DE2215853A1

DE2215853A1 - Racematspaltung ringsubstituierter Phenylalanine

Info

Publication number: DE2215853A1
Application number: DE19722215853
Authority: DE
Inventors: Normand Leo Vanier; Tong Jeffrey Hing Yin; DIorio Antoine; Ottawa; Ontario; Petitclerc Jean Claude Sherbrooke Quebec; Benoiton (Kanada)
Original assignee: Canadian Patents And Development Ltd., Ottawa
Priority date: 1971-04-02
Filing date: 1972-03-30
Publication date: 1972-10-19
Also published as: US3813317A; CA947214A; GB1324588A

Description

Die Erfindung betrifft die enzymatisch^ Spaltung racemischer mono- und di-ringsubstituierter Phenylalaninderivate, die durch Methoxyl, Hydroxyl, Chlor oder Fluor substituiert sind, insbesondere betrifft sie die enzymatische Spaltung von racemischem DL-3,4— Dihydroxyphenylalanin zur Erzeugung von L-3,4— Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA), sowie die Spaltung von 3-Hydroxy-DL-phenylalanin zur Gewinnung von L-m-Tyrosin.

Viele Phenylalaninderivate sind von Nutzen. Insbesondere wurde L-3,4»Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) erfolgreich bei der Behandlung von vier pathologischen Zuständen verwendet:

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der Parkinson'sehen Krankheit, der Huntington Chorea, der Dystonia musculorum deformans und der Manganvergiftung (die bestimmte Bergleute befällt). Die Krankheit von größerem Interesse ist die Parkinson·sehe Krankheit. L-m-Tyrosin ist auch für die Verwendung bei der Behandlung des Parkinsonismus vorgeschlagen worden. Es wurde auch gezeigt, daß bei Mäusen p-Chlorphenylalanin deutlich Toleranz und physikalische Abhängigkeit sent wicklung gegenüber Morphin herabsetzt, und so ein neues Mittel zum Studium der Narkdtikasucht liefern würde. Die D-Isomeren ringsubstituierter Phenylalanine sind in der Forschung von Wert, sind aber nach anderen Verfahren nicht leicht zugänglich.

L-DOPA wurde zur Behandlung des Parkinsonismus unter ärztlicher Aufsicht empfohlen, ist aber teuer. Ein Grund für die Kostspieligkeit des Arzneimittels liegt in der Schwierigkeit der Trennung der D- und L-Isomeren. Ein weiteres Hindernis seiner Verwendung als Arzneimittel liegt darin, daß viele unerwünschte Nebenwirkungen beobachtet wurden. Es wurde vermutet, daß diese möglicherweise auf Verunreinigungen in den derzeit verfügbaren Präparaten beruhen könnten.

Das Problem, optisch reines L-DOPA und andere L-Phenylalaninderivate zu erhalten, hat beträchtliche Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Es wurden Versuche gemacht, solche Produkte durch Extraktion, durch Synthese, durch Einwirkung von Mikroorganismen und durch Spaltung geeigneter Substrate sowie durch enzymatische Einwirkung auf racemische, N-ungeschützte Aminoester und andere Derivate zu erhalten.

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Es ist auch bekannt, daß die bevorzugen Substrate für Chymotrypsin die aromatischen Aminosäuren, z.B. Phenylalanin und Tyrosin, sind. Jedoch wurde allgemein angenommen, daß nur JS-substituierte Derivate gute Substrate wären. So wird in Chemistry of the Amino Acids, Greenstein and Winitz, Wiley & Sons, 1961, S. 737, festgestellt: "Sie Anwendung dieser Methode als allgemeines Spaltungsverfahren ist ziemlich beschränkt, nicht nur, weil unter den angewandten Bedingungen spontane Hydrolyse der Ester möglich ist, sondern auch, weil einige der Aminosäureester in Gegenwart von Chymotrypsin zur Polymerisation und zur Bildung höherer Peptide neigen.¹¹ Darüberhinaus wurde bislang angenommen, daß Chymotrypsin nicht stereo-spezifisch bezüglich IT-ungeschützter Aminosäureester wäre.

