DE2537671A1 - Verfahren zur regenerierung von enzymtraegern - Google Patents
Verfahren zur regenerierung von enzymtraegernInfo
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Description
Anmelderir>: Corning G-lass Works
Corning, N. Y., USA
Corning, N. Y., USA
Verfahren zur Regenerierung von Enzymträgern
Die Erfindung betrifft ein Verfahren ζ-im Regenerieren
von an.org an is cn en "Dorösen Trägern für Enzyme, insbesondere für Glucoseisomerase,
Aus den US-PS 3,850.751 und 3,868,304 sind als Träger
für Ο-Γιιοο se isomerase stark poröse Aluminiumoxidpartikel
der Größenordnung 4 - 200 mesh und mit durchschnittlichen
Porenweiten unter 1000 S, vorzugsweise 100 - 500 S bekannt
.
Die gleichlaufende Patentanmeldung P 25 37 670.9
schlägt darüber hinaus die Verwendung von Trägern aus AIpO, und MgO mit MgO Anteilen von 0,84 - 12 Gew.% vor.
Diese Träger sind sehr beständig und gewährleisten lange Enzymhalbwertzeiten; sie sind daher besonders für die
— 2 —
609815/1362
kontinuierliche herstellung ::..hJ. you fructose aus
Glucose geeignet. Dennoch t.rivi; im laufe der Zeil:
ein Verbrauch der En£y-ia>;ciyit:.!.t ein, soaaü sie uurc
neue Träger-iJnzynprllparatc ersetze v/erden nüssen,
^ine Regenerierung v/iAre datier giinstig, da sie nicht
nur die erneute Verwendung der i'r.U^er gestattet,
sondern auch Probleme dor Aoj.'ailbcceitif'.-un^ der verbrauciiteii
'fräijor
Durch Pyrolyse können organische Bestandteile auf den
anorganischen Trägem v/egg ebrannt v/erden. Es wurde ;iedoch
gefunden, daß diese .Behandlung sur l'rägerregenerieruüg
nicht ausreicht.
Aticli die pyrolisierten Träger enthalten noch eine ReIl-e
von Verunreinigungen, ζ,.β. ketallioxien des Substrats,
welche die Enzymbeschiciomg und Imlbwertzeit beeintrüchtigen, sodaß eine rationelle vilederverv/endung s.uaiälü;.
welche die Enzymbeschiciomg und Imlbwertzeit beeintrüchtigen, sodaß eine rationelle vilederverv/endung s.uaiälü;.
Aufgabe der Erfindung ist daher ein Verfahren sur wirksamen Regenerierung anorganischer Träger für Enzyme,
insbesondere für G-lucoseisoruerase.
insbesondere für G-lucoseisoruerase.
609815/ 1362 BAD ORIGINAL
Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Regenerierung
eines für die Adsorption von Glucoseisomerase geeigneten porösen, anorganischen Trägermaterials aus 0,84 - 12 %
MgO enthaltenden MgO-Al2O-, Partikeln einer durchschnittlichen
Korngröße von 0,074 - 4,76 mm (4-200 mesh) und mit durchschnittlichen Porendurchmessern von 100 - 1000 A dadurch gelöst, daß
das Trägermaterial bei 500 - 9000C bis zur Entfernung im wesentlichen
aller kohlehaltigen Stoffe hydrolisiert und anschließend mit einer neutralisierten, wässerigen Citratlösung umgesetzt wird.
Überraschenderweise entfernt diese zweistufige Behandlung die nach einer Pyrolyse noch verbleibenden Verunreinigungen, insbesondere
Metallionen. Besonders günstig ist die Anwendung zum Regenerieren der MgO-Al2O, Träger der vorstehend genannten gleichlaufenden
Anmeldung, das Verfahren ist aber auch für reine Aluminiumoxidträger geeignet.
Die Notwendigkeit der beiden Behandlungsschritte, Pyrolyse
und Citratbehandlung erhellt aus einem Vergleich erfindungsgemäß regenerierter und "verbrauchter" Präparate. Ein Präparat
ist "verbraucht", wenn seine weitere Verwendung unrationell oder unwirtschaftlich geworden ist. Wann dies der Fall ist,
hängt von einer Reihe verschiedener Umstände ab. Die verbleibende Enzymhalbwertzeit oder die Menge der aktiven Glucoseisomerase
auf dem Träger kann auf ein niedriges Niveau gesunken sein. Das Präparat kann auch mit Mikroben verunreinigt
sein, die den weiteren Gebrauch ausschließen. Eine wichtige Ursache ist die
- 4 609815/ 1382
Verunreinigung mit verschiedenen Metallionen nach längerem Kontakt mit der glucosehaltigen Lösung. Diese wird z. B.
nach der gleichlaufenden Anmeldung P 25 37 670.9 zur Einstellung
des für die Isomerisation optimalen pH Wertes mit Pufferlösungen behandelt, deren Ionen nach und nach das
Präparat verunreinigen, und auch durch die das verbrauchte Enzym und andere Kohlenstoffe, z. B. Zucker, Mikrobe usw.,
entfernende Pyrolyse nicht beseitigt werden können. Sie müssen daher vom Träger auf andere Weise entfernt werden,
bevor auf diesem erneut ein Enzym adsorbiert wird. Überraschenderweise ist dies durch die Behandlung mit Citrationen
(z. B. einem Geliermittel von Nahrungsmittelqualität)
nach der Pyrolyse gelungen. Die Trägeroberfläche wird hierdurch im wesentlichen wieder zu ihrem ursprüngliche
Zustand regeneriert.
Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit der Behandlung in einer den pyrolisierten Träger enthaltenden Durchlaufkolonne
vor erneuter Enzymadsorption. Als "neutralisierte" Citratlösung gilt hierbei der pH Bereich von 6-10.
Die Beispiele vergleichen die Enzymaktivität der Präparate auf neuen (ungebrauchten) und auf regenerierten Trägern
und zeigen, daß eine mindestens sechsmalige Regenerierung ohne Beeinträchtigung der praktischen Verwertbarkeit als
Träger für Glucoseisomerase möglich ist.
- 5 -609815/1362
In den folgenden .Beispielen bestand der Träger aus poröseu
LgO-Al0C-, mit etwa 2 - 2,4 Gew. yo ΐ-~ρ;0, in ϊογ;:ι /on 30 4b
inesxi = 0,3:> - 0,^9 mrj. groüen Partikeln einer durc-iscimi'L-t-licnea
Porenweite τοη etwa 200 A, (iiindestdurc.1.-raesser
1^0 A, Höchsxdurcliraesser 2t?0 a) und einer G-eaaifitooerfläcae
von etwa 100 era/;1;, die können durcn kisciion
einer Aufschiär.-ratin^· aus 300 ί 200 S großen A19OV Parüii:cln
Kit einer ->7ässeri:/e:"i ί:π;01ο I-ösun;_;, iCrocknexi und Breune...
unterlalo äer Gintertev.voeratur und Klaosieren nach lvcrnjvroiie
-i-er^ectollt werden, v-^1. aucii die Ver.'fc-iirensv/eico
nccii der ;-,leio:Llauxenden Ani-ielduii;".;.
jjie Glueoseisonierase vmrde in ]?or:ii einer v/äSocrigen Lösung
mix einer Al-rbivitüt von 2Y00 in'ooraationalen üiriiieit-eri.
pro :!:1 verwendet, (.iino iüinneit ist die nur Ijr^eu^ur^r vo:i
1/1?. i:ol. fructose ;nro kinute aus ZiL GliicoGelörauii^ bei 60c0,
πΞ 6, -ρ lienöti^te ensyraatische iilner^ie. !Das ^Jnzjh: war das
j?rodv-i:t eines Orcanisrraa der Art otrerstoinjces so.
Zur -1Orsteilung der Präparate vrarden 10 uil der unzyuilosLvip;
-.■.it 10 '- des Trägers in folgender "Jeioe uvcr-;3aet2;t. Der
Trärer wurde in einer J?luidkolonne mit destilliertem
Wasser gewaschen, in einen Kolben gegeben, 0,05ϊ·χ La^aesirurazetat
zugesetzt, und der Kolben 1 Std. in ein Scliütteload
gesetzt. Die Lösung wurde dann abgegossen, die
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BAD ORIGINAL
-ß-
iiivicoetzi;, und die hischuri;:; ;iur förderung der Ιϊ,ιιάji ■e.üccz.i'.JXQ
24 Std . iiL. ochütteloacl uoEset^er. el::.;jccn. Das Produkt wurde
,.It destillierten ,fässer ;~ο\/ει;.;ο- icn. Das immobilisierte
Unsympräparat kanu "bis zur Verwendung i;i 'i/asser od-~r a] rj
xiayrjer Kxichen ,^ela^cert werden.
Zur Βθΰΐίίίΐΐύυη·.!, der jiizyiual-tivität vmrden je 10 g I'rooen
der jJnzymprivyarate in eine 1,3 cm χ λ Lurcrnnesser betragende
iioloiine gegeben und durch diese kontinuierlich eine 5ü >t>-ige
G-lucoselösung (xationenausgetauscate Oerelose) geleitec.
Die Speiselösung vmrde auf einer Temperatur von 600G gehalten.
Sie enthielt mit KaOH auf p/I 3,4 gebrachtes 0,005K . Die Aktivität \^a^rde berechnet nach
= 27,? (|)m C11I
worin 3 = Aktivitätseinaeiten, F = Durcnsatz in lal/Std.,
T.7 = Enzympräparat in g (trocken.). X = ;6 erzeugte Fructose,
X = % Fructose im Gleichgewichtszustand (51,2 Jo).
Es wurden jeweils 10 g bereitet, iieun Proben wurden mit
einem neuen Träger ungebraucht, also noch nicnt regeneriert) hergestellt. Jeder Träger wurde dann "verbraucht",
indem er wenigstens '50 Tage in einer Durchlaufkolonne der
G-lucoselöaung ausgesetzt wurde.
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Die Proben wurden dann diircli Pyrolyse und anschließende
üitratbehandltmg regeneriert. i3ei der Pyroryse wurden die
Proben in Gegenwart einer Säuerstoffquelle 1 Std. auf
500 - 000 G erhitzt. Die Citratbehandlung wurde vorgenommen,
indem 0,1 h Zdtronensäurelösuiig nit ITaOH auf
pH 7 gepuffert, 1 Std. dui"cii ein Bett (Durchlaufkolonne)
des pyrolisierten Trägers geleitet wurde. Die Menge betrug
3 ml Zitronensäure r>ro g pyrolisiertes Trägermaterial,
.Regenerierung von porösen Trägern aus MgO-AIpO-.
Die Tabelle I zeigt die Anfangsaktivität adsorbierter Glucoseisomerasepräparate ii;i labormäßigen Kolonnenbetrieb.
Die 50 %-ige Glucoselösung (Cerelose) enthielt 0,005 M MgCl2 bei pH 3,4 und 600C. Die Vorteile der Citratbehandlung
werden hieraus deutlich.
609815/1362
Träger (Beispiel)
durchschnittlicJae
Anfangsaktivität
Einheiten/g
neuer Träger
Pyrolysis und Gitrat (1)
Pyrolysis ohne Citrat
neuer Träger
Pyrolysis und Citrat (2)
Pyrolysis ohne Gitrat
1 3
2 1
854 895
781 688
736 616
Beispiele III - VIII
V/ied erholte Regenerierung von hgO-AlpO-, Trägern.
Die Tabelle II zeigt die högliciikei b wiederholter
Regenerierung. IT ach. jedem Verwendungszyklus wurden
die Halbwert zeiteil der Ensymaktivität wenigstens 30 Tage
gemessen.
Beschreibung (Beispiel) |
Regeneration | (3) | AIH Anfangs akt ivitat (iGIU/g) |
Halbwertzeit durch- schnittl. |
(Tage) IÖL |
95 >-ό UCL |
neuer Träger | Regeneration | (4) | 360 | 29,ρ | 28,4 | 50,7 |
1. | Regeneration | (5) | B74 | 52,3 | 30,4 | 54,4 |
2. | Regeneration | (6) | 953 | 24,3 | 22,8 | 26,0 |
3. | Regeneration | (7) | 372 | 25,9 | 25,2 | 28,8 |
4. | Regeneration | (S) | 1010 | 28,0 | 26,0 | 50,2 |
5. | 100S | 42,0 | 35,6 | 51,2 | ||
6. | 995 | 32,0 | 29,5 | 54,9 |
609815/1362
Claims (1)
- i'i , Verfar.-.ren zur Regenerierung eine::; T1Ir die Adsorption von G-lucoseioornerase geeigneten porösen anorganischer. Träge Materials aus ü,;>4 - 12 '/o I'igO enthaltendem KgO-Al9O^ Partikeln einer durcnsoanittlicnen Korngröße von 0,074 - 4,76 ipi-i (4 - 200 raesn) und mit durchschnittlichen Porendurchraessern von 100 - 1000 Λ, dadurcn i.;elcennzeichnet, daß das :±τ\'.£βχ-jiiaterial "bei 500 - 900 bis zur Entfernung iai wesentlichen aller kohlehaltigen Stoffe hydrolisierx und anschließend niit einer neutralisierten wässerigen Citratlösung umgesetzt wird.2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurca gekennzeichnet, daL die Citratlösuug aus einer v/äüserigen Lösung von Citrationen mit dem. pH 6 - 10 besteht.3. Verfahren gemäß Anspruch. 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Citratlösung eine 0,1 molare Natriuracitratlösung mit dem pH V/ert 7 ist.4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß 3 ml öitratlösung pro g Trägermaterial verwendet werden.- 11 -609815/1362 BAD ORIGINAL'·}. /eri'aire1! geialliä irfrend einen:" ä ei· Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeicnnet, daß die Behandlung mit der Qitratlösunp: nach Abkühlung des pyrolisierten Trägers 'bei Zimmertemperatur während einer wenigstens 15 Min. währenden Zeitdauer durchgeführt wird.6. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 oder 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daii die Pyrolyse bei 600 - 9000C während 1 Std. durchgeführt wird.7. Verfahren gemäß irgend einem der Ansprüche 1 - 5, dadurch gekennzeichnet, daß die rieHandlung mit Citratlö'sung durch kontinuierliches Hindur chi ei ten der Lösung durch eine das Trägermaterial enthaltende Durchlaufkolonne durchgeführt wird.609815/ V3 67
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