AT345996B

AT345996B - Verfahren zur herstellung neuer amidderivate von vinblastin, leurosidin und leurocristin und ihrer saeureadditionssalze

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Publication number: AT345996B
Application number: AT980175A
Authority: AT
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1973-04-02
Filing date: 1974-04-01
Publication date: 1978-10-10
Also published as: ATA980175A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung neuer Amidderivate von Vinblastin, Leuro- sidin und Leurocristin und ihrer Säureadditionssalze.

Die erfindungsgemäss erhältlichen neuenAmidderivate sind zur Behandlung neoplastischer Erkrankungen von Wert.

Die neuen Amidderivate von Vinblastin, Leurosidin und Leurocristin haben die Formel
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worin
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oderN3 steht, wobei
Alk (Ci - C6) -Alkyl bedeutet,
Am für NH2, NHCH3 oder N (CH3) 2 steht,
X Wasserstoff, Cyano, Phenyl, Carboxyl (COOH), Carbo- (C1-C3)-alkoxy oder Carbox- amido (CO-NH2) bedeutet, Ei für Wasserstoff oder Acetyl steht,
R" Wasserstoff, (C1-C3)-Alkyl, Formyl oder (C2-C4)-Alkanoyl bedeutet, und einer der Substituenten R moder R Im für Hydroxyl steht und der andere Äthyl bedeutet.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der neuen Amidderivate von Vinblastin, Leurosidin und Leurocristin der Formel (I) und ihrer Säureadditionssalze besteht in seinem Wesen darin, dass man eine Verbindung der Formel (I), worin
R für 0-CH3 steht,
R'Wasserstoff oder Acetyl bedeutet und
R R'" sowie R"" obige Bedeutung haben, mit Hydrazin umsetzt und die so erhaltene Verbindung mit einem Nitrosiermittel und mit einer Verbindung der Formel
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zur Umsetzung bringt, worin R2 Wasserstoff oder - CH 3 bedeutet und
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Alk für (Ci -C6 )-Alkyl steht und
Am und X die oben angegebene Bedeutung haben, und gewünschtenfalls eine so erhaltene Verbindung mit einer nichttoxischen anorganischen oder organischen Säure in ein Säureadditionssalz überführt.

Zur Behandlung neoplastischer Erkrankungen können die erfindungsgemäss erhältlichen neuen Amidderivate bzw. ihre Säureadditionssalze in einer Menge von 0, 1 bis 1, 0 mg/kg Säugetier-Körpergewicht verabfolgt werden. Mehrere natürlich vorkommende Alkaloide, die sich au inca rosea erhalten lassen, er-
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(US-PS Nr. 3,370, 057), Vincaleukoblastin (Vinblastin) (US-PS Nr. 3, 097, 137), Leurosidin (Vinrosidin) und Leurocristin (Vincristin) (s. für beide US-PS Nr. 3,205, 220). Zwei dieser Alkaloide, nämlich Vinblastin und Leurocristin, befinden sich als Heilmittel zur Behandlung von Malignitäten, insbesondere von Leukämie und damit verwandten Erkrankungen beim Menschen, jetzt auf dem Markt.

Eine dieser Verbindungen, nämlich Leurocristin, ist ein äusserst wirksames und interessantes Mittel zur Behandlung von Leukämie, es stellt jedoch die am wenigsten häufig vorkommende Verbindung der antineoplastischen Alkaloide von Vinca rosea dar.

Eine chemische Modifikation der Vinea-Alkaloide war bisher ziemlich begrenzt. Hiezu ist es als erstes zu sagen, dass die diesbezüglichen Molekularstrukturen äusserst komplex sind und sich chemische Reaktionen, die eine spezifische Funktion des Moleküls beeinflussen, nur schwer entwickeln lassen. Zweitens ist zu erwähnen, dass aus Vinca rosea-Fraktionen Alkaloide isoliert wurden, die keine ausreichenden chemotherapeutischen Eigenschaften besitzen, und eine Strukturbestimmung dieser Verbindungen zu dem Schluss führte, dass sie mit den wirksamenAlkaloiden nahe verwandt sind. Eine antineoplastische Wirksamkeit scheint daher auf sehr spezifische Strukturen beschränkt zu sein, und die Chancen, durch Modifikation dieser Strukturen zu wirksameren Heilmitteln zu gelangen, erscheinen entsprechend leicht.

Zu den erfolgreichen Modifikationen physiologisch aktiver Alkaloide gehört die Herstellung don Dihydrovinblastin (US-PS Nr. 3, 352, 868) und der Ersatz der Acetylgruppe am C-4 [Kohlenstoff Nr. 4 des Vinblastinringsystems, s. Formel (I)] durch eine höhere Alkanoylgruppe oder durch eine damit nicht verwandte Acylgruppe (s. US-PS Nr. 3, 392, 173). Mehrere dieser Derivate verlängern das Leben von Mäusen, die mit P1534 Leukämie beimpft wurden. Eines dieser Derivate verlängern das Leben von Mäusen, die mit P1534 Leukämie beimpft wurden.

Eines dieser Derivate, bei dem die am C-4 befindliche Acetylgruppe von Vinblastin durch eine Chloracetylgruppe ersetzt wurde, ist ferner ein interessantes Zwischenprodukt zur Herstellung strukturell modifizierter Vinblastinverbindungen, bei denen die am C-4-Atom befindliche Acetylgruppe von Vinblastin durch eine N, N-Dialkylglycylgruppe ersetzt ist (US-PS Nr. 3,387, 001). Während der chemischen Umsetzung zu diesen letztgenannten Derivaten entstand auch ein anderes Zwischenprodukt, nämlich das 4-Desacetylvinblastin. Dieses Zwischenprodukt, das über keine Acylgruppe in Stellung C-4 verfügt, jedoch stattdessen über eine nichtveresterte Hydroxygruppe, wurde als toxisches Material beschrieben, das in vivo gegen P1534/Leukämie bei der Maus nur schwach chemotherapeutisch wirkt [Hargrove, Lloydia, 27,340 (1964)].

