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Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren aus N-Acyl-D,L-aminosäuren.
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Synthetische L-Aminosäuren, speziell die essentiellen Aminosäuren
L-Phenylalanin, L-Tryptophan, L-Methionin, L-Lysin etc., sind von großer wirtschaftlicher
Bedeutung. In der Ernährungsindustrie, der Humanmedizin und der Tierzucht finden
sie breite Anwendung.
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Spezielle, in der Natur nicht vorkommende L-Aminosäuren, wie L-4-Fluor-
oder Chlorphenylalanin, 7-Azatryptophan, S-Alkyl- oder Aryl-L-cysteine, L-ß-Thienylalanin
etc. werden in der Mikrobiologie' Genetik, Pharmakologie, PIyehopharmakologie, Krebsforschung
und Gewebezüchtung verwendet. Gewisse L- oder D-Formen von Aminosäuren dienen zur
Synthese von Penicillinen oder im Rahmen der Affinitäts= chromatographie als an
Trägersubstanzen gebundene enzymaffine Rezeptoren.
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Die technische oder labormäßige Aminosäuresynthese führt zu den razemischen
Formen. Die erhaltenen Razemate müssen anschließend nach verschiedenen Methoden
in die Enantiomeren getrennt werden Chemisch erfolgt eine Trennung durch Salzbildung
mit optisch aktiven Basen oder optischaktiven Säuren. Nicht selten sind dabei zusätzliche
Schritte wie die Bildung von N-Acylderivaten, Amiden oder Estern sowie die Verseifung
dieser Derivate nach der Trennung von D-und L-Form erforderlich. Die umständliche
und zeitraubende fraktionierte Kristallisation, die zahlreichen Reaktionsschritte
und die Kostspieligkeit der optisch aktiven Basen bzw. Säuren macht diese Methode
sehr unwirtschaftlich.
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Häufig setzt man deshalb enzymatische Methoden zur Auftrennung vqn
Razematen ein Einwirkung von spezifischen Aminosäure-Oxydasen auf a die Razemate.
Hierbei wird eines der Enantiomeren abgebaut und geht verloren.
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Einwirkung von Peptidasen auf D,L-Aminosäureamide bzw Ester, wobei
sich die freien L-Aminosäuren bilden. Dieser Methode stehen die Kostspieligkeit
und Instabilität der Enzyme und die umstänliche Umwandlung der Razemate in die Amide
häufig im Wege,
Für die Spaltung von N-Acyl-DL-aminosäuren gibt
es eine Reihe von enzymatischen Verfahren
| Mit Anilin und Phenylhydrazin bilden si 4 lösliche |
| Anilde und Phanylhydrazide aus denen durch Verseifung(in Gegen= |
| wart von Papain oder Ficidie freien L-Aminosäuren erhalten |
werden können0 Diese Reaktion ist jedoch nur selten von genügender Stereospezifität.
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Nieren-Acylasen und Pankreas-Carboxypeptidase spalten zwar sehr stereospezifisch
die N-Acyl-D,L-aminosäuren zu L-Aminosäuren, während die acylierte D-Aminosäure
unangegriffen zurückbleibt, doch stehen diesem Verfahren insbesondere bei der technischen
Anwendung dadurch große Nachteile entgegen, weil die Gewinnung der Enzyme sehr umständlich
und kostspielig ist und die Enzyme selbst bei tiefen Temperaturen nur eine geringe
Haltbarkeit besitzen.
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Neuerdings verwendet man statt der tierischen auch pflanzliche Acylasen
aus Aspergillus und Penicillium-Arten. Hier= zu ist aber eine selektierXende Züchtung
verschiedenster Aspergillus- bzw. Penisillium-Stämme erforderlich, da die Acylasen
oft nur spezifisch für bestimmte Aminosäureklassen wirksam sind. Schon aus dieser
Tatsache aber auch aus den technisch aufwendigen Züchtungsverfahren ergeben sich
deshalb erhebliche Nachteile.
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Es wurde nun überraschend gefunden, daß die Fruchtkörper höherer Pilze
( BASIDIOMYCETEN , ASCOMYCETEN ), die in der Natur gesam= melt oder häufig für Speisezwecke
gezüchtet werden, hochaktive und äußerst stabile Enzyme enthalten, die in der Lage
sind aus N-Acyl-D,L-aminosäuren spezifisch die freien L-Aminosäuren freizusetzen.
