DE2540134A1

DE2540134A1 - L-phenylalaninderivate und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2540134A1
Application number: DE19752540134
Authority: DE
Inventors: Yakir Klausner; Pierre Lefrancier; Meir Rigbi; Edgar Sache
Original assignee: Choay SA; Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Choay SA; Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1974-09-09
Filing date: 1975-09-09
Publication date: 1976-03-25
Also published as: FR2283888B1; JPS5152152A; DE2540134C3; FR2283888A1; GB1526557A; CH612930A5; US4118575A; CH615903A5; GB1526558A; DE2540134B2

Description

Patentanwälte Dipl.-Inc-. F. Wfic kvwn,

Dipl.-Ing. H.Weickmann, Dipl.-Phys. Dr.K.Fincke Dipl.-Ing. F. A.Weιckmann, Dipl.-Chem. B. Huber

8 MÜNCHEN 86, DEN

POSTFACH 860 820

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 3921/22

HtM/th

Case DE/FZ-O464-75-B

CHOAY S.A., 48, Avenue Theophile Gautier, 75782 Paris Cedex 16 / Frankreich

und

YISSUM RESEARCH DEVELOPMENT COMPANY OF THE HEBREW UNIVERSITY OF JERUSALEM, Truman Building, Mount Scopus, Jerusalem / Israel

L-Phenylalaninderivate und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Die Erfindung betrifft L-Phenylalaninderivate und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Sie betrifft insbesondere den Methylester des Tosyl-p-guanidino-L-phenylalanins der Formel I

\-U V~

H₀N - C - NHHf/ V-CH₀ - CH - NH - SO_n-// V-CH.. (I)

NH ^N ' CO₂CH₃

sowie die Salze, beispielsweise das Hydrochlorid, dieser neuen Verbindung.

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Diese Verbindung und ihre Salze sind sehr wirksame Substrate für Trypsin und stellen somit sehr wertvolle Laboratoriumsreagenzien zur Bestimmung von Trypsin dar.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Tosyl-p-guanidino-L-phenylalanin der Formel II

H₂N - C - NH-V V-CH₀ - CH - NH - SO_n-V V~ CH, (II) NH

mit Methanol verestert.

Die Erfindung betrifft ferner neue Derivate des L-Phenylalanins, die sehr.wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung anderer Produkte, insbesondere des Produkts der Formel II darstellen.

Diese Verbindungen entsprechen der folgenden allgemeinen Formel

H₉N - C - NH -V M— CH₉ - CH - NH - R₁ ■^11 \ /^i '

NH ^Λ ' CO₂H

in der R₁ entweder ein Wasserstoffatom oder eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe bedeutet. Eine besonders bevorzugte Verbindung dieser Art ist das tert.-Butyloxycarbonylderivat des p-Guanidino-L-phenylalanins, das der folgenden Formel III

H₂N - C - NH-V y-CHo - CH - NH - CO - O - C(CH-,) _o (III) NH ^ ^J CO₂H

entspricht.

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Gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren bereitet man die Verbindung der Formel III durch Reduktion von p-Nitrophenylalanin, dessen Aminogruppe man zuvor mit einer tert.-Butyloxycarbonylgruppe aeschützt hat, um die Nitrogruppe indie Aminogruppe zu reduzieren, und durch Umsetzen des erhaltenen Derivats mit einem Guanidiermittel, beispielsweise 1-Guanidino-3,5-dimethylpyrazol-nitrat.

Die genannte Reduktion erfolgt vorteilhafterweise mit Wasserstoff in Gegenwart eines Katalysators.

Wenn man bei der Guanidierungsreaktion zufriedenstellende Ausbeuten erzielen will, ist es wichtig, sie in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel, in Gegenwart einer als Katalysator dienenden organischen Base und bei einer Temperatur oberhalb 5O°C, vorzugsweise bei der Rückflußtemperatur des Lösungsmittels, zu bewirken.

Die Verbindung der Formel III ist ein nützliches Zwischenprodukt zur Herstellung anderer industrieller Produkte, beispielsweise zur Herstellung der Verbindung der Formel I über das Zwischenprodukt der Formel II.

