DE2526996A1

DE2526996A1 - Verfahren zur immunodiffusion und immunodiffusionsplatte

Info

Publication number: DE2526996A1
Application number: DE19752526996
Authority: DE
Inventors: Vincent A Pollack
Original assignee: Baxter Laboratories Inc
Current assignee: Baxter International Inc
Priority date: 1974-06-21
Filing date: 1975-06-18
Publication date: 1976-01-08
Also published as: DK277375A; SE7507125L; FR2275773B1; FR2275773A1; IL47368A; NL7506871A; IT1039142B; GB1492202A; ZA753417B; AU8179975A; BE829877A; AR207983A1; JPS5115613A; IL47368A0; CA1050883A; US3947250A

Description

PATENTANWÄLTE ** ^v **

D!pl.-Ing. P.WIRTH · Dr. V. SCHMIED-KOWARZIK Dip!,lng. G. DAN N EN BERG · Dr. P. WEIN HOLD ■ Dr. D. GUDEL

281134 6 FRANKFURT/M.

TELEFON COem _287oj4 GR. ESCHENHEIMER STR.39

SK/SK

H-447; SJM:gk

Baxter Laboratories, Inc. Morton Grove, 111. 60053 /USA

Verfahren zur Immunodiffusion und ImmunodiffusionsOlatte

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Proteinen, die in äußerst geringer Konzentration in Blutserum und anderen biologischen Flüssigkeiten vorkommen. Sie bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren zur Verbesserung der Sichtbarkeit von Präzipitinzcnen bei Immunodiffusionsreaktionen.

In den letzten Jahren sind verschiedene neue immunologische Verfahren zur Bestimmung von Serumproteinen entwickelt worden. Ein ganz wesentlicher Beitrag zur Quantitativen Bestimmung der Serumproteinkomponenten war die Entwicklung eines einzigen Diffusionstyps der Präzipitinreaktion. Insbesondere die Bezeichnung "Radialimminodiffusion" ist auf ein System angewendet

einer von zwei
worden, in welchem/zwei Immunreaktanten, gewöhnlich Antikörper, in ein halb-festes Gel, wie Agar, einverleibt und das Gel auf eine Oberfläche ausgebreitet wird und der andere Immunreaktant, gewöhnlich das Antigen, radial aus einem ringförmigen Reservoir

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diffundieren gelassen wird. Bei diesen Verfahren diffundiert das Antigen radial aus dem Reservoir oder aus einer in das Gel gestoßeneen Quelle in die umgebende Gel-Antikörper-Mischung, und es bildet sich eine sichtbare Scheibe oder ein Ring aus Präzipitat (Präzipitinring), wo Antigen und Antikörper reagiert haben. Der Durchmesser der gebildeten Präzipitinzone ist direkt proportional zur Konzentration des in das Gel einverleibten Antikörper^.

Eine weitere Beschreibung des radialen Immunidiffusionsverfahrens findet sich in "Immunochemistry", Bd. 2, Seite 235-254 (1965) und JAMA, Bd. 200, Nr. 4, Seite 32-3 (1967).

Die Verfahren der Radialimmuni diffus ion sind auf die Bestimmung von Sterumproteinen, wie Präalbumin, Albumin,c/^-Antitrypsin, o(₂-Macroglobulin, Ceruloplasmin, -Transferrin, C3(ß1A/C) und die Immunoglobuline (IgA, IgM, IgG und IgD) angewendet worden (vgl. Amerc.J.of Med.Techn., Bd. 37, Nr.'12, Dez. 1971).

IgE ist die am jüngsten entdeckte Klasse von Immunoglobulinen mit Antikörperwirksamkeit. Es hat ein Molekulargewicht von 184 (7,9S) und stellt den kleinsten Anteil von Serumimmunoglobulinen mit einem normalen Erwachsenenbereich von 15 bis 800 IU/ccm (Durchschnitt etwa 200 IU/ccm) dar (vgl. J.Immunol., Bd. 107, Seite 794-801 (1971); Lancet, Bd. 2, Seite 1059-61 (1972)). IU/ccm wird in Bull.WId.Hlth.Org., Bd. 43, Seite 609-11 (1970) definiert; vgl. auch Clin.Chim.Acta, Bd. 36(1), Seite 276-81 (1972).

