DE2540134B2

DE2540134B2 - L-Phenylalaninderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE2540134B2
Application number: DE2540134A
Authority: DE
Inventors: Yakir Klausner; Pierre Lefrancier; Meir Rigbi; Edgar Sache
Original assignee: Choay SA; Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Choay SA; Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1974-09-09
Filing date: 1975-09-09
Publication date: 1978-03-30
Also published as: FR2283888B1; GB1526558A; DE2540134A1; FR2283888A1; CH615903A5; CH612930A5; DE2540134C3; GB1526557A; US4118575A; JPS5152152A

Description

H₂N—C — NH

NH

mit Methanol verestert.
3. Verwendung der Verbindungen gemäß Anspruch 1 zur Trypsinbestimmung.

Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Als Salz des Methylesters des Tosyl-p-guanidino-L-phenylalanins kommt beispielsweise das Hydrochlorid in Betracht.

Die Verbindung und ihre Salze sind Substrate für Trypsin und stellen somit wertvolle Reagenzien zur Bestimmung von Trypsin dar.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

A) Herstellung des tert.-Butyloxycarbonylderivats
des pGuanidino-L-phenylalanins

Man löst 3,10 g (10 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-pnitrophenylalanin in 80 ml Methanol, das mit 0,6 ml Essigsäure versetzt ist. Man hält die Lösung bei einer Temperatur von O⁰C bis 5° C und hydriert sie während 3 Stunden in Gegenwart von 500 mg eines Katalysators, der aus 10% Palladium-auf-Kohlenstoff besteht. Nachdem die Reduktion der Nitrogruppen in die Aminogruppen erfolgt ist, filtriert man den Katalysator ab und entfernt das Lösungsmittel durch Destillation im Vakuum. Der Rückstand wird in Gegenwart von P₂Os und NaOH getrocknet. Die Reaktion ist quantitativ.

Man löst das erhaltene Produkt in 20 ml Tetrahydrofuran und setzt nach und nach 3,1 ml (19 mMol) Diisopropyläthylamin und 3 g (15 mMol) 1-Guanidino-3,5-dimethylpyrazol-nitrat zu. Man erhitzt die Mischung während 12 Stunden zum Sieden am Rückfluß, wonach man das Lösungsmittel durch Destillation im Vakuum entfernt. Den Rückstand versetzt man mit. 50 ml Methanol und 2,5 ml Essigsäure. Das Produkt wird während mehrerer Stunden in einen Kühlschrank eingebracht. Das in dieser Weise erhaltene kristallisierter Produkt wird abfiltriert, mehrfach bei niedriger Temperatur mit Methanol gewaschen und mit trockener Luft getrocknet.

Man erhält 2,6 g (Ausbeute = 81%) tert.-Butyloxycarbonyl-p-guanidino-L-phenylalanin. Das Produkt besitzt die folgenden physikalischen Kenndaten:

Elementaranalyse Ci₅H₂₂O₄N₄ · '/2 H₂O:

Gefunden: C 54,58, H 7,20, N 16,60%;
berechnet: C 54,45, H 6,99, N 16,91%.

Schmelzpunkt= 198⁰C bis 200⁰C,
[et]?- +28° (c=\;H₂O),
Dünnschichtchromatographie: Rr = 0,55.

Das Produkt zeigt eine positive Reaktion beim Sakaguchi-Test (violette Färbung), eine positive UV-Reaktion und eine negative Ninhydrin-Reaktion (die Reaktion wird positiv, wenn man den Flecken erhitzt).

B) Herstellung von p-Guanidino-L-phenylalanin

4^r) Man trägt 200 mg tert.-Butyloxycarbonyl-p-guanidino-L-phenylalanin in 2 ml einer Trifluoressigsäure/Essigsäure/Anisol-Mischung (7/3/1) ein.

Nach 25 Minuten entfernt man die Säuren im Vakuum, gibt 50 ml trockenen Äther zu, filtriert den

ίο Niederschlag, wäscht ihn mit trockenem Äther und trocknet ihn im Vakuum in Gegenwart von P₂O₅ und NaOH. Man läßt das gesamte Produkt (200 mg) in 5 ml Essigsäure. Dann gibt man 415 mg Pikrinsäure zu und trennt das Produkt nach kurzer Zeit ab. Das Produkt

Ti wird abfiltriert, mit Essigsäure und trocknenem Äther gewaschen und schließlich im Vakuum in Gegenwart von P2O5 und NaOH getrocknet.

Man erhält 120 mg (Ausbeute = 41 %) p-Guanidino-L-phenylalanin (Monopikrat, Halbacetat, Halbhydrat),

w) dessen charakteristische Kenndaten die folgenden sind:

Ci₀Hi₄O₂N₄ · C₆H₃O₇N₃ · V₂ CH₃COOH · V₂ H₂O:

Gefunden: C41,65, H N 19,80%;

berechnet. C 41,65, H 4,19, N 19,74%.

^hr> Schmelzpunkt= 141°C bis 143⁰C

(Erweichung bei 135°C),
[ot]»= +6° fc=0,5:50%ige Essigsäure).