Die der Erfindung zugrundeliegende technische Aufgabe ist die /affung eines Verfahrens zur Herstellung von L-lsomeren in guten Ausbeuten und in optischen Reinheiten von mindestens 99,8 %. Es besteht daher ein Bedürfnis für die Spaltung von racemischen mono- und diringsubstituierten Phenylalaninen. Das Hauptziel der Erfindung ist also die Schaffung eines Verfahrens zur enzymatisch en Spaltung von mono- und di-ringsubstituierten Phenylalaninen, z.B. die enzymatische Spaltung von racemischem 3,4-Dihydroxyphenylalanin, um L-DOPA und einen D-DOPA-Ester zu liefern, oder die enzymatische Spaltung von racemischem 3-Hydroxyphenylalanin, .um L-m-Tyrosin und einen D-m-Tyrosin-Ester zu liefern.

Die vorstehend beschriebene Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Bildung eines Esters eines Alkohols mit 1 bis 4- Kohlenstoffatomen mit dem Eacemat;

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sodann Aussetzen des racemischen Esters der Wirkung eines Chymotrypsins, z.B. Λ-Chymotrypsins bei einem sauren pH, z.B. 5 - 7i entweder als solcher oder an einen festen Träger gebunden; und Gewinnen der L-Isomerensäure mit einer optischen Reinheit von wenigstens 99»8 % als Fällung aus dem Reaktionsgemisch, die praktisch frei ist vom D-Isomerenester.

Die gemäß den allgemeinen Prinzipien des erfindungsgemäßen Verfahrens spaltbaren racemischen mono- und di-ringsubstituierten Phenylalanine sind chlor-, fluor-, hydroxy- und methoxy-substituiert. !Typische Beispiele umfassen namentlich die folgenden; 3,4—Dihydroxyphenylalanin (DOPA), 4-Chlor-phenylalanin, 4—Fluor-phenylalanin, 4-Hydroxy-phenylalanin (Tyrosin), 3-Hydroxy-phenylalanin (m-Tyrosin), 2-Hydroxy-phenylalanin (o-Tyrosin) und 2-Methoxy-phenylalanin.

Der gebildete Ester ist der eines aliphatischen Alkohols mit verhältnismäßig kleiner Kohlenstoffkettenlänge. Mit zunehmender Kettenlänge wird der Ester weniger wasserlöslich und durch das Enzym langsamer hydrolysiert. Beispiele für geeignete solche Ester umfassen die Ester der folgenden Alkohole: Methyl-, Äthyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, sec.-Butyl- und Isobutyl-Alkohol.

Bei einem bequemen Verfahren zur Herstellung der Ester wird der Alkohol dem racemischen Phenylalanin zugesetzt und HCl-Gas direkt zur Bildung des Esters durchgeperlt.

Während der Hydrolyse durch das Enzym wird die L-Isomerensäure aus dem racemischen Gemisch der Ester freigesetzt Das L-Isomere kann direkt als Fällung gewonnen werden, oder die Flüssigkeit kann zuerst konzentriert und dann das L-Isomere ausgefällt werden. Das D-Isomere wird dann in der fol-

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genden Weise in Form des Esters gewonnen: die Flüssigkeit wird zunächst basisch gemacht und der Ester darm unter Verwendung irgendeines herkömmlichen organischen Lösungsmittels für Ester, z.B. Äthylacetat, extrahiert. Die D-Isomeren in der freien Säureform können durch Verseifen der D-Ester nach der Extraktion gewonnen werden.

Das bevorzugt verwendete Enzym ist ein Chymotrypsin, das X-Chymotrypsin und aktive Vorläufer, nämlich (/-Chymotrypsin und J"-Chymo trypsin umfaßt. Das bevorzugte Enzym jedoch ist Ck,-Chymotrypsin (E.G. 3,4,4,5). Die Menge des verwendeten Enzyms ist verschieden und ist keineswegs kritisch. Eine geringere Enzymmenge senkt die Kosten, und die hydrolytische Eeaktion läuft mit einer Enzymmenge ab, die so klein wie möglich ist. Erfolgreich verwendete Mengen liegen im Bereich von 35-120 mg Enzym pro Gramm Substrat. Das Enzym kann auch an irgendeinem geeigneten festen Träger, der den Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt ist, gebunden sein.

Bequemerweise ist es bevorzugt, in einer wässrigen Lösung zu arbeiten. Die Konzentrationen sind nicht kritisch, bevorzugt sollte aber ein Gleichgewicht gefunden werden. Je verdünnter die Lösung ist, umso aktiver ist das Enzym. Andererseits ist die Gewinnung umso leichter, je konzentrierter die Lösung ist.