Insbesondere wird die Verbindung der Formel III"nach dem Abspalten der tert.-Butyloxycarbonylgruppe, was insbesondere durch saure Hydrolyse erfolgt, durch Einwirkung eines Tosylhalogenids, beispielsweise Tosylchlorid, in die Verbindung der Formel II überführt.

p-Guanidino-L-phenylalanin der Formel IV

H₀N - C - NH -</ V-CH-, - CH - NH₀ (IV)

NH ^N ' CO₂H

erhält man ausgehend von der Verbindung der Formel III, insbesondere durch saure Hydrolyse. Diese Verbindung stellt ihrerseits ein interessantes Synthesezwischenprodukt dar. Insbesondere kann man aus dieser Verbindung durch Umsetzen mit einem

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Tosylhalogenid die Verbindung der Formel II bereiten.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Herstellung des tert.-Butyloxycarbonylderxvats des p-Guanidino-L-phenylalanins.

Man löst 3,10 g (10 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-p-nitrophenylalanin in 80 ml Methanol, das mit 0,6 ml Essigsäure versetzt ist. Man hält die Lösung bei einer Temperatur von 0°C bis 5⁰C und hydriert sie während 3 Stunden in Gegenwart von 500 mg eines Katalysators, der aus 10% Palladium-auf-Kohlenstoff besteht. Nachdem die Reduktion der Nitrogruppen in die Aminogruppen erfolgt ist, filtriert man den Katalysator ab und entfernt das Lösungsmittel durch Destillation im Vakuum. Der Rückstand wird in Gegenwart von P2°5 ^{und Na0H} getrocknet. Die Reaktion ist quantitativ.

Man löst das erhaltene Produkt in 20 ml Tetrahydrofuran und setzt nach und nach 3,1 ml (19 mMol) Dxisopropyläthylamin und 3g (15 mMol) 1-Guanidino-3,5-dimethylpyrazol-nitrat zu. Man erhitzt die Mischung während 12 Stunden zum Sieden am Rückfluß, wonach man das Lösungsmittel durch Destillation im Vakuum entfernt. Den Rückstand versetzt man mit 50 ml Methanol und 2,5 ml Essigsäure. Das Produkt wird während mehrerer Stunden in einen Kühlschrank eingebracht. Das in dieser Weise erhaltene kristallisierte Produkt wird abfiltriert, mehrfach bei niedriger Temperatur mit Methanol gewaschen und mit trockener Luft getrocknet.

Man erhält 2,6 g (Ausbeute = 81%) tert.-Butyloxycarbonyl-pguanidino-L-phenylalanin. Das Produkt besitzt die folgenden physikalischen Kenndaten: Elementaranalyse C₁₅H₃₂O₄N₄·1/2 H~0:

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	54	C	7	H	1	6	N
gefunden:	54	,58	6	,20	1	6	,60
berechnet:	/45	/99		/91

Schmelzpunkt = 198°C bis 2OO°C
/M7q⁵ - +28° ( c = 1; H₂O)
Dünnschichtchromatographie: R_f = 0,55

Das Produkt zeigt eine positive Reaktion beim Sakaguchi-Test (violette Färbung), eine positive UV-Reaktion und eine negative Ninhydrin-Reaktion (die Reaktion wird positiv, wenn man den Flecken erhitzt).

Beispiel 2

Herstellung von p-Guanidino-L-phenylalanin

Man trägt 2OO mg tert.-Butyloxycarbonyl-p-guanidino-L-phenylalanin in 2 ml einer Trifluoressigsäure/Essigsäure/Anisol-Mischung (7/3/1) ein.

Nach 25 Minuten entfernt man die Säuren im Vakuum, gibt 50 ml trockenen Äther zu, filtriert den Niederschlag, wäscht ihn mit trockenem Äther und trocknet ihn im Vakuum in Gegenwart von P₃O₅ und NaOH. Man löst das gesamte Produkt (200 mg) in 5 ml Essigsäure. Dann gibt man 415 mg Pikrinsäure zu und trennt das Produkt nach kurzer Zeit ab. Das Produkt wird abfiltriert, mit Essigsäure und trockenem Äther gewaschen und schließlich im Vakuum in Gegenwart von P9O5 und NaOH getrocknet.