Die Enzyme sind deshalb für die Gewinnung von L-Aminosäuren sowohl im technischen
wie auch im labormäßigen Maßstab besonders geeignet, gleichgültig ob es sich um
L-Aminosäuren für die Forschung oder für die praktische Anwendung im therapeutischen
oder tierzüchterischen Bereich handelt.
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Insbesondere die N-Acyl-Derivate aromatischer Aminosäuren, wie zum
Beispiel Phenylalanin und Kernsubstituierte Derivate hiervon und Tryptophan und
Derivate bzw. Analoga davon, wie 7-Aza= tryptophan, die gegen Carboxypeptidase und
Nieren-Acylase III relativ resistent sind, werden durch Basidiomyceten-Enzyme gut
gespalten.
Die enzymatische Spaltung ist streng stereospezifisch,
d. h0 die N-Acyl-DX-Aminosäuren bleiben unverändert im Reaktions= gemisch zurück.
Sie können aus dem Reaktionsgemisch durch Extraktion oder durch säulenchromatographische
Operationen an Anionenaustauschern isoliert werden. Die N-Acyl-D-aminosäuren können
dann nach bekannten Methoden durch Behandeln mit Acetanhydrid razemisiert werden
oder auch durch bekannte chemische Methoden in die D-Aminosäuren überführt werden.
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Pilzpulver und Pilzenzyme enthalten reichlich Tyrosinase oder L Laccase,
daher müssen Tyrosin, DOPA und 5-Hydroxytryptophan in die O-Benzylderivate überführt
werden, bevor man die Razemattrennung nach dem beschriebenen Verfahren durchführt0
Im Anschluß an die Trennung entfernt man die Benzylgruppen in bekannter Weise durch
katalytische Hydrierung.
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Zur Durchfihrlng des Verfahrens werden die N-Acylaminosäuren in Wasser
in Gegenwart äquivalenter Mengen basicher Stoffe, ( wie beispielsweise Natriumhydrogenkarbonat
oder Kaliumhydrogenkarbonat,
oder Lithiumkarbonat, Natriumkarbonat oder Kaliumkarbonat ) oder in Gegenwart schwachbasischer
Pufferlösungen gelöst. Dann setzt man frische Pilzfruchtkörper, zum Beispiel des
Zuchtchampignons, Agaricus bisporus, in der gleichen oder doppelten Gewichtsmenge
der Acylaminosäure zu und homogenisiert sie im Reaktionsgemisch. Man fügt noch geringe
Mengen eines Konservierungsmittels, zum Beispiel Toluol, hinzu und inkubiert bei
30 bis 40 Oc. Der Ablauf der Reaktion wird dann durch eine laufende papierchromatographische
oder dünnschichtchromato= graphische Kontrolle oder durch photometrische Bestimmungen
verfolgt, wodurch der Endpunkt der Spaltungsreaktion erkannt wird.
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Nach Abtrennen der Pilzfragmente durch Filtration, Zentrifugation
oder hygaulisches Abpressen wird das Filtrat nach bekannten Methoden aufgearbeitet
a) man konzentriert das Flitrat im Vakuum und scheidet nach Sktivkohlebehandlung
die freie L-Aminosäure durch vorsichtige Zugabe von Säure beim isoelektrischen Punkt
abß b) man säuert stark an und extrahiert die N-Acyl-D-aminosäure mit einem Extraktionsmittelt
zum Beispiel Äthylacetat, aus. Nach Konzentrierung bringt man mit konz. Ammoniak
die Lösung auf den pH des isolelektrischen Punktes und scheidet die L-Aminosäure
abß c) man behandelt das Filtrat mit einem basischen Ionenaustauscher in der Acetatform,
entfernt so die N-Acyl-D-Aminosäure und gewinnt die L-Aminosäure wie bei a0 und
b. Aus dem Harz gewinnt man durch Eluieren mit verdünnter Essigsäure oder Salzsäure
die N-Acyl-D-aminosäure zur weiteren Verwendung.
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d) man gibt das Filtrat durch eine Kationenaustauschersäule in der
H-Form, wobei dieLAminosäure zurückgehalten wird. Aus dem Durch = lauf gewinnt man
die N-Acyl-D-aminosäure. Mit 3-prozentigem Ammoniak löst man die L-Amninosäure aus
der Säule. Das Eluat rd konzentriert, mit Aktivkohle behandelt, auf den richtigen
pH-Wert eingestellt. Die Kristallisation der L-Amninosäure kann f@@ch Zugabe von
Alkohol beschleunigt bzw. vervollständigt w@@@@.