C) Herstellung von
Tosyl-p-guanidino-L-phenyl-alanin

Man löst 993 mg (3 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-pguanidino-L-phenylalanin in 6 ml 5 n-Chlorwasserstoffsäure. Nach 5 Minuten setzt man 15 ml Essigsäure zu und bewirkt eine Gefriertrocknung der Mischung. Der Rückstand wird in 6 ml 1 n-Natriumhydroxidlösung gelöst. Man gibt 10 ml Tetrahydrofuran und dann 600 mg Tosylchlorid, gelöst in 10 ml Tetrahydrofuran, zu, was man durch fünf Zugaben bewirkt, die im Verlaufe von 1 Stunde erfolgen. Man hält den pH-Wert der Mischung mit Hilfe von 1 n-Natriumhydroxidlösung auf einem Wert zwischen 8,5 und 9. Nach 2 Stunden stellt man den pH-Wert mit Hilfe von Essigsäure auf einen pH-Wert zwischen 5 und 6 ein und vertreibt das Lösungsmittel im Vakuum. Man beläßi das Produkt während 12 Stunden bei O⁰C, filtriert dann ab, wäscht mit Wasser und trocknet in Gegenwart von P₂O₅.

Man erhält 470 mg eines Produktes, dessen Schmelzpunkt 275° C bis 276° C beträgt (Dünnschichtchromatogramm: Rf-Wert = 0,51). Das erhaltene Filtrat wird im Vakuum eingeengt, wonach man das Wasser abdekantiert und 1 ml Methanol zusetzt. Es erfolgt die Kristallisation des Produktes. Man setzt 5 ml Wasser zu und beendet nach einigen Stunden die oben beschriebene Aufarbeitung. Man erhält in dieser Weise 270 mg einer Verbindung mit einem Schmelzpunkt von 274° C bis 275° C. Die Gesamtausbeute (740 mg) des Produktes beträgt 63%.

Zur Analyse nimmt man das Produkt in Methanol auf und versetzt mit Wasser. Das Produkt wird erneut filtriert und dann während 4 Stunden bei 100° C in einem starken Vakuum getrocknet.

Die Kenndaten des erhaltenen Produkts sind die folgenden:

ElementaranalyseC₇H₂₀O₄N₄S · V₂CH₃OH:

Gefunden: C 53,65, H 5,45, N 14,30, S 8,30%;
berechnet: C 53,5, H 5,65, N 14,28, S 8,17%.

Schmelzpunkt = 275°C bis 276°C,

[α] % = + 24° (c= 1; 80%ige Essigsäure).

Beispiel 2

Herstellung des Hydrochlorids des p-Toluolsulfonyl-p-guanidino-L-phenylalanin-methylesters

Man suspendiert 392 mg (1 mMol) des gemäß Beispiel 1 hergestellten Produkts in 15 ml Methanol. Dann leitet man während einer Stunde gasförmigen Chlorwasserstoff in die Lösung ein und läßt die Mischung während

ίο 12 Stunden stehen. Anschließend engt man im Vakuum ein und setzt 50 ml trockenen Äther zu. Man kühlt die Mischung während einiger Stunden, dekantiert dann den Äther ab und trocknet den Rückstand in Gegenwart von P₂O₅ und NaOH im Vakuum. Das Produkt wird

ι -, durch Chromatographie über eine Säule, die im Handel unter der Bezeichnung Sephadex LH-20 (Abmessungen 4 χ 90 cm) erhältlich ist, gereinigt, wozu man Methanol als Elutionsmittel verwendet. Man bewirkt einen Durchsatz von 20 ml pro Stunde. Die Fraktionen werden automatisch in Abhängigkeit von dem UV-Spektrum getrennt, wobei jede Fraktion 280 nm entspricht. Die Fraktionen 135 bis 146 enthalten das gewünschte Produkt, was durch die Dünnschichtchromatographie ersichtlich ist. Man vereinigt die Fraktionen, verdampft das Lösungsmittel und trocknet den Rückstand im Vakuum in Gegenwart von P₂Os. Man erhält 290 mg eines amorphen Produkts (Dünnschichtchromatogramm: Rf-Wert = 0,60).

Elementaranalyse: Ci₈H₂₂O₄N₄S · HCl:

Gefunden: C 50,80, H 5,90, N 12,80%;
berechnet: C 50,63, H 5,43, N 13,12%.

[«]?? = + 35° (c= 1; Methanol)

r, Der p-Toluolsulfonyl-p-guanidino-L-phenylalaninmethylester hat sich als ein ausgezeichnetes Substrat für Trypsin erwiesen. Die Aktivität dieses Produkts als Substrat ist etwa dreimal so groß wie die üblicherweise für diesen Zweck verwendete Verbindung, der Methyl-

4(1 ester von Toluolsulfonylarginin (TAME). Dies wird durch die folgenden Werte der Konstanten K. cat und Km ersichtlich, die ein Maß für die »Substrataktivität« darstellen.

K.cat

Km

Methylester des Tosyl-p-guanidino-L-phenylalanins

Methylester des Toluolsulfonylarginins (TAME) gemäß T. E. Barman,

(»Enzyme Handbook«, Springer-Verlag, Vol. II, 1969) 413 Sek."¹
147 Sek.'¹

5,45 ■ ΙΟ"⁵ Μ
5 · 1(Γ⁵ Μ

Das erfindungsgemäße Produkt ist somit für die Bestimmung von Trypsin sehr gut geeignet.

Claims

Patentansprüche: .1. Methylester des Tosyl-p-guanidino-L-phenylalanins der Formel I

CH₁-CH-NH-SO₂

CO₁CH.,

und deren Säuresalze.
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise Tosyl-p-guanidino-L-phenylalanin der Formel II