DE2501855B2 - Reagens und Verfahren zur Bestimmung von Leukozyten und Hämoglobin im Blut - Google Patents

Description

Bestundteil Anteil Wasser I Liter Kaliumcyanid 0,25 g Trimethyl-Tetradccylammoniumchlorid 35 g

6. Verfahren zur Bestimmung von Leukozyten und Hämoglobin im Blut, wobei ein Reagens mit einer Blutprobe in Reaktion gebracht wird, um Erythrozyten und Blutplättchen zu stromatolysieren und Hämoglobin in ein Chromogen umzuwandeln, dadurch gekennzeichnet, daß ein Reagens gemäß einem der Ansprüche I —5 verwendet wird.

Durch die Einführung von schnell arbeitenden automatischen hämatologischen Geräten, wie des Coulter-Zähler-Modells »S«, sind das Stromatolysieren von Erythrozyten mit hoher Geschwindigkeit sowie chromogenbildende Reagenzien notwendig geworden, die eine klare, stabile, reproduzierbare Lösung ergeben, deren optische Dichte direkt proportional zur Hämoglobinkonzentration ist In einem Gerät dieser Art wird Blut mit einem herkömmlichen Verdünnungsmittel vermischt Man erhält eine erste verdünnte Blutprobe. Einem Teil dieser Probe wird ein Auslösungsmittel hinzugefügt Man erhält so eine zweite verdünnte Blutprobe. Diese beiden Proben können beispielsweise ein Verdünnungsverhältnis von 224:1 aufweisen. Die Mischung verbleibt für kurze, aber ausreichende Zeit in der Auflösungskammer, wobei sich die roten Blutkörperchen auflösen und ihr Hämoglobin abgeben. Die daraus entstehende Suspension wird ein einer Leukozyten-Zählvorrichtung durch Meßöffnungen geleitet, wo die weißen Blutkörperchen elektronisch gezählt werden. In der gleichen Vorrichtung wird auch die Konzentration des in der Leukozyten-Zählsuspension enthaltenen Hämoglobins spektrophotometrisch bestimmt Sobald das Verhältnis von Erythrozyten zu Leukozyten im normalen Blut um 1000 :1 liegt, müssen die Erythrozyten schnell in sehr kleine Teile zerkleinert werden, um eine Störung der Leukozytenzählung zu vermeiden. Gleichzeitig dürfen keine Leukozyten zerstört werden, und das Hämoglobin muß in eine für die genaue photometrische Bestimmung geeignete Form gebracht werden.

Bisher wurden in schnell arbeitenden automatischen hämatologischen Geräten auflösende und cyanmethämoglobinchromogenbildende Reagenzien verwendet Diese erwiesen sich jedoch als nicht genügend stabil.

Es ist auch bereits bekannt, quartäres Ammoniumsalz vorteilhafterweise als Stromatolysiermittel zu verwenden, wobei die Erythrozyten sofort soweit zerstört werden, daß sie die Bestimmung der Leukozytenzahl nicht mehr beeinträchtigen und ein relativ stabiles Reagens bilden (siehe z. B. The American Journal of Clinical Pathology, Bd. 36, Nr. 3, S. 220 - 223, Sept 1961). Das quartäre Ammoniumion in dem Salz hat drei an Stickstoff angehängte kurze Alkylketten und eine lange Alkylkette.

Bei dem herkömmlichen Verfahren zur Bestimmung von Hämoglobin wird das Drabkin-Reagens verwendet, das Kaliumferricyanid, Kaliumcyanid und Natriumbikarbonat enthält Wenn diesem Reagens Hämoglobin zugefügt wird, wird das Kaliumferricyanid zu Kaliumferrocyanid redu. art, und das Hämoglobin wird zu Methämoglobin oxydiert Dieses reagiert mit dem Cyanidion, um das stabile Chromogen, Cyanmethämoglobin zu bilden, das photometrisch meßbar ist Das Drabkin-Reagens ist jedoch gegen Temperaturen unter Null nicht stabil.