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Aufgrund der äußerst geringen Konzentration von IgE im Blutserum sind die durch die IgE Antigen-Antikörper-Reaktion bei der üblichen Radialiminunidiffusion gebildeten Präzipitinringe nur schwer sichtbar. Erfindungsgemäß wird nun die Sichtbarkeit dieser Diffusionsringe beim Testen auf IgE und ähnliche derartige Proteine in niedriger Konzentration merklich verbessert.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf die Einverleibung einer geringen, aber wirksamen Menge von etwa 0,5-5 Gew.-%, bezogen auf das Medium, eines Blockmischpolymerisates aus Äthylenoxid und Polyoxypropylenpolyineren in das Immunodiffusionsgelmedium.

Die erfindungsgemäßen Blockmischpolymerisate können durch die Formel H0(C₂H_Zf0)_b(C₃H₆0)_a(C₂H_Zt0)_t)H dargestellt v/erden, in welcher a eine ganze Zahl ist, so daß die durch (C^JL-O) dargestellte hydrophobe Base ein Molekulargewicht von mindestens 950 hat; b ist eine ganze Zahl, so daß der durch (C₂H^O) dargestellte hydrophile Teil etwa 50-90 Gew.-% der Verbindung ausmacht. Diese Verbindungen können durch Kondensieren von Äthylenoxid mit Polyoxypropylenpolymerisat hergestellt werden. Bezüglich einer weiteren Beschreibung der Herstellung dieser Blockmischpolymerisate vgl. die US-PS 2 674 619.

Erfindungsgemäß geeignete Blockmischpolymerisate sind z.B. die von der Firma Wyandotte Chemicals Corporation erhältlichen "Pluronic" Polymerisate F-38 und F-68. F-38 enthält 80 % hydrophile Polyoxyäthyleneinheiten im Molekül, und die hydrophobe Polyoxypropylenbase hat ein Molekulargewicht von 950. F-68 enthält ebenfalls 80 % hydrophile Polyoxyäthyleneinheiten im

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— Zj. —

Molekül, aber die hydrophobe Base hat ein Molekulargewicht von 1750. Die gesamten Molekulargewichte dieser beiden "Pluronic" Polyöle betragen 4750 bzw. 8750. Eine weitere Beschreibung dieser Polyole findet sich im Bulletin der Wyandotte Chemicals Corp., "The Pluronic Grid", 6. Aufl., das hiermit in die vorliegende Anmeldung mit aufgenommen wird.

Die erfindungsgemäß verwendeten Blockmischpolymerisate unterscheiden sich von den Polyäthylenglykolpolymerisäten, die gemäß Immunochemistry, Bd. 8, Seite 413-21 &(1971), Clin.Chim.Acta, Bd. 38, Seite 329-37 (1972) und Immunology, Bd. 23, Seite 413-22 (1972) in Immunodiffusionsreaktionen verwendet werden. Obgleich Polyäthyienglykol die Sichtbarkeit von Präzipitinzonen bei Immunodiffusionsreaktionen zu verbessern neigt, erhöht es gleichzeitig auch die nicht-spezifische Ausfällung, wodurch die Klarheit der Präzipitinzone verringert wird. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß das oben definierte Blockmischpolymerisat Präzipitinringe liefert, die wesentlich klarer und deutlicher sind, als die mit Polyäthylenglykol erhaltenen Ringe.

Bei der Herstellung des erfindungsgemäß verwendeten Gelmediums werden übliche. Gelierungsmittel verwendet, wie z.B. Gelatine, Pectin, Kieselsäuregel, Stärke, Polysaccharide aus Seegras, wie Agar, Agarose, Algin und Carrageenin, synthetische polymere Gelierungsmittel, wie vernetztes Polyacrylamid (vgl. die US-PS 3 046 201), modifizierte Celluloseh (vgl. die US-PS 3 360 440), modifizierte Agars and Agarosen (vgl. die brit. PS 1 350 024) usw. Das Gelierungsmittel hat vorzugsweise die für Agar-Agar

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charakteristischen Eigenschaften, indem es leicht in heißem Wasser dispergierbar ist und ein praktisch klares Hydrogel von ausreichender Härte bilden kann, so daß der das Gel enthaltende Behälter oder die Platte umgekehrt werden kann, ohne daß die Gefahr eines Herausfallens des Gels besteht.

