JPS604717B2 - ＭｇＯ−Ａｌ↓２Ｏ↓３含有の多孔性無機支持材料の再生方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は一般にいえば酵素固定に有用な多孔性無機支持
材料に関する。

更に詳しくいえばグルコースィソメラ−ゼにとって有用
であると認められている支持材料を再生する方法に関す
る。従来の技術 米国特許第３，８５０，７５１号および第３，８６８，
３０４号各明細書において、グルコースをフルクトース
に異性化するのに有用なたいへん効果的な再利用可能な
固定化グルコース ィソメラーゼ系を提供するために高
表面城の孔の中で、グルコ−ス・ィソメラーゼを非常に
多孔なアルミナ小片に固定化する方法が開示されている
。

これら米国特許の特許請求の範囲において述べたように
、多孔性アルミナ笹体は、好ましくは、球状形（たとえ
ば４一２００メッシュ内で）で、少なくとも酵素と同じ
大きさの平均孔直径だが約１０００Ａより小さく、好ま
しくは５００△より小さいか又は１００Ａと５００Ａと
の間の孔直径を有するのがよい。米国特許第３，９８２
，９７７号明細書において、アルミナ担体の改善につい
て開示されている。改善されたグルコース イン〆ラー
ゼ担体は、この中に、いろいろな量のマグネシアを混合
している。好ましい坦体は、好ましくは０．８４ないし
１２．の重量％を組成しているマグネシアとアルミナと
の両方から成っている。かかる担体は、ＡＩ２０３坦体
と区別するためにＭｇ○−ＡＩ２０ま旦体と以下で示す
。グルコース ィソメラーゼの吸着、そして固定化のた
めに、多孔性Ｎ２０３又は多孔性Ｍ蚊‐ＡＩ２０３担体
のいずれかを使用した場合、得られた組成物が、高度な
安定性と、比較的長い酵素的半減期を示すことがわかっ
た。かかる特徴は、グルコース含有溶液のフルクトース
含有溶液へのいかなる大規模な交換にも望ましいので、
その組成物を商業的に魅力あるものとする。継続的にそ
して経済的にグルコースをフルクトースに転化すること
ができるという望ましい点が特に酵素異性化方法により
、よく認められる。たとえ上記の多孔針２０３および多
孔Ｍ蚊‐ＡＩ２０３担体が、比較的長い半減期を有する
固定化グルコースィソメラーゼ組成物を製造するために
使用されうるとしても、かかる組成物の使用、特に継続
的使用は、経済的には時間が制限される。

組成物の酵素半減期の長＆こかかわらず、全酵素活性は
時間と共に減少する傾向があるということが認められう
る。かくして、時間的問題において、活性が減少するた
めに、合成物を使用し続けるのは不経済となる。従って
、その時に消費された組成物の代りに、新しい組成物を
置き換えるだけでもより経済的になる。発明が解決しよ
うとする問題点 上記の多孔担体は、比較的高価でもなく、そしてグルコ
ースィソメラーゼの代りにかかる迫体を使用するという
全く有益な経済性を減ずることなく使用後に処分されう
るけれども、もしも担体を再利用のため再生しうるなら
ば一層望ましい。

担体再利用は、さらに一層経済的にするだけでなく、使
用済物質の排出に関連する問題をも又さげる。いろいろ
な熱分解処理が、無機物質上で有機成分を燃すために使
用されるということが知られている。しかし、比較的簡
単な熱分解段階それだけでは、直ちに経済的再利用のた
めに多孔担体を製造するのに十分ではない。なぜなら熱
分解された担体は、なお継続的酵素充填および／又は半
減期を減少させるようないろいろな汚染物（たとえば、
基質からのいろいろな金属イオン類）と、坦体とを関連
させるからである。全く驚いたことに、制御熱分解段階
により、次に熱分解後に担体と関連ある望ましくない金
属イオンを除去するようにみえる溶液で処理することに
より、経済的再利用に直ちに損体が再生されるというこ
とがわかった。坦体再生の２段階法は下に詳しく託し、
そして、本発明は特に米国特許第３，擬２，９９７号明
細書に開示されているＭｇ０一虹２０３担体の再生方法
に、関する。問題点を解決するための手段 グルコースィソメラーゼの固定化に有用な非常に多孔な
Ｍ蚊‐山２０３担体を再生する本方法は、すべての炭素
質物質を、事実上除去するのに十分な状態で担体を熱分
解する工程からなっている。