Das Ferricyanidion hat die Tendenz, nichtlösliche Komplexe mit quartären Ammoniumverbindungen zu bilden. Daher kann eine Mischung des bekannten quartären Ammoniumverbindungsreagens mit dem Drabkin-Reaktionsmittel unzuverlässig sein, da das Ausfällprodukt, wenn auch nur leicht, die Leukozytenzählung fälschlicherweise erhöhen würde.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein genau arbeitendes und schnell wirksames stromatolysierendes und chromogenbildendes Reagens für schnell arbeitende automatische hämatologische Geräte zu schaffen, wobei das Reagens vorzugsweise nicht durch Temperaturen unter Null beeinträchtigt wird.

Diese Aufgabe wird nach der Erfindung durch eine ferricyanidiönenfreie, wäßrige Lösung gelöst, die quartäre Ammoniumionen und Cyanidionen enthält, wobei an den Stickstoff der quartären Ammoniumionen drei kurze Alkylketten und eine lange Alkylketten angehängt sind, und wobei die Ionen in einer solchen Menge vorhanden sind, die ausreicht, um Erythrozyten und Blutplättchen zu stromatolysieren und Hämoglobin in ein Chromogen umzuwandeln.

Das erfindungsgemäße Reagens ist eine stabile Verbindung, mit der Leukozyten und Hämoglobin mit der erforderlichen diagnostischen Genauigkeit be-

summt werden können. Insbesondere reduziert das Reagens Erythrozyten in kurzer Zeit zu sehr kleinen Teilen, ohne die Leukozyten zu zerstören. Es bildet kein Ausfällprodukt, das die Leukozytenbestimmung beeinträchtigen würde.

Das Reagens wandelt Hämoglobin in ein stabiles Chromogen um, dessen spektrale Eigenschaften denen von Cyanmethämoglobin ähneln und das für die genaue photometrische Analyse geeignet: Es wird dabei für die Analyse eine klare« stabile und reproduzierbare Lösung erzielt, deren optische Dichte direkt proportional zur Hämoglobinkonzentration ist

Erfindungsgemäß wird kein Ferrizyanidion verwendet, sondern nur Cyanidion zusammen mit einem quartären Ammoniumion, um Hämoglobin in ein stabiles, für die Analyse geeignetes Chromogen umzuwandeln. Es besteht daher keine Gefahr einer Komplex-Bildung auf Grund von Ferricyanidion. Das Reagens ist eine farblose Lösung.

Nachfolgend werden die bevorzugten Ausführungsbeispiele beschrieben.

Das erfindungsgemäße Reagens ist eine wäßrige, von Ferricyanid freie Lösung, die als aktive Ionen ein quartäre Ammoniumionen und Cyanidionen enthält. Jedes der Ionen kann in Form eines geeigneten Salzes mit einem Ion entgegengesetztes Vorzeichens vorhanden sein. Das quartäre Ammoniumion hat vorzugsweise die Form eines Salzes mit einem anorganischen Anion, insbesondere einem Halogenid, wie z. B. Chlorid oder Bromid, einem Sulphat, einem Phosphat oder einem Nitrat Das Cyanidion hat vorzugsweise die Form eines Salzes mit einem ynorganischen Kation, insbesondere einem Alkalimetallkation, z. B. Natrium- oder Kaliumkation. Die Lösung kann im v/esentk-hen aus solchen in Wasser gelösten Salzen bestehen.

Im allgemeinen ist das verwendete ,uartäre Ammoniumion von der bereits früher verwendeten Art eines Stromatolyseagens, wobei an den Stickstoff drei kurze Alkylketten und eine lange Alkylkette angehängt ist. Zweckmäßigerweise werden die kurzen Alkylketlen nachstehend mit RI₁ R2 und/oder R3 zwischen 1 und 4 Kohlenstoffatomen enthalten, wie sie durch Methyl-, Äthyl-, Propyl- und Butylradikale dargestellt werden. R4 kann im Bereich von etwa 10 bis 20 Kohlenstoffatomen liegen, die von Decyl bis Eicosyl reichen.