Agarose ist das bevorzugte, im erfindungsgemäßen Gelmedium verwendete Gelierungsmittel. Agarose ist das neutrale Galactosepolymerisat, das aus der Agaropectinfraktion von Agar nach üblichen Verfahren, z.B. der US-PSS 3 281 409, 3 335 127 und 3 362 884, abgetrennt worden ist. Erfindungsgemäß können auch Agar, wie es von den Difco Laboratories als "Noble" Agar erhältlich ist, und Mischungen aus Agarose und Agar verwendet werden.

Das Gelierungsmittel wird gewöhnlich in einer Konzentration von etwa 0,1-5 Gew.-%, bezogen auf das Gelmedium, vorzugsweise in einer Menge von etwa 0,5-1»5 Gew -% Agarose; verwendet.

Das erfindungsgemäße Gelmedium bedient sich gewöhnlich auch eines Puffersystems zur Aufrechterhaltung einer praktisch konstanten Konzentration von Wasserstoffionen. Es kann jedes üblicher Puffersystem verwendet werden, wie z.B. Phosphat-, Acetat-, Borat-, Citrat-, Tris-(hydroxymethyl)-arninomethan-glyin-, Tris-EDTA-, Barbital und ähnliche Puffersysteme. Vorzugsweise wird der in der US-PS 3 088 875 beschriebene Glycin-Kochsalzlösungs-Puffer mit einem pH-Wert von 8,0-8,5 verwendet.

Im Gelmedium können auch verschiedene Verdünnungsmittel, wie Rinderserumalbumin, Kalbfötusserum und verschiedene Konservierungsmittel, wie Natriumazid, Merthiolat usw., in den üblichen

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Mengen verwendet werden.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1_

Es wurde wie folgt eine Immunidoffusionsplatte zur Bestimmung von IgE hergestellt?

Herstellung der Reaktionsteilnehmer

(A) Glycin-Kochsalzlösungs-Puffer

Glycin 0,1 M 7,5 g/l

NaCl 0,15 M 9,0 g/l

Einstellung auf pH 8,2 mit N NaOH.

(B) Agaroselösung

Zu 100 ecm des wie oben hergestellten Glycin-Kochsalzlösungs-Puffer wurde 1 g Agarose und 2 g "Pluronic" F-38 Polymerisat zugefügt und zur Bildung einer klaren Lösung aus 1 % Agar und 2 % Polymerisat erhitzt.

(C) Antikörper

IgE Antikörper wurde durch Immunisierung von Pferden mit IgE Antigen und anschließendes periodisches Zuraderlassen auf einen vorherbestimmten geeigneten IgE Antikörpertiter gewonnen. Verfahren

Die obigen Reaktionsteilnehmer wurden in den geeigneten Verhältnissen unter Erhitzen zur Bildung einer Lösimg mit der folgenden Endkonzentration gemischt:

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— f —

Reaktionsteilnehmer Konzentration

IgE Antikörper etwa 1:200 (Antikörper:

Puffer) Verdünnung im Puffer

Agarose 0,90 %

"Pluronic" F-38 1,8 %

Glycin 0,09M

NaCl 0,135M

Die obige Lösung wurde in die Höhlungen einer Immunodiffusionsplatte gegossen, wie sie in der US-PS 3 725 004 beschrieben und in den beiliegenden Fig. 1 bis 5 dargestellt ist. Die Lösung wurde gelieren gelassen, dann wurden 6 Löcher von 5 mm Durchmesser in das Gel gestochen, wobei jeweils ein Loch zentral in jeder der sechs muschelförmigen Diffusionszonen lag.

Der RadialiminunDdiffusionstest auf IgE erfolgte, indem man eines der L*dcher mit einem Bezugsserum füllte, das eine geeignete Verdünnung von IgE Antikörper enthielt. Die restlichen fünf Löcher wurden mit Proben des Testerums gefüllt, Es wurde eine Kunststoffabdeckung über die Immunodiffusionsplatte gelegt und die Platte in einer Feuchtigkeitskammer 48 Stunden bei 37°C. bebrütet. Danach wurde die Platte auf die Bildung von Präzipitinringen untersucht. Dann wurde die Platte mit einer wässrigen Lösung aus 7,5 % Essigsäure als Färbeverfahren bedeckt und die Präzipitinringe erneut untersucht. Der Durchmesser der Ringe wurde bestimmt, und in üblicher Weise durch das Quadrat des durchschnittlichen Präzipitinringdurchmessers berechnet. Dann wurde die IgE Konzentration in Bezug auf eine Standardkurve bestimmt,

t.-

die den durchschnittlichen Präzipitindurchmesser auf der Ordinate und das IgE in IU/ccm auf der Abszisse enthielt.