好ましい担体物質は、約０．８４重量％および１２．の
重量％の間のＭｇ０を、この中に混合しているＭｇ○‐
山２０３からなる非常に多孔な粒子からなり、この粒子
は、約１００八および１０００Ａの間の平均孔直径、非
常に好ましくは約１５０Ａおよび２５０Ａの間の平均孔
直径および約４メッシュおよび２００メッシュの間、好
ましくは３０なし、し４５メッシュの平均粒子型（アメ
リカ合衆国ふるい）を有する。好ましい再生工程は、担
体からすべての炭素買物質を事実上除去するのに十分な
時間酸素の存在下で５００℃および９００午０の間の温
度にかかる粒子をさらすことを含んでいる。その後、粒
子を冷却させそして、それから汚染物、たとえば、他の
面で担体の経済的再使用を最小にしてしまうような金属
イオンを除去するのに十分な時間、クエン酸塩イオンの
中和水溶液にさらす。好ましくはクエン酸塩溶液は、約
６．０および１０の間のｐＨを継持する約０．１モルの
クエン酸塩溶液、非常に好ましくは、約７．０のｐＨに
おけるクエン酸ナトリウム溶液からなり、そして熱分解
された担体を少なくとも約１５分間、好ましくは室温で
クエン酸塩溶液で、インキュベートする。上記のように
、本発明は、グルコースィソメラーゼに対して坦体とし
て有用な多孔なＭｇ０−ＡＩ２０３胆体物質（この担体
については、上記米国特許第３，９８２，９９７号明細
書にくわしく記されている）を再生する方法に明確に向
けられている。

開示されたように、この担体はァルミナおよび約０．８
４重量％ないし１２．の重量％のマグネシアからなる多
孔なＭｇ○一ＡＩ２０ダ勿質を含んでいる。この米国特
許第３，９８２，９９７号明細書に記載された理由のた
めに、多孔担体の平均粒子径は、約４メッシュおよび２
００メッシュの間、好ましくは約３０メッシュおよび４
５メッシュの間であるべきであり、そして個々の粒子の
平均孔直径は約１００Ａおよび約１０００Ａの間、好ま
しくは約１００人および５００Ａの間であるべきである
ということがわかった。明確に、グルコースィソメラー
ゼの固定化（吸着による）のための理想的なＭ奴‐ＡＩ
２Ｑ担体は、約１５０人および２５０Ａの間の平均孔直
径を有するということがわかった。Ｍｇ○−ＡＩ２０３
は、固定化グルコースィソメラーゼ組成物の製造に特に
好ましい担体であるので、再生は純粋なＡＩ２Ｑ挺体上
でも又よく作用すると思うけれども、本方法は、明確に
、その担体を再生することに関している。上に指摘した
ように、本再生方法は２つの本質的工程：熱分解および
クエン酸塩溶液による処理からなる。

両工程の必要性は、使用済みの物質の状態と新しい再利
用できる担体の要件とを併せ考えれば分る。この中で使
用される表現‘‘使用済みの”物質とは固定化されたグ
ルコースィソメラーゼ組成物に関しており、そしてこれ
は、ちよつと使うと、さらに使用するには不経済となる
。いくつかの要素は、その組成物が使用するのには不経
済である時点を決定しうる。たとえば、酵素的半減期又
は担体上の活性グルコース・ィソメラーゼ量は、比較的
低レベルに落しうる。組成物は、一層の経済的使用を妨
げるいろいろな微生物学的成長汚染されうる。さらに、
組成物はグルコース含有溶液との長い接触後組成物と会
合しているいろいろな金属イオンの望ましくない過剰量
で汚染され得る。そしてこの金属イオンに、いろいろな
緩衝液を含んでいるイオンがいよいよ加えられる。米国
特許第３，８６８，３０４号明細書において示されよう
に、グルコースのフルクトースへの継続的転化（異性化
）に対する好ましい反応系は、グルコース緩衝溶液が、
継続的に通過している充填した貫流カラムからなる。グ
ルコース溶液は、ふつう、光学異性化がおこるｐＨ範囲
まで緩衝され、そしてグルコース溶液および／又はカラ
ムの温度は、有意な酵素の非活性化ないこ光学異性体化
を確実にするためにも、ふつう上げる。かかる継続的加
工系を使用する際、緩衝液からのいろいろなイオンは組
成物と会合する鏡向があり、この組成物の量は、時間と
共に増す傾向がある。

比較的単純な熱分解工程は消費された酵素および担体中
の他の炭素質物質（たとえば、庶糖、微生物など）を除
去するのに十分であるけれども、熱分解は、組成物中の
蓄積金属イオンを決して除去しない。むしろ、加熱工程
は、担体表面中および上の残溝酸化金属汚染を残す煩向
がある。かかる金属の蓄積は坦体の経済的再利用を減少
させるので、グルコース・イソメラーゼの吸着による、
再固定化の前に、多孔担体を初期の状態に戻すためにそ
れらを除去しておくのは非常に望ましい。本発見の要点
は、食品級の品質のキレート剤（クエン酸塩イオン）を
用いて、熱分解後の挺体を処理することにより、蓄積さ
れた金属イオンが除去され、そして担体表面が、ほぼそ
の最初の状態に戻る。

この中で使用される用語“中和された”は、ｐＨが６．
０ないし１０．０の範囲であるクエン酸塩溶液を言及し
ている。クエン酸塩処理は、新しい酵素の再吸着の前に
、熱分解された担体を含んでいる充填した貫流カラムを
通ってクエン酸塩を継続的に通過させることにより完成
されうるので、その処理はさらに別な工程の装置の必要
を減少させる。

下の実施例において、新しい（最初の）担体を有する組
成物の酵素活性を、熱分解された担体と、熱分解されク
エン酸塩で処理された担体とで比較する。

さらに、この２工程再生方法を使用して、使用済みの物
質の担体がグルコースィソメラーゼの坦体として有用性
において有意な損失なしに、少なくとも６回再生処理さ
れうろことを示す。下の全実施例において、約０．２な
し、し２．４重量％のＭｇ０からなるＭｇ○‐ＡＩ２０
３多孔坦体を使用した。

狸体は、約３０および４５メッシュ（アメリカ合衆国ふ
るい）の間の平均粒子型を有する球状の型であった。個
々の粒子は、最小孔直径約１５０Ａ、最大孔直径約２５
０Ａを有する約２００△の平均孔直径を有していた。担
体は表面積約１０■Ｍ２／夕であった。かかる担体はＡ
Ｉ２０３粒子（約３００土２００Ａ平均粒子型）のスラ
リをＭｇＣ１２水溶液と混合し、大部分の水を除去する
ためにスラリを乾燥させ、それから暁結点以下の温度で
乾燥物質を焼成することにより製造されうる。それから
、最終乾燥多孔体は通常の方法により、メッシュ型によ
り分類されうる。Ｍｇ○−ＡＩ２０嶺多孔体を形成する
ための特定の指示は、ディー・エル・イートン（Ｄ．Ｌ
．Ｅａのｎ）らの名で出願された上記の同時係属出願に
記述されている。固定化酵素合成物を製造するのに使用
されるグルコースィソメラーゼ溶液は２７００１０１Ｕ
／の【．（国際グルコースイソメラーゼ単位／の【）の
グルコースィソメラーゼ活性を有する水溶液である。

１１ＧＩＵは６０ｑｏ，ＰＨ６．８５で、２Ｍグルコー
ス溶液からフルクトース１仏モル／分を製造するのに必
要な酵素活性を示す。

酵素は、ストレプトマィセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓｓｐ．）の微生物から誘導された。組成物は、次
のようにして１０の‘の酵素溶液と１０夕の多孔担体と
を反応させて製造された：最初に流動カラム中で、担体
を蒸留水で洗う。

それから０．０別値乍酸マグネシウムの１０泌／タ担体
を加えたフラスコ中に、その担体をおき、そしてそのフ
ラスコを振とう浴中に１時間おく。それから溶液を静か
に注ぎそして酵素溶液を加えて、酵素吸着を促進するた
めこの組成物を振とう浴中で２独特間反応させる。それ
から生成物を蒸留水で洗い、そして固定化酵素合成物を
水中に貯えるか又は使用するまで湿ったかたまりとして
貯える。酵素活性の測定：個々の酵素組成物の性能は、
５０％グルコース溶液〔セレ。ース■カチオンェクスチ
ェンジド（Ｃｅｒｅｌｏｓｅ■ｃａｔｉｏｎｅｘｃｈａ
ｎｇｅｄ）〕が継続的に通っている１．５ｃｍ直径カラ
ム中に組成物１０タサンプルをおくことにより観察され
る。供給溶液は、６０ｏｏに維持され、そして水酸化ナ
トリウムでＰＨ８．４にされた０．００９ＭＭｇＣ１２
を含んでいる。活性はＥ：２７‐９（島）ｌｎ（こウ宅
）〔式中、Ｅ＝活性単位、Ｆ＝流速地／ｈｒ、Ｗ＝固定
化酵素組成物重量夕（乾燥ベース）、Ｘ＝製造されたフ
ルクトース％およびＸｅ＝平衡状態のフルクトース％（
５１．２％）〕として計算される。

実施例の組成物を製造する際、各々の組成物のおよそ１
０夕（湿潤重量）の分量が上記方法により製造される。
９つの別々の組成物は、薪しい担体（再生されていない
）により製造される。

それから個々の薪しい担体は、グルコース溶液が、少な
くとも３０日間分析状態下で継続的に流れている充填貫
流カラム中にこの担体をおくことにより、“消費される
”。それから、サンプルの示された番号は、熱分解によ
り再生され、そして、次に熱分解は、示されたクエン酸
塩で処理される。

熱分解工程は、酸素源の存在下で１時間５００ないし６
００ｑｏの温度にまで坦体え加熱することを包含してい
る。クエン酸溶液処理は、約１時間、熱分解された坦体
の充填床（充填貫流カラム）を通して、ＰＨ７．０にま
で（ＮａＯＨ‘こより）中和された０．１川クエン酸溶
液を注入することを包含している。そしてそのクエン酸
塩溶液は、処理された熱分解担体の約３の上／夕である
。実施例 １−ロ Ｍｇ○−ＡＩ２０３多孔性担体の再生 表１は、ｏ．００９ＭのＭや１２を含んでいる５０％グ
ルコース〔セレロース■（Ｃｅｒｅｌｏｓｅ■）〕供給
液を用いた、実験室カラム装置中の吸着されたグルコー
スィソメラーゼ酵素剤のｐＨ８．４、６０こＣでの初期
活性を示している。

クエン酸塩処理の利点は明らかである。表 １ 担体 の 種 類 サンプル数 平均初期活性（実施例
番号） （単位／９）新しい担体 ６ ８５
４ 熱分解および クエン酸塩（１） ４ ８９５ 熱分解（クェン 酸塩処理せず） １ ７８１ 新しい担体 ３ ６８８ 熱分解および クエン酸塩（２） ２ ７３６熱分解（ク
ェン酸塩処理せず） １ ６１６ 実施例 ｍ−側 Ｍｇ○−ＡＩ２０ま旦体の継続的再生 同じ担体を何度も再生できる可能性を表０で示している
。

酵素活性の半減期は、各々の継続的操作循環に対して、
少なくとも３０日間組成物を使用する間に、測定する。
表 ロ 半減期（日） ９５％種 類（実
施例番号） 目的の初期活性（ＩＧＩＵ／９） 平 均
ＬＯＬ ＬＯＬ新 し い 担 体 ８６０
２９．５ ２８．４ ３０．７第一再生 （
３） ８７４ ３２．３ ３０．４ ３
４．４第二再生 ■ ９３３ ２４．３
２２．８ ２６．０第三再生 （５）
８７２ ２６．９ ２５．２ ２８．８第四再生
（６） １０１０ ２８．０ ２６．０
３０．２第五再生 の １００８ ４
２．０ ３５．６ ５１．２第六再生 （８）
９９３ ３２．０ ２９．５ ３４．９以
下本発明の実施態様を示す。

‘１）中和されたクエン酸塩溶液がクエン酸塩イオンの
水溶液からなり、その溶液が約６．０なし・し１０．０
の間のｐＨを有している特許請求の範囲第１項の方法。
■ クエン酸塩溶液が約０．１モルのクエン酸ナトリウ
ム溶液であり、約７．０のｐＨを有している前記第１ー
項の方法。糊 使用されるクエン酸塩溶液の量が担体１
夕当り約３の【である前記第‘２｝項の方法。

‘４｝ クエン酸塩溶液による処理を、支持材料を含み
、かつクエン酸塩溶液を継続的に通過させる充填した貫
流カラム中で行なう特許請求の範囲第１項の方法。

【５｝ 熱分解を約６００ｏｏと９００ｏｏとの間の温
度で少な〈とも１時間行なう特許請求の範囲第１項の方
法。

‐‘６１ クエン酸塩溶液との反応
を支持材料を含んでいる充填した貫流カラム中で行なう
前記第ｔ５｝項の方法。

【７｝ 熱分解を約５００−６００こ０の温度で約１時
間行ない、そしてクエン酸塩溶液が、約７．０のｐＨに
中和された０．１モルのクエン酸塩溶液からなる特許請
求の範囲第１項の方法。

‘８ー クェソ酸塩溶液での処理をその溶液を支持材料
を含んだ充填した貫流カラムに継続的に通過させること
により行なう第７｝項の方法。

｛９｝ クエン酸塩溶液の量が、カラム中の支持材料１
夕当り約３の‘である第■項の方法。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ＭｇＯの量は約０．８４ないし１２．０重量％の範
   囲内であり、粒子の平均サイズは約４ないし２００メツ
   シユ（アメリカ合衆国標準ふるい）の範囲内であり、そ
   して平均孔直径は約１００Åないし１０００Åの範囲内
   であるＭｇＯ−Ａｌ＿２Ｏ＿３組成物の多孔性粒子から
   成り、グルコースイソメラーゼ吸着に使用される多孔性
   無機支持材料を再生する方法において、実質的にすべて
   の炭素質物質を除去するのに十分な条件下で、約５００
   ℃ないし９００℃の範囲内の温度で上記材料を熱分解し
   、次にその材料を中和されたクエン酸塩水溶液と反応さ
   せる工程を特徴とする方法。