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Anstelle frischer Pilze können auch getrocknete Pilzruchtkörper verwendet
werden. Dieses pulverisierten getrockneten Pilzmateria= lien halten bei schonendem
Trocknungvorgang jahrelang ihre volle Enzymaktivität. Bei der Reaktion verwendet
man auf 2 bis 8 Teile N-Acyl-D,L-aminosäure ein Teil Pilzpulver.
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Aus den homogenisierten frischen Pilzfruchtkörpern oder aus dem
Pulver schonend getrockneter P Wfruchtkörper lassen sich mit Wasser oder mit M/15
Phosphatpuffer oder mit Lithiumchlorid-Lösung die Enzyme mit Acylaseaktivität nahezu
quantitativ digerieren. Durch 85-prozentige Sättigung solcher Pilzextrakt= lösungen
mit Ammoniumsulfat bei möglichst tiefer Temperatur oder
durch Zugabe rüberschüssigem Alkohol oder Aceton in der Kälte lassen sich die Enzyme
ausfällen und somit in konzentrierter Form anrei= chern. Nach Abzentrifugieren dialysiert
man gegen fließendes Wasser und lyophilisiert anschließend0 Man erhält ein lockeres
nicht hygroskopisches Enzymkonzentrat mit hoher Acylase-Aktivität9 die sich auch
bei längerem Lagern kaum verändert. Dieses Rohenzym kann direkt in den Enzymprozeß
eingesetzt werden0 Für besondere Zweckeist es auch möglich, weitere Reinigungs=
schritte vorzunehmen0 Über die Absorption an Calziumphosphatgel und stufenweise
Desorption mit Phosphatpuffer vom pH 8,5, durch Chromatographie an Hydroxylapatit
und DEAE- oder CM-Cellulose, Dialyse und präparativer Gelelektrophorese führt die
Reinigung zu einem Enzympräparat mit den Eigenschaften einer Carboxypeptidase mit
sehr hoher Umsatzrate bei der stereospezifischen Spaltung der N~Acyl-L-aminosäurenO
Daneben gewinnt man bei diesem Reini= gungsprozess eine ganze Reihe von Begleitenzymen.
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Die aus den Pilzpulvern gewonnenen Enzymkonzentrate laßen sich ohne
großen Aktivitätsverlust an geeignete Träger binden und in dieser Form in kontinuierlichen
Säulenverfahren für die Gewinnung voV> L-Aminosäuren einsetzen, Als Ausgangsmaterial
für die Gewinnung der Basidiomyceten- und Ascomyceten-Acylase kommen neben den Pilzfruchtkörpern
vor allem auch frische Pilzabfälle, wie sie bei der Pilzverarbeitung in der Nahrungsmittelindustrie
und in Konservenfabriken anfallen, von Champignon, Zuchtchampignon, Steinpilz, Morcheln
etc, in Frage, Aber auch beliebige Pilze, wie sie im Sommer, Herbst bis hinein in
den Winter in großen Mengen gesammmelt werden können,
- Clitocybet
nebuîar sF Pholiota mutabilis, Bov
ste, Hyp
oma-, Lactarius-, Russuia-, Agaricus-, Tricholoma-1Boletus-Arten und andere - oder
holzzerstörende Pilze - Trametes-, Stereum-, Pleurotus-, Polyporus-Arten und andere
- die das ganze Jahr über an Holz und Baumstubben gefunden werden, sind in frischer
oder getrockneter Form als Enzymquellen geeignet und können als solche direkt,
in frischer oder getrockneter Form für die enzymatische Gewinnung der L-Aminosäuren
oder als Ausgangsmaterial für die Isolierung der Acylasen verwendet werden.
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Wir haben ferner ge(ffunden, daß sich die einzelnen Pilzarten oft
sehr stark in ihrer Substratspezifität unterscheiden können.
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Während die aliphatischen L-Aminosäuren allgemein leicht von allen
Pilzarten aus den N-Acyl-D,L-Aminosäuren gebildet werden, müssen für die enzymatische
Gewinnung aromatischer L-Aminosäuren vom Typ des Phemylalanins und Tryptophans und
ihrer ringsubstituierten Derivatssowie ihrer Analoga wir Thienylalanin, Azatryptophan,
1- und 2-Naphthylalanin u.a. selektierte Pilzarten eingesetzt werden. um die Enzymspaltung
möglichst rationell zu gestalten.