Man erhält 120 mg (Ausbeute = 41%) p-Guanidino-L-phenylalanin (Monopikrat, Halbacetat, Halbhydrat), dessen charakteristische Kenndaten die folgenden sind:

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C₁-H₄ .0,Ir₁-C^H-O-N₀'1/2 CH-.COOH-1/2 H₀O:

C HN

gefunden: 41,65 19,80 %

berechnet: 41,65 4,19 19,74 ^%

Schmelzpunkt = 141⁰C bis 143°C (Erweichung bei 135°C)

2 R
/oC7_D = +6° (c = 0,5; 50%ige Essigsäure)

Beispiel 3

Herstellung von Tosyl-p-Guanidino-L-phenyl-alanin.

Man löst 993 mg (3 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-p-guanidino-L-phenylalanin in 6 ml 5n-Chlorwasserstoffsäure. Nach 5 Minuten setzt man 15 ml Essigsäure zu und bewirkt eine Gefriertrocknung der Mischung. Der Rückstand wird in 6 ml In-Natriumhydroxidlösung gelöst. Man gibt 10 ml Tetrahydrofuran und dann 600 mg Tosylchlorid, gelöst in 10 ml Tetrahydrofuran, zu, was man durch fünf Zugaben bewirkt, die im Verlaufe von 1 Stunde erfolgen. Man hält den pH-Wert der Mischung mit Hilfe von In-Natriumhydroxidlösung auf einem Wert zwischen 8,5 und 9. Nach 2 Stunden stellt man den pH-Wert mit Hilfe von Essigsäure auf einen pH-Wert zwischen 5 und 6 ein und vertreibt das Lösungsmittel im Vakuum. Man beläßt das Produkt während 12 Stunden bei 0°C, filtriert dann ab, wäscht mit Wasser und trocknet in Gegenwart von P^Oj-.

Man erhält 470 mg eines Produktes, dessen Schmelzpunkt 275°C bis 276°C beträgt (Dünnschichtchromatogramm: R^-Wert = 0,51). Das erhaltene FiItrat wird im Vakuum eingeengt, wonach man das Wasser abdekantiert und 1 ml Methanol zusetzt. Es erfolgt die Kristallisation des Produktes. Man setzt 5 ml Wasser zu und beendet nach einigen Stunden die oben beschriebene Aufarbeitung. Man erhält in dieser Weise 270 mg einer Verbindung mit einem Schmelzpunkt von 274°C bis 275°C. Die Gesamtausbeute (740 mg) des Produktes beträgt 63%.

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Zur Analyse nimmt man das Produkt in Methanol auf und versetzt mit Wasser. Das Produkt wird erneut filtriert und dann während 4 Stunden bei 1OO°C in einem starken Vakuum getrocknet.

Die Kenndaten des erhaltenen Produkts sind die folgenden:

Elementaranalyse ^ci7^H2o°4^N4^S *¹^^{2 CH}3^0H:

C H NS

gefunden: 53,65 5,45 14,30 8,30 %

berechnet: 53, 5 5,65 14,28 8,17 %

Schmelzpunkt = 275°C bis 276°C,

= +24° (c = 1; 80%ige Essigsäure).

Beispiel 4

Herstellung des Hydrochlorids des p-Toluolsulfonyl-p-guanidino-L-phenylalanin-methylesters.

Man suspendiert 392 mg (1 mMol) des gemäß Beispiel 3 hergestellten Produkts in 15 ml Methanol. Dann leitet man während einer Stunde gasförmigen Chlorwasserstoff in die Lösung ein und läßt die Mischung während 12 Stunden stehen. Anschließend engt man im Vakuum ein und setzt 50 ml trockenen Äther zu. Man kühlt die Mischung während einiger Stunden, dekantiert dann den Äther ab und trocknet den Rückstand in Gegenwart von P₃O₅ und NaOH im Vakuum. Das Produkt wird durch Chromatographie über eine Säule, die im Handel unter der Bezeichnung Sephadex LH-20 (Abmessungen 4 χ 90 cm) erhältlich ist, gereinigt, wozu man Methanol als Elutionsmittel verwendet. Man bewirkt einen Durchsatz von 20 ml pro Stunde. Die Fraktionen werden automatisch in Abhängigkeit von dem UV-Spektrum getrennt, wobei jede Fraktion 280 nm entspricht. Die Fraktionen 135 bis 146 enthalten das gewünschte Produkt, was durch die Dünnschichtchromatographie ersichtlich ist. Man vereinigt diese Fraktionen, verdampft das Lösungsmittel und trocknet den Rückstand im Vakuum in Gegenwart von P₂ ⁰C- ^Man erhält 290 mg eines amorphen Produkt (Dünnschichtchromatogramm: R_f-Wert = 0,60).