Beispiele geeigneterResteAlk- (OH) g,'Alk-Am und Alk-X in obiger Formel sind : Methyl, 2-Me-
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Hexyl,methylaminomethyl, 2-Aminopropyl, 2-Aminohexyl, 2-Dimethylaminopropyl, 2, 2-Dihydroxyisopropyl, 2, 2-Di- hydroxyisopropyl, 2, 2-Dihydroxy-t. butyl, 2,2, 2-Trihydroxy-t. butyl u. dgl.

In obiger Formel werden unter (C-C.,)-Alkanoyl-und Chlor- (C.-C. J-alkanoylgruppen, wie Acetyl, Chloracetyl, Propionyl, 2-Chlorpropionyl, 2-Chlorbutyryl und Butyryl, verstanden, und hiebei handelt es sich um Gruppen der Formel (C -Cg)-Alkyl-CO, eineAlkanoyIgruppe, oder der Formel (C -Cg)-Alkyl- (Cl)-CO, eine Chloralkanoylgruppe.
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bezieht sich auf die Reste Carbomethoxy, Carboäthoxy, Carboisopropoxy und Carbo-n-propoxy.

Falls der Substituent X bei dem Rest Alk-X für Phenyl steht, dann kann die Phenylgruppe die üblichen Aromatensubstituenten enthalten, wie Niederalkyl, Niederalkoxy, Hydroxy, Halogen, Nitro u. dgl., und eine vorgegebene Phenylgruppe kann einen oder mehrere dieser Substituenten enthalten, die entweder gleich oder von den ursprünglichen Substituenten verschieden sind. Beispiele solcher Gruppen sind 4-Hydroxyphenyl, 2, 4-Dichlorphenyl, 2-Methyl-4-chlorphenyl, 2,4-Dinitrophenyl, 3,5-Xylyl, 4-Tolyl, 3-Äthoxyphenyl u. dgl.

Zu nichttoxischen Säuren, die sich zur Bildung pharmazeutisch unbedenklicher Säureadditionssalze der Aminbasen eignen, gehören Salze anorganischer Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Bromwasserstoffsäure, Jodwasserstoffsäure, salpetrige Säure, phosphorige Säure u. dgl., sowie Salze nichttoxischer organischer Säuren unter Einschluss aliphatischer Mono- oder Dicarboxylate, phenylsubstituierter Alkanoate, Hydroxyalkanoate und Alkandioate aromatischer Säuren, aliphatischer oder aromatischer Sulfonsäuren u. dgl.

Zu solchen pharmazeutisch unbedenklichen Salzen gehören die Sulfate, Pyrosulfate, Bisulfate, Sulfite, Bisulfite, Nitrate, Phosphate, Monohydrogenphosphate, Dihydrogenphosphate, Metaphosphate, Pyrophosphate, Chloride, Bromide, Jodide, Acetate, Propionate, Decanoate, Caprylate, Acrylate, Formiate, Isobutyrate, Caprate, Heptanoate, Propionate, Oxalate, Malonate, Succi-

nate, Suberate, Sebacate, Fumarate, Maleate, Butin-1,4-dioate, Hexin-1,6-dioate, Benzoate, Chlorbenzoate, Methylbenzoate, Dinitrobenzoate, Hydroxybenzoate, Methoxybenzoate, Phthalate, Terephthalate, Benzolsulfonate, Toluolsulfonate, Chlorbenzolsulfonate, Xylolsulfonate, Phenylacetate, Phenylpropionate, Phenylbutyrate, Citrate, Lactate, 2-Hydroxybutyrate, Glycollate, Malate, Tartrate, Methansulfonate, Propansulfonate, Naphthalin-l-sulfonate, Naphthalin-2-sulfonate u.

dgl.

Die Verbindungen der obigen Formeln lassen sich allgemein entweder als Derivate von Vinblastin, worin
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tylvinblastin, worin Rn, R'" und R"" gleich bleiben, jedoch R' Wasserstoff bedeutet, oder von Leurocristin, worin R'für Acetyl steht, Rn Formyl bedeutet, R In für Hydroxy steht und R 1111 Äthyl bedeutet, oder von Desacetylleurocristin, worin R R'" und r"" gleich sind, jedoch R'Wasserstoff bedeutet, beschreiben, oder man kann sie als Derivate den Desmethylvinblastin (das auch als Desformylleuroeristin bekannt ist), worin R'für Acetyl steht, R 11 Wasserstoff bedeutet und R'" sowie R"" Hydroxyl bzw.

Äthyl bedeuten, oder von Desacetyldesmethylvinblastin (oder Desacetyldesformylleuroeristin), worin sowohl R' als
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tyldesmethyllaurosidin, worin R'und R"für Wasserstoff stehen, R 111 Äthyl bedeutet und R"" für Hydroxy steht, oder von Desacetylleurosidin, worin R' Wasserstoff bedeutet, R four Methyl steht und R tn sowie R ml Äthyl bzw. Hydroxy bedeuten, bezeichnen. In jedem Fall bezieht sich die Ausdrucksweise Desacetyl auf das Fehlen einer Acetylgruppe an dem Hydroxyl am C-4 des komplexen Indol-Dihydroindol-Ringsystems.

Die durch die Formel (1) exemplifizierten Derivate sind solche, bei denen die Carboxymethylgruppe am C-3 bestimmter bekannter Indol-Dihydroindol-Alkaloide in eine Carboxyhydrazidgruppe, eine Carboxazidgruppe, eine Carboxamidgruppe oder ein Derivat hievon transformiert ist. Nicht alle dieser Derivate lassen sich einfach durch ein Verfahren herstellen.