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Allerdi
eine Aktivität bei allen Pilzarten mehr oder weniger vorhanden. Für die enzymatische
Spaltung von N-acyliertem Tryptophan und Derivaten bzw. Analoga fanden wir Lactarius-Arten,
wie zum Beispiel den Massenpilz Lactarius quietus, und den Birkenpilz ( Leccinum
scaber ) besonders geeignet,
sich die Spaltung aber auch mit Agaricus bisporus, Clitocybe nebularis, Tricholoma
eorgii und anderen befriedigend durch führen läßt.
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Für N-Acyl- enylalanin, seine Ringsubstituierten Derivat und seine
Analoga kommen Cliticybe nebularis, Agaricus bisporus, Trametes versicolor, Trametes
confragosa Polyporus varius in Frage, während
Hyp
oma-Boletus-, Suillus-Arten wegen ihres Gehaltes an Decarboxylasen für aromatische
Aminosäuren ungeeignet sind.
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Der Einsatz selektierter Pilzarten oder daraus hergestellter Enzymetst
besc
ers angezeigt, wenn es sich um die rasche Bereit stellung seltener, empfindlicher
oder in besonderer Weise strukturierter Amniosäuren handelt, wie sie oft in der
Biochemie, Mikrobiologie, Pharmakologie und Enzymologie im Labormaßstab benötigt
werden. Zum Beispiel laßen sich aus N-Acetylamidoac@yl=
| säure durch dditio erivate von N-Acetyl-D,L-C st in gewinnen |
| von aromatischen und aliphatischen Thiolen |
die aber bei der Verseifung zum großen Teil zerstört werden, besonders
wenn es sich dabei um die Spaltung der Sulfoxyde handelt. S-Propyl-L-cysteinsulfoxyd,
Alliin oder S-Furfuryl-L-cystein lassen sich beispielsweise ohne Verluste mit Hilfe
von Pilzpulver der obengenannten Basidiomyceten oder ihren vorgereinigten Enzymen
bei Bedarf aus den Acetylderivaten herstellen0 Als Acylreste kommen neben dem Acetylrest
auch Chloracetyl-, Benzoyl-, Carbobenzoxy-Hippuryl- und Carboxybenzylglycylso wie
andere Reste in Frage. Basidiomyceten und Basidiomyceten= enzyme spalten auch Di-
und Oligopeptide, so daß sie auch für analytische und protein-präparative Zwecke
eingesetzt werden können.
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Beispiele, 1.) Gewinnung von Enzymkonzentraten aus Pilzfruchtkörpern.
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a) Frische Fruchtkörper von Pilzen ( einer Sorte oder auch verschiedener
Sorten ) werden in soviel m/15 Phosphatpuffer pH7,5 homogenisiert, daß ein dünner,filtrierbarer
oder zentri= fugikerbarer Brei entsteht.
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b) 100 g Pilzpulver werden mit 3 1 m/15-Phosphatpuffer pH 7,5 eine
Stunde gerührt0 Das-nach a) oder b) erhaltene Produkt wird abgepreßt oder zentri=
fugiert und dann noch einmal durch eine dicke Schicht Celit filtriert. Der Pilzrückstand
wird verworfen.
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Man kühlt nun das Filtrat auf unter 100 at nd gibt unter stän= digem
Rühren fein gepulvertes Ammoniumsulfat zu bis eine ca.
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85 proz. Sättigung erreicht ist. ( 80 - 90 g auf 100 ml Filtrat )
Man läßt einige Stunden absitzen, saugt den inaktiven Uberstand ab und zentrifugiert
den Niederschlag0 Der gewonnene Niederschlag wird unter Rühren in wenig m/15 Phosphatpuffer
aufgenommen und wiederum stark zentrifugiert. Der Überstand wird ziflxi isoliert
und über Nacht gegen Leitungswasser dialysiert0 Die dialysierte Enzymlösung wird
mit soviel niedrigviskosem Polyvinylalkohol oder Gummi arabicum versetzt, daß die
Zusätze in 0,01 * Lösung vorliegen. Die Lösung wird gefriergetrochnet und das getrocknete
lockere
pulver gewogen und gewichtsmäßig auf die eingesetzte Pilzmenge bezogene Beispiel
2: Wie im Beispiel 1 werden frische Pilzfruchtkörper oder Pilzpulver in gleichen
Mengenverhältnissen statt mit Phosphatpuffer mit 2 prozentiger Lithiumchlorid-lösung
homogeni= siert bzw. verrührt. Das Zentrifugat bzw. Filtrat wird stark abgekühlt
und die 5-fache Menge stark gekühlten äthanols langsam eingerührt. Man läßt kurz
absitzen und zentrifugiert den Nieder= schlag scharf ab wäscht ihn noch 2 bis 3
mal mit kaltem 45~ prozentigem Äthanol, Der Rohenzymrückstand wird über CaCl2 im
Vakuum scharf getrocknet, ausgewogen und gewichtsmäßig auf die Pilzeinwaage bezogen,
Anm. : Bei schleimigen und fleischigen Fruchtkörpern ist der erhaltene Rohenzymrückstand
beträchtlich größer als bei den holzigen Fruchtkörpern der Trametes - oder Polyporus-ArtenO
Die nach Beispiel X 1 und 2 erhaltenen Rohenzympulver können an
Stelle der in den folgenden Beispielen verwendeten frischen Pilze und Pilzpulver
verwendet werden.
