CH639356A5 - (14-c14)-dauno- und doxorubicin und verfahren zu deren herstellung. - Google Patents

Description

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PATENTANSPRÜCHE

1. [14-I4C]-Daunorubicin.

2. [14-14C]-Doxorubicin.

3. Verfahren zur Herstellung von [14-14C]-Daunorubicin oder dessen Salz, dadurch gekennzeichnet, dass man 9-De-acetyl-9-formyl-N-trifluoracetyIdaunorubicin, gelöst in einem aprotischen organischen Lösungsmittel, bei Zimmertemperatur 60 Minuten lang unter Vakuum mit [14C]-Diazo-methan umsetzt, wobei (14-14C]-N-Trifluoracetyl-daunorubicin erhalten wird, dieses durch Chromatographie auf einer Silikagelsäule reinigt und durch Hydrolyse die N-Trifluoracetylschutzgruppe abspaltet, wobei man [14-14C]-Daunorubicin in Form der gewünschten freien Base erhält, die nach Behandlung mit der stöchiometrischen Menge Chlorwasserstoff in Methanol als Hydrochlorid isoliert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,

dass man als aprotisches organisches Lösungsmittel Methylenchlorid oder Diäthyläther verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Schutzgruppe mit einer wässrigen 0,ln Na-

s trium- oder Ammoniumhydroxyd-Lösung bei 0-5 °C während 30-60 Minuten abspaltet.

6. Verwendung des gemäss Verfahren nach Anspruch 3 erhaltenen [14-14C]-Daunorubicins zur Herstellung von [14-14C]-Doxorubicin, dadurch gekennzeichnet, dass man io das erhaltene [14-I4C]-Daunorubicin zum entsprechenden 14-Bromderivat bromiert und dieses zum [14-14Q-Doxoru-bicin hydrolysiert und das erhaltene Produkt als Hydrochlorid isoliert.

7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeich-i5 net, dass man mit einer wässrigen Natriumformiatlösung bei

Zimmertemperatur während 100 Stunden hydrolysiert.

Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind [14-14C]-Daunorubicin und [14-14C]-Doxorubicin sowie die in den Patentansprüchen 3 und 6 definierten Verfahren zu deren Herstellung.

Die erfindungsgemässen, markierten Verbindungen sind sehr wichtig, um die Verteilung, die Pharmakokinetik und den Metabolismus dieser Antitumormittel studieren zu können.

[I4-,4C]-Daunorubicin und [14-14C]-Doxorubicin sind bisher niemals synthetisiert worden; das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht die Überführung des C-Atoms von [,4C]-Methylamin in das 14-Kohlenstoffatom der Antitu-morglycoside in hoher Ausbeute. Tritiiertes Daunorubicin und Doxorubicin sind bereits synthetisiert worden (Int. Symposium on Adriamycin. S.K. Carter, A. Di Marco, M. Ghione, J.H. Kratoff und G. Mathe, Springer-Verlag, Berlin, S. 9,1972); sie wurden für eine Vielzahl von biochemischen und medizinischen Studien verwendet. Sie finden jedoch wegen des Austausches des Tritiums in Körperflüssigkeiten und in gepufferten Lösungen nur beschränkt Verwendung. Die neuen radioaktiven 14C-markierten Verbindungen sind nun wegen der Stabilität der Markierung und der hohen spezifischen Aktivität sowohl für experimentelle als auch für medizinische Zwecke verwendbar.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der genannten Verbindungen beruht auf der Reaktion von 9-Deacetyl-9-formyl-N-trifIuoracetyldaunorubicin (II), das aus 13-Dihydro-N-trifluoracetyIdoxorubicin (I) durch Perjodatoxydation von C-13, C-14-Diol (siehe US-PS 4 146 616) erhältlich ist, mit [14C]-Diazomethan.

Die Überführung der Verbindung (II) in die Verbindung (III) erfolgt unter Verwendung einer Vakuumverteilerleitung, wie sie in Fig. 1 dargestellt ist. In dieser Fig. 1 bedeuten:

1 den Kolben, der wässrige KOH 50% enthält,

2 den Reaktionskolben zur Herstellung von I4CH2N2 aus N-Nitroso-[' 4C]-N-methylharnstoff,

3 den Kolben zur Gewinnung von 14CH2N2 in ätherischer Lösung,

4 den Kolben zur Gewinnung von 14CH2N2 in Äther/ CH2C12 (1:1, V/V),

5, 6,7 die Kolben, die 9-Deacetyl-9-formyI-N-trifluor-acetyldaunorubicin (II) enthalten,

8 den Kolben zur Lösungsmittelrückgewinnung.