Die Ausgangsverbindung, in welcher R in der obigen allgemeinen Formel (I) NH-NH2 bedeutet, wird wie folgt hergestellt : Man behandelt Vinblastin, Leurosidin, Leurocristin, Desmethylvinblastin, Desmethylleurosidin oder ihre entsprechenden 4-Desacetylverbindungen mit Hydrazin, wodurch man das entsprechende Hydrazid erhält. Das Produkt dieser Umsetzung mit Ausgangsmaterialien, die eine intakte 4-Acetylgruppe haben, ist normalerweise ein Gemisch von Verbindungen, bei denen die Carbomethoxygruppe am C-3 in eine Carboxhydrazidgruppe transformiert ist, bei der jedoch gleichzeitig die Acetylgruppe am C-4 vollständig oder teilweise entfernt ist. Zur Reinigung werden die so hergestellten C-4-Desacetylderivate chromatographisch getrennt.

Diejenigen erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen, bei denen der Substituent R für N (CHg) , NH-Alk-X steht, worin X, H, CN oder Phenyl bedeutet, NH-(C3-C8)-Cycloalkyl, NH-Alk-Am oder NH-Alk- (OH) 1-3 steht und Alk und Am die oben genannte Bedeutung haben, werden nach folgendem Verfahren hergestellt : Ein durch Umsetzen der C-3-Carbomethoxyverbindung mit wasserfreiem Hydrazin hergestelltes Hydrazin der Formel (I), worin R für NH-NH2 steht, wird in das entsprechende Azidumgewandelt, indem man das Hydrazid in bekannterWeise mit einem Nitrosiermittel behandelt, wie salpetriger Säure, Ni-
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das unter die oben angegebene Formel (I) fällt. Diese C-3-Azid-Amin-Reaktion beeinflusst die C-4-Acylgruppe nicht, die, falls sie vorhanden ist, während der Umsetzung und Aufarbeitung intakt bleibt.

Die oben erwähnte Azid-Amin-Transformation erfolgt nach dem Verfahren von Stoll und Huffman, Helv. Chim. Acta., 26,944 (1943) (vgl. US-PS Nr. 2,090, 429 und Nr. 2,090, 430).

Verbindungen, die am C-4 eine Acetylgruppe haben, lassen sich, wie oben erwähnt, durch direktes Um-
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Azid umwandelt, und das erhaltene Azid mit einem Amin umsetzt, wodurch man die Amide der Formel (I) erhält. Im allgemeinen wird die oben erwähnte Reaktionsfolge Hydrazin-Azid-Amid wegen der Empfindlichkeit der 4-Acetylgruppe unter basischenReaktionsbedingungen jedoch mit einem 4-Desacetylderivat durchgeführt. Die 4-Desacetylamide der obigen Formel (1) lassen sich im allgemeinen mit einem aliphatischen Säureanhydrid oder Säurechlorid zum entsprechenden C-4-Acetat, Propionat oder Butyrat oder einem Chlorderivat hievon acylieren. Für diese Acylierung kann man als Säurechlorid (CCg)-Alkyl-COCl oder Chlor-
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(Cbeschriebene Verfahren, bei dem man als erstes Reaktionsprodukt ein Diacylderivaterhält, das man dann selektiv zu einer 4-Acylverbindung hydrolysiert. Zur Herstellung der 4-Acylderivate lassen sich auch andere Verfahren einer selektiven Acylierung oder multiplen Acylierung unter anschliessender selektiver Hydrolyse verwenden.

Für ein Acylierungsverfahren gibt es jedoch einige Ausnahmen, die man beachten muss. Zunächst ist zu sagen, dass eineAcylierung eines 1-Desformyllaurocristins (1-Desmethylvinblastin) oder eines 1-Desmethyllaurosidins, wie für einen Fachmann selbstverständlich, ebenfalls zu einer Acylierung am N-1 führt. Eine 1-Desformyl-oder 1-Desmethylverbindung muss daher vor der C-4-Acylierung formyliert, acyliert, oder alkyliert werden, damit man den gewünschten Substituenten am N-1 erhält. Falls die C-3-Carboxamidgruppe eine acylierbare Gruppe enthält, beispielsweise Hydroxy oder Amino, dann muss man die C-4- Acylierung ferner vor der Azid-Amin-Reaktion durchführen, die zur gewünschten C-3-Carboxamidgruppe führt.

Hiezu acyliert man vorzugsweise das C-3-Carboxhydrazid nach den oben erwähnten Verfahren, wobei man die Hydrazidgruppe zuerst schützt, da diese sonst acyliert würde. Die bevorzugte Hydrazidschutzgruppe ist die Propylidengruppe, die durch Umsetzung des NH-Teils der Hydrazidgruppe mit Aceton entsteht. Diese Gruppe lässt sich durch Behandeln mit Säure leicht abspalten, oder man setzt das Propylidenderivat selbst vorzugsweise direkt mit Nitrit unter Bildung einer Azidgruppe um (s. US-PS Nr. 3,470, 210, Beispiel VII).

Andere Verfahren unter Einschluss einer selektiven Acylierung oder einer multiplen Acylierung und anschliessenden selektiven Hydrolyse oder eines selektiven Schutzes einer acylierbaren Funktion und anschliessender Acylierung sowie nachfolgender Abspaltung der Schutzgruppe sind dem Fachmann bekannt.

Verbindungen der oben erwähnten Formel (I), bei denen R NH-Alk-X und X Carboxyl, Carboxamido oder Carbo- (C1-Ca) -Alkoxy steht, lassen sich herstellen, indem man eine Aminosäure, einen Aminoester oder ein Aminoamid der Formel
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worin Q für OH, NH2 oder O-Alk steht und Z Wasserstoff oder C-C-Alkyl bedeutet, mit dem jeweiligen dimeren Indol-Dihydroindolazid umsetzt. Zu Aminosäuren, die sich für diesen Zweck eignen und die unter die allgemeine Formel (I) fallen, gehören Leucin, Isoleucin, Valin, Glycin, Alanin, Norleucin u. dgl. Selbstverständlich lassen sich auch andere Aminosäuren und Polypeptide für eine Umsetzung mit beispielsweise
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Nickel unterworfen wird.