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Beispiel 3:
L-Methioninx aux N-Acetyl-D.L-Methionin ( als allgemeine Vorschrift, die ebenfalls
für die Gewinnung von L-Äthionin, L-Valin, L-Leucin, L-2-Aminobuttersäure, L-Alanin
angewendet wird.
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Statt des Acetylrestes kann auch der Formyl-, Chloracetylt Trifluoracetyl-,
Benzoyl-, Nitrobensoyl-,Hippuryl-,Carbobenzoxy-, und Carbobenzoxyglycylrest als
N-Acylrest stehen0 1 Mol N-Acetyl-D,L-Methionin wird fein gepulvert und mit 3 Litern
Wasser verrührt. Nach Zugabe von 100 g KHC03 wird bis zum Eintreten der Lösung gerührt.
Die Lösung wird dann mit 50 g Pilzpulver versetzt.
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Bas Pilzpulver wurde in folgender Weise hergestellt Frische Fruchtkörper
von Agaricus bisporus, von Boletus-oder -Suillis-Artens von Armillaria mellea, Gyromitra
esculenta,
Russula Arten oder anderer in der Konservenindustrie
verwendeter Pilze oder frische Abfälle der Stiele und Fruchtkörper, in dünne Scheiben
zerschnitten und an einem trockenen Ort oder in einem Trockenschrank mit Umluft
bei etwa 40 - 50 OC getrocknet0 Das getrocknete Material, etwa 10 * des frischen
Ausgangsmaterials, wird fein gemahlen und das Pulver trocken und kühl aufbewahrt.)
Zur Konservierung der Reaktionslösung werden einige ml Toluol zugegeben. Unter gelegentlichem
Umrühren läßt man die Reaktions= mischung bei 30 bis 40 OC inkubieren. In Zeitabständen
werden Proben entnommen und durch semiquantitative PC oder DC mit dem Fließmittel
BEW 4 : 1 : 1 und Ninhydrinlösung ( 0,2 ffi in Aceton) auf Fleckengröße der gebildeten
L-Aminosäure im Vergleich zu einer Konzentrationsreihe der betreffenden Aminosäure
geprüft, bis die Spaltung vollständig ist.
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Man filtriert oder preßt die Reaktionsmischung ab, wäscht den Rückstand
nochmals mit Wasser aus und schickt Filtrat und Wasch= wasser durch eine große Säule,
die mit einem stark sauren Ionen= austauscher in der H-Form gefüllt ist. Der stark
saure Durchlauf wird mit Äthylacetat extrahiert. Die über Natriumsulfat getrock=
nete Phase wird eingedampft und die als Trockenrückstand erhaltene N-Acyl- D-aminosäure
mit Acetanhydrid zur Razemisierung erhitzt, oder gegebenenfalls zur D-Aminosäure
aufgearbetet.
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Die lonenaustauschersäule wird mit Wasser gewaschen zund anschließend
solange mit 3 bis 5 prozentiger Ammoniaklösung eluiert, bis das austretende Eluat
stark alkalisch reagiert und bei der Tiifelprobe auf Filterpapier mit Ninhydrinlösung
keine Violettfärbung mehr gibto Das L-Aminosäure-haltige Eluajwird auf ein kleines
Volumen im Vakuum eingeengt, wobei sich die L-Aminosäure abzuscheiden beginnt, Man
erhitzt dann zum Sieden, sdtzt Aktivkohle hinzu und erhitzt einige Minuten unter
Umrühren weiter. Die heiße Lösung wird durch einen Büchnertrichtr auf dessen Filter
man gereinigtes Kieselgur ( Hyflo oder Celit ) als wässrigen Brei aufgegossen hatte,
filtriert. Das klare Filtrat wird noch heiß mit
Äthanol versetzt
und die rasch einsetzinde Kristatisation durch Rühren und Abkühlen beschleunigt.