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Elementaranalyse C₁₈H₂₂O₄N₄S

C HN

gefunden: 50,80 5,90 12,80 %

berechnet: 50,63 5,43 13,12 % Λ*7^⁵ = +35° (c=1; Methanol)

Der p-Toluolsulfonyl-p-guanidino-L-phenylalanin-methylester hat sich als ein ausgezeichnetes Substrat für Trypsin erwiesen. Die Aktivität dieses Produkts als Substrat ist etwa dreimal so groß wie die üblicherweise für diesen Zweck verwendete Verbindung, der Methylester von Toluolsulfonyl-arginin (TAME). Dies wird durch die folgenden Werte der Konstanten K.cat und Km ersichtlich, die ein Maß für die "Substrataktivität" darstellen.

K.cat Km

Methylester des Tosyl-p-guanidino- 413 Sek" 5,4 5 χ 10 M L-phenylalanins

-1 -5

Methylester des Toluolsulfonyl- 147 Sek 5 χ 10 M arginins (TAME) gemäß T.E.Barman,
"Enzyme Handbook", Springer-Verlag, Vol. II, 1969)

Das erfindungsgemäße Produkt ist somit für die Bestimmung von Trypsin sehr gut geeignet.

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Claims

254Q13A

Patentansprüche

'Ί . Methylester des Tosyl-p-guanidino-L-phenylalanins der Formel I

H„-CH - NH - SO

CO₂CH₃
2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form eines Säuresalzes vorliegt.
3. Tosyl-p.-guanidino-L-phenylalanin-methylester-hydrochlorid.
4. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Tosylp-guanidino-L-phenylalanin der Formel II

H₉N - C - NH-// V-CH₀ - CH - NH - SO;// V~CH, (II)

NH \=/ CO₂H

mit Methanol verestert.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Veresterung in Gegenwart von Chlorwasserstoffsäure bewirkt und direkt das Hydrochlorid des Tosyl-p-guanidino-L-phenylalanin-methylesters gewinnt.
6. Verwendung der Verbindungen gemäß den Ansprüchen 1, 2 oder als Trypsinsubstrat.
7. p-Guanidino-L-phenylalaninderivate der allgemeinen Formel H„N -C- NH-^/ V-CH₀ - CH - NHR₁

NH ^ ' CO₂H

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in der R- ein Wasserstoffatom oder eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe bedeutet.
8. Verbindung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppe R₁ eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe bedeutet.
9. Verbindung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppe R₁ ein Wasserstoffatom darstellt.
10. Verfahren zur Herstellung der p-Guanidino-L-phenylalaninderivate der allgemeinen Formel

H₀N -C - NH-</ V~CH„ - CH - NHR₁

NH ^N ' CO₂H

in der R.. ein Wasserstoff atom oder eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man p-Nitrophenylalanin, dessen Aminogruppe man zuvor mit einer tert..-Butyloxycarbonylgruppe geschützt hat, zur Umwandlung der Nitrogruppe in eine Aminogruppe reduziert und das erhaltene Derivat mit einem Guanidinierungsmittel wie 1-Guanidino-3,5-dimethylpyrazol, zu einem Derivat der oben angegebenen allgemeinen Formel umsetzt, in der R. eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe darstellt, das man gewünschtenfalls, insbesondere durch saure Hydrolyse, in eine Verbindung der obigen allgemeinen Formel umwandeln kann, in der R₁ ein Wasserstoffatom darstellt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reduktion mit Wasserstoff in Gegenwart eines Hydrierkatalysators bewirkt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 11, d a durch gekennzeichnet, daß man die

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25A013A

Guanidxnierung in einem wasserfreien organischen Lösungsmittel, in Gegenwart einer als Katalysator dienenden organischen Base und bei einer Temperatur oberhalb 50°C, vorzugsweise bei der Rückflußtemperatur des Lösungsmittels, bewirkt,

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