Die Derivate der Formel (1) werden nur unter Bezugnahme auf die neue Gruppe bezeichnet, die an einem gegebenen Kohlenstoffatom gebildet wird. Die durch Ersatz der Methylesterfunktion beim Vinblastin am C-3 durch eineAmidfunktion entstandene Gruppe wird daher beispielsweise einfach alsVinblastin-C-3-earboxamid bezeichnet, und nicht als Vinblastin-C-3-descarbomethoxy-C-3-carboxamid.

Die Verbindungen der Formel (I) sind in Form ihrer freien Basen, unter Einschluss ihrer Carboxamide, Carboxazide und Carboxhydrazide, weisse oder lohfarbene amorphe Feststoffe. Wenn möglich werden die Amide jedoch in Form ihrer anionischen Salze mit nichttoxischen Säuren isoliert und kristallisiert. Diese Salze stellen hochschmelzende, weisse, kristalline oder amorphe wasserlösliche Feststoffe dar.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Bei s pie I 1 : 4- Desacetylvinblastin-C-3-carboxhydrazid 4-Desacetylvinblastin wird in wasserfreiem Äthanol mit einem Überschuss an wasserfreiem Hydrazin in einem verschlossenen Reaktionsgefäss etwa 18 h auf etwa 600C erhitzt. Das Reaktionsgefäss wird dann abgekühlt und geöffnet, worauf man seinen Inhalt entfernt und die flüchtigen Bestandteile im Vakuum abzieht. Das erhaltene Gemisch, das das 4- Desacetylvinblastin-C-3-carboxyhydrazidenthält, wird in Methylenchlorid aufgenommen, worauf man die Methylenehloridlösung in Wasser wäscht, abtrennt und trocknet, und das Methy- lenchlorid im Vakuum verdampft. Der erhaltene Rückstand wird in einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Benzol (1 : 1) gelöst und über Silicagel chromatographiert.

Zum Entwickeln des Chromatogramms verwendet man ein Eluiermittel aus Benzol-Chloroform-Triäthylamin. Die anfänglichen chromatographschen Fraktionen enthalten nichtumgesetztes 4-Desacetylvinblastin. Die nachfolgenden Fraktionen enthalten 4-Desacetyl-18-desearbomethoxyvinblastin-C-3-earboxhydrazin, wie dies von Neuss et al in Tetrahedron Letters, 1968,783 beschrieben wurde. Die nächsten Fraktionen, die dünnschichtchromatographischer Analyse zufolge 4-Desacetylvinblastin-C-3-carboxhydrazin enthalten, werden vereinigt und im Vakuum von den Lösungsmitteln befreit. Der erhaltene Feststoff schmilzt bei etwa 210 bis 2200C unter Zersetzung.

Das auf diese Weise hergestellte 4-Desacetylvinblastin-C-3-earboxhydrazidhat eine Carbomethoxy-Absorptionsbande im IR bei 1725 bis 1735 cm-1, wodurch es sich von der oben erwähnten 18-Descarbomethoxyverbindung von Neuss et al

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ein-,massenspektrometriseh bestimmte Molekulargewicht von 768 stimmt mit dem für C43H56N6O7 berechneten theoretischen Werten überein. Das NMR-Spektrum enthält die hervorstehende Resonanz bei 3,6 ppm, die die Methylgruppe der C-18-Carbomethoxyfunktion zeigt.

Nach obiger Arbeitsweise setzt man das gemäss der US-PS Nr. 3, 392,173 zugängliche 4-Desacetylleuro- cristin mit wasserfreiem Hydrazin in wasserfreiem Methanol um, wodurch man das 4-Desacetyl-1-desformylleurocristin-C-3-carboxyhydrazid erhält, das man als amorphes Pulver isoliert.

Infrarotspektrum : Absorptionsmaxima bei 1730 cm-1 (Ester), 1670 cm-1 (Hydrazid) ;
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Eine Lösung von 678 mg 4-Desacetylvinblastin-C-3-carboxhydrazid (aus Beispiel 1) wird in 15 ml wasserfreiem Methanol hergestellt. Diese Lösung versetzt man mit etwa 50 ml n-wässeriger Salzsäure, und die so erhaltene Lösung wird auf etwa 0 C gekühlt. Daraufhin werden etwa 140 mg Natriumnitrit zugegeben und das erhaltene Reaktionsgemisch rührt man 10 min, wobei die Temperatur auf etwa OOC gehalten wird. Nach Zusatz des Natriumnitrits wird die Lösung dunkelrotbraun. Das Reaktionsgemisch stellt man dann durch Zugabe eines Überschusses von kaltem 5%igem wässerigem Natriumbicarbonat basisch. Die wässerige Lösung wird dreimal mit Methylendichlorid extrahiert.

Das bei obiger Umsetzung gebildete 4-Desacetylvinblastin- - C-3-carboxazid geht in das Methylendichlorid.

Die Methylendichloridlösung von 4-Desacetylvinblastin-C-3-carboxazid wird normalerweise zwar ohne weitere Reinigung verwendet, eine Teilmenge hievon behandelt man zur Charakterisierung der Säure jedoch wie folgt : Das Methylendichlorid wird eingedampft, wodurch das Azid in amorpher Form zurückbleibt. Der Azidrückstand wird mit Äther gewaschen, und die erhaltene Suspension filtriert man. Das zurückbleibende lohfarbene Pulver hat folgende physikalische Unterscheidungsmerkmale : Ultraviolettspektrum An= = 269 mu.

(e = 16700) Schulter bei etwa 290 my ; 309 m .

(e = 7100), das Infrarotabsorptionsmaximum bei 1690 cm-1 (Carboxhydrazid) fehlt, das Maximum bei 1730 cm-1 ist jedoch nicht beeinträchtigt. Ferner lässt sich bei 2135 cm-1 ein scharf begrenztes Maximum feststellen, das für die Carboxazidfunktion charakteristisch ist. Das Massenspektrum zeigt ein Molekularion von m/e = 708, was einen Verlust von 71 Masseneinheiten (H, CON3) gegenüber dem für C, gH NO. berechneten Molekulargewicht bedeutet.
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net und auf ein Volumen von etwa 20 ml reduziert.