Nach Stehen im Eisschrank wird abgesaugt und der kristallihe Rückstand mit etwas
Alkohol gewaschen. Die
Mutterlauge wird konzentriert und nach nochmaliger Aktivkohlebehandlung eine weitere
Menge L-Aminosäure erhalten.
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Zur Reinigung wird die erhaltene L-Aminosäure in wenig Wasser heiß
gelöst, nochmals mit Aktivkohle behandelt und wiederum durch eine Kieselgurschicht
filtriert. Die Aufarbeitung erfolgt in üblicher beschriebener Weise.
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Zur analytischen Bestimmung werden die optischen Dr
hunger 1 - 2 prozentiger wässriger oder salzsaurer Lösungen bestimmt.
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Für alle oben angegebenen L-Aminosäuren entsprachen die gemessenen
Drehungswinkel den in der Literatur angegebenen Werten.
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Beispiel 4 : L-Phenylalanin aus N-Acetyl-D.L-phenylalanin ( als allgemeine
Vorschrift, die ebenfalls für die Gewinnung von L-4-Fluor-, 4-Chlor-, 4-Nitro-,
3,5-Dijod-4hydroxy-, 3-Jod-4-hydroxy-, 3-Nibro-4-hydroxy- Phenylalanin, L-Thyronin,
31,51 ,3-Trijod- t ,5',3,5-Tetrajod-L-Thyronin und die O-Benzylderivate von Tyrosin,
DOPA angewendet wird ) 1 Mol N-Acetyl-D,L-phenylalanin und 1 Mol NaHC03 werden in
3 1 Wasser gebracht und unter Rühren gelöst. Man läßt die Lösung auf
40 0 abkühlen und versetzt unter Rühren mit 50 bis 100 g Pilzpulver von Trametes
versicolort Trametes confragosa, Poly= porus varius, Clit
ocybe nebularis u.a.
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Nach Zugabe von etwa 5 ml Toluol inkubiert man mehrere Tage bei 35
OC bis die PC- oder DC-Analyse die Beendigung der Enzymreaktion erkennen läßt. Die
Mischung wird abgepreßt oder abgesaugt. Filtrat und Waschwasser werden durch eine
Säule mit stark basischem Anionenaustauscher in der Acetatform
gegebendabei wird das nicht gespaltene N-Ace tyl-D
-phenylalanin zurückgehalten.
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Der Durchlauf wird im Vakuum stark eingeengt bis ein Kristallbrei
entsteht. Durch Erhitzen löst man die Kristalle, setzt Aktivkohle hinzu und filtriert
nach weiterem Erhitzen durch eine Celitschicht.
Man gibt Äthanol
hinzu und läßt in der Kälte auskristallisieren0 Aufarbeitung der Mutterlauge und
nochmaliges Umkristallisieren ergehen in fast theoretischer Ausbeute L-Phenylalanin.
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Die lonenaustauschersäule wird mit 10 zeiger Essigsäure solange eluiert
bis das ix N-Acetyl-D-phenylalanin ausgewaschen ist. Das n eigedampfte Eluat wird
mit Acetanhydrid razemisiert.
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BeisPiel 5 : L-Trvotophan aus N-Acetyl-D,L-tryptophan ( als allgemeine
Vorschrift,die ebenfalls für die Gewinnung von L-7-Azatryptophan, 5-Chlortryptophan,
5-Fluor-tryptophan , 5-MethoxytryptQphan angewendet wird ) 1 Mol N-Acetyl-D,L-tryptophan
und 1 Mol Lithiumkarbonat werden in 3 bis 5 1 Wasser wie im Beispiel 3 und 4 gelöst.
Dann werden 100 bis 200 g Pilzpulver von Leccinum scaber (Birkenröhrling) oder Lactarius
quietus ( Eichenreizker ) hinzugegeben.
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Die PC- bzw. DC-Kontrolle erfolgt wie in Beispiel 3 und 4 mit BEW
4:1:1 jedoch mit p-Dimethylaminobenzaldehyd-HCl als Sprffh= reagenz. L-Tryptophan
und das höher wandernde N-Acetyl-D-tryptophan werden als violette Flecken erhalten.
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Die Aufarbeitung des Reaktionsansatzes erfolgt wie in den obigen Beispielen.