Hinsichtlich der Temperaturen ist das Enzym am aktivsten bei einer Temperatur von etwa 37°Ο· Jedoch wird bevorzugt normale Raumtemperatur (z.B. etwa 25⁰C) angewandt. Die Anwendung höherer Tempeisfcuren begünstigt zwar die Aktivität des Enzyms, steigert auch die Gefahr spontaner (d.h. nicht enzymatischer) Hydrolyse, und diese Art nicht-spezifischer Hydrolyse ist unerwünscht. Zudem bringt eine Eeaktion bei etwa 37°C eine Betriebsweise mit sich, die Temperatur-

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Kontrolle beteiligt, welche eine unnötige manipulative Komplizierung darstellt.

Pur die Praxis dieser Erfindung ist es auch wichtig, die enzymatische Hydrolyse bei einem sauren pH durchzuführen. Der pH sollte im allgemeinen zwischen etwa 5 und etwa 7 liegen, wobei der bevorzugte Wert bei etwa 5 bis etwa 6 liegt. Nähert sich der pH 7» steigt die Gefahr nichtenzymatischer, nicht-spezifischer Verseifung.

Der pH kann im gewünschten Bereich mit Hilfe einer anorganischen Base, nämlich einem wasserlöslichen Alkalimetalloder Erdalkalimetallhydroxid oder JLmmoniumhydroxid gehalten werden. Beispiele schließen Lithium-, Natrium-, Kalium-, Barium- und Ammoniumhydroxid ein.

Das Diagramm der Figur zeigt den hydrolysierten Ester als Ordinate gegen die Zeit als Abszisse. Eine besondere Beschreibung folgt später.

be
Die folgenden, nicht-^renzenden Beispiele veranschaulichen

die Erfindung:

Beispiele 1-6

Chlorwasserstoff wurde durch eine Suspension von 0,5 g der DL-Aminosäure in 30 ml absolutem ithylalkohol 20 min lang durchgeleitet. Die verwendeten DL-Aminosäuren waren die folgenden:

Beispiel 1: 2-Hydroxy-DL-phenylalanin

Beispiel 2χ 3-Hydroxy-DL-phenylalanin

Beispiel J: 4-Hydroxy-DL-phenylalanin

Beispiel 4» 3,4-Dihydroxy-DL-phenylalanin

Beispiel 5» 4-0hlor-DL-phenylalaniη

Beispiel 6: 4-Pluor-DL-phenylalanin

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Am nächsten Tag wurde das Lösungsmittel abgedampft und der ganze Vorgang wiederholt. Überschüssige HCl wurde dann durch Wiederholen des Verdampfens dreimal nach Zusatz von Äthanol entfernt. Der Rückstand wurde in 15 ml Wasser gelöst, der pH der Lösung wurde auf 5>Q mit 0,2 m LiOH eingestellt, Ci-Ghymotrypsin dann zugegeben und das Gemisch bei Raumtemperatur eine halbe bis 1 1/2 Stunden inkubiert, während der pH durch automatischen Zusatz von 0,2 m LiOH aus einem Titrator konstant gehalten wurde (der Titrator war ein Radiometer-pH-Stat vom Typ ABUIa/TTTlla/PHM 28b). Nach der Fermentation wurde das Gemisch konzentriert, bis Kristalle auftraten, eine Stunde gekühlt, filtriert und die Fällung mit Äthanol gewaschen. Das so erhaltene L-Isomere wurde durch Lösen in Wasser, das 2 ml 1 η HGl enthielt, Filtrieren der Lösung durch ein Diatomeenerdefilter Hilfsmittel (bekannt unter dem Handelsnamen Gelite) und Zusätzen von 2 ml 1 η LiOH umkristallisiert.

Das nach Entfernen des L-Isomeren erhaltene Eiltrat wurde auf pH 9»0 mit 0,2 m LiOH gebracht und mit Ithylacetat (3 χ 50 ml) extrahiert, das dann über MgSO^, getrocknet und in Chlorwasserstoff enthaltendes Äthylacetat filtriert wurde. Das Lösungsmittel wurde durch Verdampfen entfernt, der Rückstand wurde in 20 ml 0,2 m LiOH, d.h. pH 12,0, gelöst und die Lösung eine Stunde bei 45⁰C gehalten. Dann wurde der pH auf 5?0 mit 1 η HGl eingestellt, die Lösung zur Trockne verdampft, der Rückstand in heißem Äthanol zerrieben, das Gemisch dann mehrere Stunden gekühlt und filtriert, um das D-Isomere zu ergeben.