Drei Teile des Aldehyds (II) in festem Zustand werden in die Kolben 5,6 und 7 eingebracht und bei Zimmertemperatur und unter Vakuum mit [14C]-Diazomethan in einem geeigneten Medium, wie Methylenchlorid und/oder Diäthyläther oder einem anderen aprotischen organischen Lösungsmittel, behandelt. Genauer gesagt wird die ätherische Lösung des *CH2N2, die im Kolben 2 gebildet wird, im Kolben 3 destilliert und dann in den Kolben 4 übergeführt, der ein gleiches Volumen CH2C12 oder CHC13 enthält. Schliesslich wird die organische Lösung des Reagens durch Destillation in den Kolben 5 übergeführt, der das Substrat enthält. Am Ende der Reaktion (60 Minuten bei Zimmertemperatur)

wird der Überschuss an *CH2N2 im Kolben 6 destilliert, um mit dem zweiten Teil des Substrats zu reagieren. Das radioaktive Mittel wird im Kolben 7 komplett verbraucht. Die Lösungsmittel werden schliesslich im Kolben 8 wiedergewonnen. Dieses Verfahren ermöglicht die völlige Bindung der Radioaktivität an das Substrat, so dass die Ausbeute an [I4-14C]-N-Trifluoracetyldaunorubicin (III) optimal ist. Das vereinigte Rohprodukt wird vorzugsweise vor der darauffolgenden alkalischen Behandlung gereinigt. Die Reinigung erfolgt durch chromatographische Trennung unter Verwendung präparativer Silikagelplatten oder einer Kiesel-säuresäule, wobei das Eluierungssystem aus einer Mischung von Chloroform und Aceton im Verhältnis 4:1 (Vol.) besteht. Die milde alkalische Behandlung des reinen N-Tri-fluoracetyldaunorubicins (die zur Hydrolyse der Schutzgruppe durchgeführt wird) erfolgt zweckmässig bei 0 bis 5 °C wässrigem 0,ln Natriumhydroxyd oder Ammoniumhydroxyd während eines Zeitraumes von 30 bis 60 Minuten. Das Glycosid wird als Hydrochlorid zweckmässig auf folgende Weise gewonnen: die alkalische Lösung wird mit 0,5n Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und zur Entfernung der Aglycone mit Chloroform extrahiert. Dann wird die Lösung auf einen pH-Wert von 8,5 gebracht und wiederholt mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden im Vakuum auf ein kleines Volumen eingedampft und die stöchiometrische Menge Chlorwasserstoff in Methanol zugegeben, wobei das [14-14C]-Daunorubicinhydro-chlorid erhalten wird.

Die radiochemische Ausbeute, bezogen auf [14C]-Methylamin. HCl, den Vorläufer von [14C]-Diazomethan über N-Nitroso-N-[14C]-methylharnstoff, beträgt etwa 10%. Die Herstellung von [I4-14CJ-Doxorubicin erfolgt gemäss dem in der US-PS 3 803 124 für die chemische Überführung von Daunorubicin in Doxorubicin beschriebenen Verfahren. Die Behandlung der Verbindung (IV) mit Brom ergibt das entsprechende [14-14C]-I4-Bromderivat, das durch Hydrolyse in das [14-14CJ-Doxorubicin (V) übergeführt wird.

30

35

40

45

50

55

60

3

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13 14

JCHOII- CH2OH

JO.

(II)

NHCOCF,

1) CH2N2

2) chraïiatographische Trennung

0 OH

(III) HO

CO-*CH.

NHCOCF.

1) OH

2) HCl

CO-*CH.