Das quartäre Ammoniumion wird durch ein in wäßriger Lösung von einer Konzentration von etwa 0,5 bis 10 Gew.-%, vorzugsweise etwa 1-5 Gew.-% enthaltenes quartäres Ammoniiimsalz dargestellt. Eine Lösung von solcher Konzentration wird als Auflösungsmittel verwendet und mit zuvor mit einem herkömmlichen Verdünner verdünnten Blut in einem Verhältnis von Ausfällmittel zu Verdünnerprobe von etwa I :8,6 wie oben beschrieben gemischt Wenn die anfängliche Verdünnung der Blutprobe am Anfang von der obigen Angabe verschieden ist, kann natürlich ein Auflösungsmittel mit einem anderen Verhältnis gewählt werden, um dieselbe Konzentration von reagierendem lon zu erhalten. Das quartäre Ammoniumion und seine Konzentration werden jeweils so gewählt, daß die erforderliche hämolytische Aktivität und Löslichkeit der quartären Ammoniumverbindung erzielt wird. Im allgemeinen nimmt die Löslichkeit der Verbindung mit zunehmender Zahl der Kohlenstoffatome ab, während die hämolytische Aktivität mit steigender Zahl von R4-Kohlenstoffatomen zunimmt Wenn beispielsweise Rl, R2 und R3 Methyl sind, kann R4 10-20 Kohlenstoffatome (ClO bis C20) enthalten, um in dem oben beschriebenen analytischen Verfahren eine ausreichende hämolytische Aktivität bei einer Konzentration von etwa 0,5% und mit RI, R2 und R3 = Methyl sollte R4 mindesetns etwa 14 Kohlenstoff atome aufweisen, um die erforderliche hämolytische Aktivität zu erzielen. Bei einer Konzentration von etwa 10% und mit Rl₁ R2 und R3 ·■= Methyl sollte R4 maximal etwa 16 Kohlenstoffatome enthalten, um die erforderliche Löslichkeit der Verbindung zu erzielen. Als weitere

ίο Beispiele kann bei R4 = Tetradecyl Rl, R2 und E.3 = Methyl, Äthyl oder Propylradikale in einer 0,5 — 10%igen Konzentration sein, wobei eine ausreichende hämolytische Aktivität und eine vollständige Lösung erreicht wird. Wenn R4 = Tetradecyl und Rl =

Methyl, ist R2 = Methyl oder Äthyl, und R3 = Butyl, wohei die hämolytische Aktivität ausreichend und die Verbindung bei 0,5 bis 5% löslich ist, während sie bei einer Konzentration von 10% nur unvollkommen löslich ist

2i) Das Reagens ist vorteilhaft so zusammengesetzt, daß die Lösung eingefroren und aufgetaut werden kann, ohne daß sich ein Teilchenüberschuß bildet, wodurch die Genauigkeit des Instruments überfordert und eine genaue Leukozytenzählung beeinträchtigt würde. Die-

J5 ses Instrument hat eine Genauigkeitsgrenze von etwa 200 Zellen. Wenn beispielsweise R4 = Decyl, Dodecyl oder Tetradecyl und Rl, R2 und R3 = Methyl, kann eine Lösung mit 5%iger Konzentration eingefroren und wieder aufgetaut werden, wobei sich in 0,5 ml weniger

jo als 200 Teilchen bilden, wie mit dem Coulter-Zähler FN bei Schwellenwerteinstellung für Blutkörperchen festgestellt wurde. Wenr< R4 = Tetradecyl und Rl, R2 und R3 = Methyl bis Propyl, kann eine 5%ige Lösung eingefroren und aufgetaut werden mit einer resultieren-