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,. r — O —

Das obige Beispiel wurde wiederholt, wobei 3 % Polyäthylenglykol 4OÖG anstelle von 2 % "Pluronic" F-38 in der Agarlösung verwendet wurde. Es wurde festgestellt, daß die Sichtbarkeit der Präzipitinringe des obigen Beispiels mit "Pluronic" F-38 deutlich verbessert wurde, indem sie wesentlich klarer und deutlicher waren als die mit P_olyäthylenglykol erhaltenen Ringe.

Beispiel 2_

Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei eine Mischung aus 0,80 % Agarose und 0,40 % Agar anstelle der 0,90 % Agarose verwendet wurde; die Ergebnisse waren praktisch gleich.

Beispiel 3

Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei "Pluronic" F-68 anstelle von F-38 in der Agarlösung verwendet wurde; es wurden praktisch dieselben Ergebnisse erhielt.

Beispiel 4

Beispiel 1 wurde 4 Mal wiederholt, wobei für den IgE Antikörper äquivalente Mengen an IgA, IgM, IgG und IgD verwendet wurden; die Ergebnisse waren praktisch gleich.

In den obigen Beispielen kann die Verdünnung des IgE Antikörpers im Puffer stark variieren, was vom IgE Titer im Pferdeantiserum abhängt, der wiederum vom Pferd abhängt. Als geeignete Quellen für den IgE. Antikörper können auch andere Arten verwendet werden. Allgemein ist eine Verdünnung von etwa 1 Teil Antikörper in etwa 100-300 Teilen Puffer erfindungsgemäß geeignet, obgleich die vorliegende Erfindung selbstverständlich nicht auf diesen Bereich beschränkt ist'.

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Claims

Patentansprüche

i7V Verfahren zur Immunodiffusion unter Verwendung eines Gelmediums zur Bestimmung geringer Proteinkonzentrationen, dadurch gekennzeichnet, daß man in das Gelmedium etwa 0,5-5 Gew.-^, bezogen auf das Medium, eines Blockmischpolymerisates mit der Formel HO(C^H^O)^(C₃HgO)_&(C₂H^O)^H einverleibt, in welcher a eine solche Zahl ist, daß die durch (CUHgO) dargestellte hydro^w phobe Base ein Molekulargewicht von mindestens 950 hat und b eine solche Zahl ist, daß der durch (C₂H₄O) dargestellte hydrophile Teil etwa 50-90 Gew.-% der Verbindung ausmacht.
2.- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Protein IgE Antikörper verwendet wird.
3.- Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Blockmischpolymerisat etwa 80 % hydrophile Polyoxyäthyleneinheiten im Molekül enthält und der hydrophobe Polyoxypropylenanteil ein Molekulargewicht von etwa 950 hat.
4.- Immunodiffusionsplatte zur Bestimmung niedriger Proteinkonznetrationen im Blutserum, bestehend aus einer Platte und einem Gelmedium, das etwa 0,1-5 Gew.-% Gelierungsmittel aus der Gruppe von Agar, Agarose und Mischungen derselben und etwa 0,5-5 Gew.-% eines Blockmischpolymerisates der Formel H0(C₂H₄0)_b(C₃H₆0)_a(C₂H₄0)_bH enthält, in welchem a eine solche Zahl ist, daß die durch (C₃HgO) dargestellte hydrophobe Base ein Molekulargewicht von mindestens 950 hat und b eine solche Zahl ist, daß der durch (C₂H₄O) dargestellte hydrophile Anteil etwa 50-90 Gew.-% der'"Verbindung ausmacht.

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5.- Immunidiffusionsplatte nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich eine vorherbestimmte Konzentration an IgE Antikörper enthält.
6.- Immunidif fusionsplatte nach Anspruch 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Blockmischpolyraerisat etwa 80 % hydrophile Polyoxyäthyleneinheiten im Molekül enthält und der hydrophobe Polyoxypropylenanteil· ein Molekulargewicht von etwa 950 hat.
7.~ Immunodiffusionsplatte nach Anspruch 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Gelierungsmittel Agarose ist.

8,- Immunodiffusionsplatte nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Agarose etwa 0,5-1,5 Gew.-% beträgt.

Der Patentanwalt:

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