1) Br.

nii2.iici

2) IîOOONa CH3° 0

(V)

CO-*CH2-OïI "OH

NH2.HC1

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1 [14-14C]-Daunorubicin (IV)

0,118 g (0,193 mMol) 9-Deacetyl-9-formyl-N-trifluor-acetyldaunorubicin werden in Mengen von jeweils 0,035, 0,055 und 0,028 g in drei Kolben eingebracht. Dann wird eine Mischung von Diäthyläther und Methylenchlorid (1:1 V/V, 20 ml), die 14CH2N2 enthält, das aus 940 |iCi NH214CHa • HCl (0,477 mMol, 1,97 mCi/mMol) hergestellt wurde, in einer Vakuum Verteilerleitung (siehe Fig. 1) in den Kolben destilliert, der den ersten Teil (0,035 g) der Verbindung (II) enthält. Nach 60 Minuten bei Zimmertemperatur wird der Überschuss an 14CH2N2 unter Rühren in den Kolben destilliert, der den zweiten Teil des Substrats (0,055 g) enthält. Die Reaktion verläuft, wie oben beschrieben. Schliesslich wird das restliche radioaktive Reagens durch 6o Destillation in den dritten Kolben, der die 0,028 g der Verbindung (II) enthält, übergeführt.

Die vereinigten radioaktiven Produkte (0,127 g) werden durch präparative Dünnschichtchromatographie auf Silika-gelplatten (2 mm dick) unter Verwendung des Lösungsmit-6s telsystems Chloroform-Aceton (1 : 1 V/V) als Eluierungsmit-tel gereinigt. Die Bande, die N-Trifluoracetyl-[14-14C]-dau-norubicin enthält, wird herausgenommen, quantitativ in einen Becher übergeführt und mit 10 ml 5%igem wässrigen

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Methanol und dann mit 20 ml Chloroform gewaschen. Die organische Phase wird durch ein poröses Glasfilter filtriert. Nach sechsmaligem Waschen ist das Silikagel völlig farblos. Die vereinigten Extrakte werden im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der verbleibende Feststoff wird in 20 ml Chloroform gelöst und durch ein Papierfilter filtriert, worauf zur Trockene eingedampft wird; es werden 0,047 g der Verbindung (III) erhalten. Diese Verbindung ist mit einer authentischen Probe von N-Trifluoracetyldaunorubicin identisch, die durch Behandlung von Daunorubicin mit Trifluor-acetanhydrid erhalten wurde (F. Arcamone et al., Chim. Ind. (Mailand) 51, 834 (1969)). Die Lösung der Verbindung (III) in 10 ml 0,ln NaOH wird nach 60 Minuten mit 0,5n Salzsäure bei 0 °C auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und mit Chloroform extrahiert, bis die Extrakte farblos sind. Dann wird die wässrige Lösung mit 0,ln NaOH auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt und fünfmal mit je 20 ml Chloroform extrahiert, bis die Farbe völlig in die organische Phase übergeführt ist. Die stöchiometrische Menge 0, In methanolischer Salzsäure wird zu den vereinigten organischen Extrakten zugesetzt. Schliesslich wird die rote Lösung bei 35 °C zur Trockene eingedampft, wobei 0,030 g [14-14C]-

Daunorubicinhydrochlorid erhalten werden, spezifische Wirksamkeit 3,25 jiCi/mg (1,832 mCi/mMol).

Entsprechend dem obigen Verfahren und ausgehend von 10 mCi NH414CH3 • HCl (spezifische Wirksamkeit 19,27 s mCi/mMol) und 0,150 g Aldehyd (II) werden 44 mg [14-14C]-Daunorubicinhydrochlorid mit der spezifischen Wirksamkeit von 19,18 mCi/mMol erhalten (15,0% radiochemische Ausbeute).

Beispiel 2

io [14-14C]-Doxorubicinhydrochlorid (V)

Eine Lösung der Verbindung (IV) in einer Mischung von Methanol und Dioxan wird mit Brom behandelt, wobei das entsprechende 14-Bromderivat erhalten wird. Die darauffolgende Behandlung mit einer wässrigen Natriumformiat-15 lösung bei Zimmertemperatur während 100 Stunden ergibt [14-14C]-Doxorubicin, das als Hydrochlorid isoliert wird. Entsprechend diesem Verfahren wird [14-14C]-Doxorubicin-hydrochlorid (29 mg spezifische Wirksamkeit 14,04 mCi/ mMol und 10 mg spezifische Wirksamkeit 6,54 mCi/mMol), 20 ausgehend von [14-14C]-Daunorubicin (54 mg spezifische Wirksamkeit 14,18 mCi/mMol), mit 60,4% radiochemischer Gesamtausbeute erhalten.

s

1 Blatt Zeichnungen