Die Lösung des Azids in Methylendichlorid wird dann in einen mit einem Trockenrohr und einem Rührer versehenen Kolben gegeben. Sodann werden 50 ml wasserfreies Äthylamin zugesetzt, worauf man das Reaktionsgemisch etwa 2 h beiRaumtemperatur rührt. Durch Verdampfen der flüchtigen Bestandteile im Vakuum erhält man ein lohfarbenes amorphes Pulver, das man über Silicagel chromatographiert. Das Chromatogramm wird mit einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat-wasserfreiem Äthanol (3 : 1) entwickelt. Diejenigen Fraktionen, die einer dünnschichtchromatographischen Analyse zufolge 4-Desacetylvinblastin-C-3-N-äthylcarboxamid enthalten, werden vereinigt, worauf man das Lösungsmittel im Vakuum abzieht.

Auf diese Weise erhält man 450 mg eines lohfarbenen amorphen Pulvers, das folgende physikalische Eigenschaften aufweist : Molekularionenspektrum : m/e = 781 (entsprechend C HN5O-) ;
Infrarotspektrum : Absorptionsmaxima bei 1730 cm-1 (Ester), 1670 cm-1 (Amid), 3420 cm-1(N-H Amid); NMR : ö l, 18 (Triplet-ss-Methyl der Äthylamidgruppe),
6 3,28 (Quarter-&alpha;-Methylen der Äthylamidgruppe),
6 3,59 (Singlett-Methylester).

Zur Herstellung von 4-Desacetylvinblastin-C-3-N-äthylcarboxamidsulfat löst man das obige amorphe Pulver in wasserfreiem Äthanol und stellt den pH-Wert der Lösung mit 2% iger Schwefelsäure in wasserfreiem Äthanol auf etwa 4,0 ein.

Durch Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum erhält man ein wasserlösliches lohfarbenes Pulver, das 4-Desacetylvinbla stin-C-3-N-äthylcarboxamidsulfat enthält. Nach dem oben beschriebenen Verfahren stellt man 4-Deseacetylvinblastin-C-3-N-isopropylcarboxamid her. Die Verbindung hat folgende unterscheidbare Charakteristika : Molekularionenspektrum : m/e = 795 (entsprechend C46H51N5O7);
Infrarotspektrum : Maxima bei 1730 cm-1 (Ester), 1660 cm-1 (Amid) ;
NMR : # 1,16, # 1, 22 (Doublett für Isopropyl-Methylgruppen).

Nach dem oben beschriebenen Verfahren stellt man 4-Desacetylvinblastin-C-3-N-isopropylcarboxamidsulfat her, das ein lohfarbenes wasserlösliches amorphes Pulver ist.

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N-dimethylcarboxamidNMR: # 2,96 (Singlet-N-Methyl), ö 3, 46 (Singlet-N-Methyl).

Das nach obiger Arbeitsweise hergestellte Sulfatsalz von 4-Desacetylvinblastin-C-3-N, N-dimethylcarboxamid stellt ein wasserlösliches lohfarbenes amorphes Pulver dar.

Nach dem oben beschriebenen Verfahren stellt man aus dem Carboxazid und N,N-Dimethyläthylamin auch 4-Desacetylvinblastin-C-3-N- [2-(N,N-dimethylaminoäthyl)] carboxamid her, das über folgende unterscheidbare physikalische Eigenschaften verfügt :
Infrarotspektrum : Absorptionsmaxima bei 3410 cm-1 (N-H Amid), 1740 cm-1 (Ester), 1670 cm-1 (Amid);
NMR : 6 2, 44, 6 3, 41 (Methylen von der Äthylidenfunktion), # 2,23 (Methyl von der Dimethylaminogruppe) ;
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pKa = 4,85, 7,0, 8, 5.

Das nach obiger Arbeitsweise hergestellte entsprechende Sulfatsalz ist ein lohfarbenes wasserlösliches amorphes Pulver.

Unter Verwendung von Benzylamin stellt man nach obiger Arbeitsweise auch 4-Desacetylvinblastin-C- - 3-N-benzylcarboxamid her, das über folgende physikalische Eigenschaften verfügt :
Infrarotspektrum : Maxima bei 3420 cm-1 (N-H Amid), 1735 cm-1 (Ester), 1675 cm-1 (Amid) ; NMR : ö 7,32 (aromatische Protonen),
6 3,69 (Methylengruppe von Benzylamid) ; Molekularionenspektrum : m/e = 843 (übereinstimmend mit C50H61N5O7).

Das nach der oben beschriebenen Arbeitsweise hergestellte entsprechende Sulfat ist ein wasserlösliches lohfarbenes amorphes Pulver.

Durch Umsetzen von 4-Desacetylvinblastin-C-3-N-cyanomethylcarboxamid mit Cyanomethylamin erhält man nach der oben beschriebenen Arbeitsweise das 4-Desacetylvinblastin-C-3-N-cyanomethylcarboxamid.

Dieses neue Amid hat folgende unterscheidbare physikalische Eigenschaften :
Infrarotabsorptionsmaxima bei 1690 cm -1 (Amid), 3420 cm-1 (Amid NH) ;
NMR : 6 4,17 (C4-H), ô 2, 80 (N-CH3),
6 3,77 (aromatisches H), ö 3,69 (Methylester H),
6 4, 48 (J = 6Hz), 6 3, 92 (J = 17 hz), beides Cyanomethylen;
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: m/ehydrazid, hergestellt gemäss Beispiel 1, mit Natriumnitrit in verdünnter Salzsäure um, wodurch man 1-Des- formyl-4-desacetylleurocristin-C-3-carboxazid in Form eines gelben amorphen Pulvers erhält. Eine Methylendichloridlösung von 1-Desformyl-4-desacetylleurocristin-C-3-äthylcarboxazid wird dann mit Äthylamin
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aus Äthylacetat/wasserfreiesÄthanol (l : l) als Eluiermittel chromatographisch gereinigt.

Diejenigen Fraktionen, die gemäss dünnschichtchromatographischer Bestimmung das N-Äthylamid enthalten, werden vereinigt und zur Trockne eingedampft.
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setzt und so zum 4-Desacetylleurosidin-C-3-amid gelangt, das man wie oben erwähnt chromatographisch reinigt. Die so erhaltene Verbindung hat folgende physikalische Eigenschaften :
Infrarotmaxima: 3400 cm-1 (N-H Amid), 1740 cm-1 (Ester), 1690 cm-1 (Amid) ;
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:NMR : # 3,58 (C18-Methylester),
6 3,78 (C16 - Methoxyl), Ï 2, 88 (Cl-Methyl),

a 5,78 (C-3 Amidwasserstoffe),
6 4, 18 (C4 -Wasserstoff).

Die Herstellung des entsprechenden Sulfats erfolgt durch Neutralisieren einer Äthanollösung der Base mit äthanolischer Schwefelsäure, wodurch man zu einem lohfarbenen amorphen Pulver gelangt.

In ähnlicher Weise lassen sich andere Amide und Leurosidin herstellen.

Jedes der Desacetyl-1-desformyl-1-alkanoylderivate sowie die 4-Desacetylvinblastin-, Leurocristin- oder-Leurosidin-C-3-earboxamide, mit Ausnahme der Carboxhydrazide und derjenigen Amidverbindungen, die eine reaktionsfähige Funktion enthalten, lässt sich mit andern Anhydriden umsetzen, wie Chloressigsäure- anhydrid, Buttersäureanhydrid, 2-Chlorpropionsäureanhydrid u. dgl" wodurch man beispielsweise mit Chlor- essigsäureanhydrid ein Gemisch aus dem 3, 4- Bis-chloracetyl- und dem 4-Chloracetylderivat erhält, das man durchBehandeln mit feuchtem Silicagel zum reinen 4-Chloracetylderivat umsetzen kann. Andere 4-Acylderi- vate lassen sich in ähnlicher Weise herstellen.

Beispiel 5 : Herstellung von Salzen
Andere Salze, zu denen auch Salze anorganischer Anionen gehören, wie die Chloride, Bromide, Phosphate, Nitrate u. dgl., sowie Salze organischer Anionen, wie die Acetate, Chloracetate, rrichloracetate, Benzoate, Alkyl- oder Arylsulfonate u. dgl., können aus den Amidbasen nach einer analogen Arbeitsweise hergestellt werden, wie sie oben in Beispiel 1 für die Herstellung der Sulfate beschrieben wurde, indem man an Stelle der l% igen wässerigen Schwefelsäure dieses Beispiels jeweils die entsprechende Säure in einem geeigneten Lösungsmittel anwendet.

Selbstverständlich erfordert die Gegenwart anderer Ester und/oder Amidgruppen in den Indoldihydroindolkomponenten eine besondere Sorgfalt bei der Herstellung von Salzen, um eine Hydrolyse, Veresterung oder sonstige Reaktionen zu vermeiden, zu denen es bei hohen Temperaturen und extrem sauren PH-Werten u. dgl. kommt.

Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen erwiesen sich in vitro gegenüber herpes virus unter Verwendung eines Gewebekultursystems in einem Fleckensuppressionstest, der dem von Siminoff, Applied Micro biology (1961) beschriebenen Test ähnelt, als antiviral wirksam. Vinblastin-C-3-carboxamidsulfat er- gab beispielsweise eine 20 ml Inhibierungszone mit einer Beurteilung von 3 und ohne Toxizität bei einer Dosierung von 125 mg/ml. Mit der gleichen Verbindung liess sich eineMetaphasenhemmung bei gezüchtete chinesischen Hamstereizellen in Dosen von 2X 10-2 g/ml bis 2 x 10-5 pg/ml induzieren. Als wirksamstes derartiges Induktionsmittel erwies sich das 4-Desacetylleurocristin-C-3-N-methylcarboxamidsulfat, das in Dosen von 10-6 pg/ml wirksam war.

Die erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen erwiesen sich darüber hinaus auch in vivo gegenüber transplantierten Mäusetumoren wirksam. Eine derartige Wirksamkeit entwickelten beispielsweise 4-Des-
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oxhydrazid und andere Verbindungen, die unter die obige Formel fallen. Von besonderem Interesse ist jedoch die Wirksamkeit der erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen, insbesondere des 4-Desacetylvinblastin- - C-3-carboxamidsulfats und dessen N-Alkyl-sowie N-Hydroxyalkylderivaten, gegen Ridgeway Osteogensarcoma (ROS) und Gardner Lymphosarcoma (GLS). Die Wirksamkeit der erfindungsgemässen Verbindungen gegenüber diesen Tumoren wurde an Hand eines Verfahrens ermittelt, nach welchem man das Heilmittel normalerweise intraperitoneal in einer vorgegebenen Dosis 7 bis 10 Tage nach Inoculation des Tumors verabreichte.

Die folgende Tabelle I gibt die Ergebnisse mehrerer Versuche wider, bei denen Mäuse, die transplantierteTumore aufwiesen, mit Erfolg mit einer Verbindung der Formel (1) behandelt wurden. In dieser Tabelle sind in Spalte 1 die Namen der jeweiligen Verbindung, in Spalte 2 der transplantierte Tumor, in Spalte 3 die Dosis oder der Dosierungsbereich sowie die Anzahl der Tage, über die die Dosis verabreicht wurde, und in Spalte 4 die prozentuale Hemmung des Tumorwachstums angegeben.

(ROS ist dabei eine Abkürzung für Ridgeway Osteogenes Sarcoma; GLS für Gardner Lymphosarcoma, und CA 755 ist ein Adenocarcinom.)