)-. den Zählung von weniger als 200 Teilchen. Wenn andererseits R4=C16 bis C20, und Rl, R2 und R3 = Methyl, übersteigt die Teilchenzählung nach dem Einfrieren und Auftauen einer 5%igen Lösung die Zahl 200. Ebenso übersteigt die Teilchenzählung die Zahl 200

JU nach dem Einfrieren und Auftauen einer 5%igen Lösung, wenn R4 = Tetradecyi, Rl = Methyl, R2 = Methyl oder Äthyl, und R3 = Butyl Rl, R2 und R3 haben dementsprechend vorzugsweise 1—3 Kohlenstoffatome, und R4 vorzugsweise 10-14 Kohlenstoff-

•r. atome.

Die Konzentration des Cyanidions wird vorzugsweise so gewählt, daß eine etwa 89%ige Umwandlung von Hämoglobin in ein Chromogen erfolgt In einer Lösung für den oben beschriebenen Zweck ist das Cyanidion

'κι z. B. vorzugsweise in »'iner Menge von 0,0006 bis 0,005 Mol, vorzugsweise mehr als ca. 0,001 Mol vorhanden. Ein Salz lieferndes Cyanidion wird in einem Molverhältnis verwendet, das die gewünschte Cyanidion-Konzentration ergibt, wobei dieses Molverhältnis bei einem

v, Salz mit einem einwertigen Kation beispielsweise ein Alkalimetall sein kann. Es können Umwandlungen in ein Chromogen mit bis zu etwa 96% des Hämoglobins erzielt werden. Das Chromogen wird bei 540 Nanometer spektrophotometrisch analysiert

Mi Nachfolgend wird ein spezielles Beispiel des erfindungsgemäßen Reagens beschrieben.

Beispiel

Stromatolysierendes und chromogenbildendes Reagens, das im Coulter-Zähler-Modell S verwendet werden kann:

Bestandteil Verhältnis

Wasser
Kaliumcyanid
Trimethyl-Tetradecylammoniumchlorid I Liter

0,25 g (0,00385 Mol)

35 E (3,38%)

Die Verbindung hat einen pH-Wert von etwa 9. Bei Verwendung zur Analyse mit einem handelsüblichen gepufferten unter der Bezeichnung ISOTON bekannten to BlutverdOnnungsmittel und bei Anwendung des vorliegenden Verfahrens beträgt der pH-Wert der endgültigen Lösung ca. 7,6.

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Reagens zur Bestimmung von Leukozyten und Hämoglobin im Blut, gekennzeichnet durch eine ferricyanidiönenfreie wäßrige Lösung, die quartäre Ammoniumionen und Cyanidionen enthält, wobei an den Stickstoff der quartären Ammoniumionen drei kurze Alkylketten und eine lange AJkylkette angehängt sind, und wobei die Ionen in einer solchen ι ο Menge vorhanden sind, die ausreicht, um Erythrozyten und Blutplättchen zu stromatolysieren und Hämoglobin in ein Chromogen umzuwandeln.

2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die quartären Ammoniumionen durch is ein quartäres Ammoniumsalz gebildet werden, das in der Lösung in einer Konzentration zwischen etwa 0,5 und 10 Gew.-% enthalten ist, und daß die Cyanidionen in einer Konzentration zwischen etwa 0,0006 und 0,005 Mol vorhanden sind. >o

3. Reagens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das quartäre Ämmonium-Trimethyitetradecyl-Ammoniumhalogenid, -sulphat, -phosphat, oder -nitrat is«, und daß die Cyanidionen von einem in der Lösung enthaltenen Alkalimetallcyanid r> stammen.

4. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die kurzen Alkylketten jeweils 1 bis 3 Kohlenstoffatome und die lange Alkylkette 10 bis 14 Kohlenstoffatome enthält u>

5. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer Lösung besteht, die folgende Bestandteile und Anteile enthält: