhydroxid basisch. Hierbei scheidet sich das in der alkalischen Schicht unlösliche 2-Chloräthyl-4-desacetylvinblastinoat ab, das man dann mit Dichlormethan extrahiert. Es wird dreimal mit Dichlormethan extrahiert, worauf man diese Extrakte vereinigt, trocknet und zur Entfernung des Lösungsmittels eindampft. Das zurückbleibende lohfarbene amorphe Pulver wird unter Verwendung eines 3:1 Lösungsmittelgemisches aus Äthylacetat und Äthanol als Eluiermittel über Silicagel chromatographiert. Diejenigen Fraktionen, die der dünnschichtchromatographischen Analyse zufolge 2-Chloräthyl-4-desacetylvinblastinoat enthalten, werden vereinigt. Durch Verdampfen des Lösungsmittels erhält man ein weißes amorphes Pulver mit folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften: IR-Absorptionsmaximum bei 1735 cm" . Molekularionenspektrum m/e = 816, 758, 475, 154, was mit der empirischen Formel C.^Hc-^ClN .Og übereinstimmt. Die Herstellung des Sulfatsalzes aus dieser Verbindung erfolgt wie vorher beschrieben.

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Claims

P a t e η t ansprüche

?-)/3-Carbonsäuren und 4-Desacetyl-3-carbonsäuren sowie Ester von Vinblastin, Vincristin und Leurosidin der Formel I

12¹

13¹

•R¹

I-O-CH

Il O

CH O—·■

3 ^ 17

.ü. ³A

'18

I R

!OH

C-O-R¹·

worin

für CH₃, CH=O oder Wasserstoff steht,

R¹ Wasserstoff oder Acetyl bedeutet,

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BRD - 23 -

R" Wasserstoff, C₂-C₅-Alkyl, Mono- oder Dihydroxy*- (C₀-Cc)alkyl, Monohalogen(C₀-Cc)alkyl, Mono(C,-C.)-alkanoyloxy(C₃-C₅)alkyl, Crotyl, Methallyl, Allyl, Propargyl oder 2-Butin-1-ol ist.

einer der Substituenten
R¹¹¹ oder

Hydroxy und der andere Äthyl bedeutet,

mit der Maßgabe, daß lediglich einer der Substituenten R* oder R¹' für Wasserstoff steht, wenn R Methyl ist,

und die Säureadditionssalze obiger Verbindungen mit nichttoxischen Säuren.
2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um Vinblastincarbonsäure, Leurosidincarbonsäure, Vincristincarbonsäure, 1-Desformylvincristincarbonsäure, 1-Desformyl-4-desacetylvincristincarbonsäure, 4-Desacetylvinblastincarbonsäure oder 4-Leurosidincarbonsäure und den pharmazeutisch unbedenklichen Salzen hiervon handelt.
3. Verfahren zur Herstellung von 3-Carbonsäuren und 4-Desacetyl-3-carbonsäuren sowie Estern von Vinblastin, Vincristin und Leurosidin, dadurch gekennzeichnet, daß man Vinblastin, Vincristin, Leurosidin oder ein Gemisch aus 4-Desacetylvincristin und i-Desformyl-4-desacetylvincristin mit verdünnter Base zu 4-Desacetylvinblastincarbonsäure, 1-Desformyl-4-desacetylvincristincarbonsäure oder 4-Desacetylleurosidincarbonsäure umsetzt, und, falls der Substituent R¹ beim gewünschten Produkt Acetyl sein soll, die dabei erhaltenen Säuren in Gegenwart von Pyridin acetyliert und die Stellung 1 der Vincristincarbonsäure gegebenenfalls vor oder nach Acetylierung formyliert, und die auf diese Weise erhaltenen Säuren gegebenenfalls verestert oder die erhaltenen Säuren oder Ester gewünschtenfalls mit einer zur Bildung eines pharmazeutisch unbedenklichen Säureadditionssalzes geeigneten Säure umsetzt.

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