Tabelle I
EMI8.1

<tb>
<tb> Verbindung <SEP> Tumor <SEP> Dosis <SEP> Prozent
<tb> mg/kg <SEP> x <SEP> Tage <SEP> Inhibierung
<tb> (a) <SEP> (b) <SEP> (c) <SEP> (d)
<tb> VinbIastin-C-ROS <SEP> 0, <SEP> 1-0, <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 10 <SEP> 23-84 <SEP>
<tb> - <SEP> 3-carboxamidsulfat <SEP> GLS <SEP> 0, <SEP> 05-0, <SEP> 8 <SEP> x <SEP> 8 <SEP> 47-100
<tb> 4- <SEP> Desacetylvinblastin- <SEP> GLS <SEP> 0, <SEP> 15-1, <SEP> 0 <SEP> x <SEP> 10 <SEP> 79-100
<tb> -C-3-earboxamidsulfat <SEP> IROS <SEP> 0, <SEP> 15-0, <SEP> 4 <SEP> x <SEP> 10 <SEP> 49-100
<tb> 4-Desacetylvinblastin-
<tb> - <SEP> C-3-N-äthylcarbox- <SEP> GLS <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 7 <SEP> 90
<tb> amidsulfat <SEP> ROS <SEP> 0, <SEP> 2-0,

<SEP> 4x <SEP> 7 <SEP> 53-100
<tb> 4-Desacetylvinblastin-
<tb> - <SEP> C-3-N-benzylcarbox- <SEP>
<tb> amidsulfat <SEP> ROS <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> x <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> 4-Desacetylvinblastin-
<tb> - <SEP> C-3-N- <SEP> [2-hydroxy- <SEP>
<tb> äthyl] <SEP> -carboxamid- <SEP>
<tb> sulfat <SEP> ROS <SEP> 0, <SEP> 05-0, <SEP> 4 <SEP> x <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> 4-Desacetylvinblastin-
<tb> - <SEP> C-3-N, <SEP> N-dimethylcarboxamidsulfat <SEP> ROS <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> x <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 53
<tb> 4-Desacetylleurosidin-
<tb> - <SEP> C-3- <SEP> carboxamidsuliat <SEP> ROS <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 10 <SEP> 32
<tb> 4-Desacetylvinblastin-
<tb> - <SEP> C-3-N-cyanomethyl- <SEP>
<tb> earboxamidsulfat <SEP> ROS <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> x <SEP> 10 <SEP> 85
<tb>

Die Verbindungen der Formel (I) sind wie Leurocristin und Vinblastin gegenüber Mäusen in Dosen toxisch,

die über denjenigen liegen, die eine 100%ige Inhibierung des transplantierten Tumors ergeben. Aus Gründen, die nicht recht verstanden werden, zeigen alle Heilmittel bei einem vorgegebenen Test unter Einschluss der zum Vergleich herangezogenen Heilmittel, wie Vinblastin, eine Toxizität bei Dosierungen, bei denen sie normalerweise ohne Toxizität eine Tumorinhibierung ergeben. Die in der Tabelle I angeführten Ergebnisse stammen daher von typischen Versuchen, bei denen die Vergleichsheilmittel zu den erwarteten Ergebnissen führen und stellen somit keine Mittelwerte aller Versuche dar.

Die Verbindungen der Formel (I) sind ferner wirksam gegenüber andern transplantierten Tumoren. So führte beispielsweise eine 9 Tage lange parenterale Injektion von 0,25 mg/kg Vinblastin-C-3-N-methylcarb- oxamidsulfat bei Mecca Lymphosarcoma zu einer 54%igen Hemmung des Wachstums, und von Vinblastin-C- - 3-amid zu 28% Hemmung. Bei der gleichen Dosierungshöhe erwies sich Vinblastin selbst als völlig unwirksam.

Bei Studien gegenüber CA 755 Adenocareinoma erhielt man mit 4-Desacetylvinblastin-C-3-carboxamid- sulfat darüber hinaus eine 67%igeInhibierung des Tumorwachstum, mit 4-Desacetylvinblastin-C-3-N- me- thylcarboxamidsulfat eine 61%ige Hemmung, und mit Vinblastin-C-3-carboxamidsulfat eine 49%ige Hemmung bei einer Dosis von 0,25 mg/kg während 8 Tagen und eine 72%ige Hemmung bei einer Dosis von 0,3 mg/kg.

In einem ähnlichen Versuch führte Vinblastin zu einer 31%igen Hemmung, während man mit Leurocristin bei der etwas niedrigeren Dosis von 0, 2 mg/kg eine 79%ige Inhibierung erhielt, u. zw. nach einem hervorragend wirksamen Auswertungssystem. Gegenüber L5178Y lymphociter Leukämie überlebten bei Verwendung von Vinblastin-C-3-carboxamidsulfat in einer Dosis von 0,25 mg/kg während 10 Tagen bei einem Versuch mit 5 Mäusen 3 der Versuchstiere eine unbegrenzt lange Zeit, wobei die Lebensdauer der 2 kranken Mäuse bei diesem Versuch um 26 Tage gegenüber den Vergleichstieren verlängert war. Beim gleichen Versuch erhielt man mit Vinblastin eine 36%ige Verlängerung, wobei es jedoch keine dauernd überlebenden Tiere gab, so dass dieser Wirkstoff nur minimal wirksam ist.

Wie zu erwarten, unterscheiden sich die Amide und die Hydrazide in ihrem Antitumorspektrum von

Vinblastin, Leuroeristin und Leurosin sowie von den C-4-N, N-Dialkylglycylestern von Vinblastin in der gleichen Weise, wie auch die Antitumorspektren dieser Verbindungen selbst untereinander unterschiedlich sind, wobei einige gegenüber bestimmten Tumoren oder Tumorklassen wirksamer sind, und gegenüber andern rumoren wieder weniger wirksam.

Die Amide und Hydrazide lassen sich als antineoplastische Mittel entweder parenteral oder oral verabreichen. Für eine orale Verabreichung vermischt man eine geeignete Menge eines pharmazeutisch unbedenklichen Salzes einer Base der Formel (I), mit Ausnahme derjenigen Verbindungen, bei denen der Substituent R für NH-NH2 oder N3 steht, mit einer nichttoxischen Säure mit Stärke oder einem sonstigen Excipiens, und bringt das Gemisch in teleskopartige Gelatinekapseln, die jeweils 7,5 bis 50 mg Wirkstoff enthalten. In ähn- licherweise kannman das antineoplastische Salz mit Stärke, einem Bindemittel und einem Schmiermittel vermischen, und das Gemisch zu Tabletten verpressen, die jeweils 7,5 bis 50 mg Wirkstoff enthalten. Die Tabletten können gekerbt sein, wenn man kleinere oder geteilte Dosen verwenden möchte.

Bei einer parentera- len Verabreichung wird der intravenöse Weg bevorzugt. Hiezu werden isotone Lösungen verwendet, die 1 bis 10 mg/ml eines Salzes eines Indoldihydroindolamids der Formel (I) enthalten, mit Ausnahme der Hydrazide undAzide. Die Verbindungen werden in Mengen von 0, 1 bis 1 mg/kg Säugetier-Körpergewicht einmal wöchentlich verabreicht, was sowohl von der Wirksamkeit als auch der Toxizität des Heilmittels abhängt. Freie Basen von Verbindungen der Formel (1), bei denen der Substituent R für NH-NH2 oder N3 steht, werden in ähnlicher Weise und in ähnlicher Dosierung zu lagerfähigen Dosierungsformen verarbeitet.

Die meisten Verbindungen eignen sich zwar als antineoplastische oder antivirale Heilmittel, zwei Arten vonDerivaten, nämlich die Hydrazide undAzide [Verbindungen der Formel (1), worin R für NH-NH2 oder N3 steht], lassen sich, wie oben erwähnt, auch als Zwischenprodukte verwenden, da man die Hydrazide durch Umsetzung mit einem Nitrosiermittel in die Azide oder durch Hydrogenolyse in die einfachen Amide umwandeln kann. Das Azid selbst kann man wieder mit primären oder sekundären Aminen umsetzen, wodurch man zu den erfindungsgemäss hergestellten Amiden gelangt.

**WARNUNG** Ende DESC Feld kannt Anfang CLMS uberlappen**.

Claims

PATENTANSPRÜCHE : 1. Verfahren zur Herstellung neuer Amidderivate vonVinblastin, Leurosidinund Leurocristin der Formel EMI9.1 worin EMI9.2 oderNg steht, wobei Alk (Ci-C6) -Alkyl bedeutet, Am für NH2'NHCH3 oder N (CH,), steht, X Wasserstoff, Cyano, Phenyl, Carboxyl (COOH), Carbo- (C1-C3) -alkoxy oder Carbox- amido (CO-NH2) bedeutet, R'für Wasserstoff oder Acetyl steht, R"Wasserstoff, (C -Cg)-Alkyl, Formyloder (C -C.)-Alkanoyl bedeutet, <Desc/Clms Page number 10> und einer der Substituenten R In oder R In, für Hydroxyl steht und der andere Äthyl bedeutet, und ihrer Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet,

dass man eine Verbindung der Formel (I), worin R für 0-CH3 steht, R'Wasserstoff oder Acetyl bedeutet und R R'" sowie R"" obige Bedeutung haben, mit Hydrazin umsetzt und die so erhaltene Verbindung mit einem Nitrosiermittel und mit einer Verbindung der Formel EMI10.1 EMI10.2 Alk für (C,-c,)-Alkyl steht und Am und X die oben angegebene Bedeutung haben, und gewünschtenfalls eine so erhaltene Verbindung mit einer nichttoxischen anorganischen oder organischen Säure in ein Säureadditionssalz überführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von 4-Desacetylvinblasti-C-3-carboxazid, dadurch gekennzeichnet, dass man 4-Desacetylvinblastin-C-3-carboxhydrazid mit Natriumnitrit in Gegenwart von Methanol und Chlorwasserstoffsäure umsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von 4-Desacetylvinblastin-C-3-N-äthylcarboxamid, dadurch gekennzeichnet, dass man 4-Desacetylvinblastin-C-3-carboxazid mit wasserfreinem Äthylamin in Gegenwart von Methylendichlorid umsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von 4-Desacetylvinblastin-C-3-N-isopropylcarboxamid, EMI10.3 pylamin in Gegenwart von Methylendichlorid umsetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von 4-Desacetylvinblastin-C-3-N, N-dimethylcarboxamid, dadurchgekennzeichnet, dassman4-Desacetylvinblastin-C-3-carboxazidmitwasserfreiemN,N-Dimethylamin in Gegenwart von Methylendichlorid umsetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von 4-Desacetylvinblastin-C-3-N- [2- (N, N-dimethylami- noäthyl) ]-carboxamid,dadurchgekennzeichnet,dassman4-Desacetylvinblastin-C-3-carboxazidmit N, N-Dimethyläthylamin in Gegenwart von Methylendichlorid umsetzt.

7. VerfahrennachAnspruchlzurHerstellungvon4-Desacetylvinblastin-C-3-N-benzylearboxamid, dadurch gekennzeichnet, dass man 4-Desacetylvinblastin-C-3-carboxazid mit Benzylamin in Gegenwart von Methylendichlorid umsetzt.

8. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von 4-Desacetylvinblastin-C-3-N-cyanomethylcarboxamid, dadurch gekennzeichnet, dass man 4-Desacetylvinblastin-C-3-carboxazid mit Cyanomethylamin in Gegenwart von Methylendichlorid umsetzt.

9. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von 1-Desformyl-4-desacetylleurocristin-C-3-N-äthyl- EMI10.4 hydrazid mit Natriumnitrit in verdünnter Salzsäure unter Bildung von l-Desformyl-4-desacetylleurocristin- - C-3-carboxazid umsetzt und dieses Carboxazid mit Äthylamin in Gegenwart von Methylendichlorid umsetzt.

10. Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung von 4-Desacetylleurosidin-C-3-amid, dadurch gekennzeichnet, dass man 4-Desacetylleurosidin-C-3-carboxhydrazid mit Natriumnitrit umsetzt und das erhaltene Azid mit mit Ammoniak gesättigtem Methanol bei erniedrigter Temperatur zur Reaktion bringt.