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Abwandlung A

Spaltung von 3-Hydroxy-DL-phenylalanin (DL-m-Tyrosin)

Das vorstehend beschriebene Grundverfahren wurde modifiziert, indem die Veresterung nur einmal durchgeführt wurde. Nach der enzymatischen Behandlung wurde das Gemisch zur Trockne verdampft und der Rückstand mit Äthanol verrieben, um das L-Isomere zu erhalten. Das FiItrat wurde dann zur Trockne eingeengt, der Rückstand in Wasser gelöst und die D-Aminosäure wie oben beschrieben erhalten.

Abwandlung B

Spaltung von 2-Hydroxy-DL-phenylalanin (DL-o-Tyrosin)

Das oben beschriebene Grundverfahren wurde durchgeführt. Nach der enzymatischen Behandlung wurde das Gemisch wie für die Abwandlung A behandelt. Außerdem wurde nach Verseifung des D-Aminosäureesters das aufgrund der unvollständigen enzymatischen Reaktion vorhandene L-Isomere durch Fermentation mit L-Aminosäureoxidase zerstört. Zu diesem Zwecke wurden 5 ml 1 η HCl und 3 ml 10 %iges NaHpPO^, zugesetzt, um den pH auf 8,0 zu bringen, und das Gemisch wurde bei 37° C 24 h inkubiert, wobei Sauerstoff durchgeperlt wurde, in Gegenwart von 100 mg Orotalus Adamanteus-L-Aminosäureoxidase. Ein Kationenaustauscherharz in der H⁺-Porm (bekannt unter dem Handelsnamen Dowex ^O) wurde zugesetzt (etwa 120 ml), die Suspension wurde 20 min gerührt, filtriert, das Harz mit Wasser gewaschen und die Amin^äure dann aus dem Harz mit 500 ml 3 η NH^OH eluiert. Das Eluat wurde mehrmals nach Zusatz von Wasser zur Trockne eingeengt und der Rückstand mit Hilfe von Äthanol gesammelt.

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Abwandlung 0

Spaltung von 3,4~Dihydroxy-DL-phenylalanin (DL-DOPA)

Das oben beschriebene Grundverfahren wurde wiederholt mit den folgenden Abwandlungen: der Veresterungsschritt wurde einmal durchgeführt; in allen Fällen wurde anstelle von
Lithiumhydroxid Natriumhydroxid verwendet} beide Isomeren wurden getrennt aus einer wässrigen Lösung bei pH 5»5
kristallisiert j und der D-Ester wurde hydrolysiert, in_dem eine Stunde in 1 η HCl Rückfluß gekocht wurde, statt ihn
zu verseifen.

Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle I zusammengefaßt.

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	Aminosäure derivat	* ΦΑ-R-RT.T.-R T	4,0	ringsubstituierten DL-Phenylalaninen	75	fr?	D-Isomer	100	HCl)	50	+25,4	Optische Eeinheit	,5 ,8
		Daten für die Spaltung von		L-Isomer	80	-26,8		100		78 78	+ 7,9 +10,0		,5
	a") Inkubationsbedingungen ^/	0,5		70	- 7,9 -10,2			60	+1.1,6°	> 99 99
		0,5	Enzym Zeit Ausbeute (mg) (min) (%)		-11,7	Optische Ausbeute 25b Eeinheit _f0/\ L⁰Qt, (%) ^{W Ώ}			+ 9,5^d	99	,5
	Substrat (S)	pH - 5,0;	200 60	64	- 9,5	100	60	+ 3,3		,5
	2-0H(o-!Dyrosin) 2,0	c - 2; η	45 30 20 30	60	- 3,5	100 100	60	+ 5,6	99
ro CD CO 00	3-0H- (m-Iyro sin) 0,5 4-0H( !Tyro sin) 0,5	20⁰C; in	140 30		- 5,6	^c >99,8			> 99
	3,4-di0H(D0PA)	30⁰C				d
			50 90	(c - 3
I —k CD	4-Cl(p-chlor)		60 30		, 4 %
	4-P(p-fluor)		j bei Baumtemperatur
	at		HCl
	b:		der Literatur 11,5°
	c:
	d:

Vie aus der einzigen graphischen Darstellung hervorgeht, wurde in einem Testversuch der Zeitablauf der Chymotrypsinkatalysierten Hydrolyse von L- und DL-Tyro sin-lthyl estern verfolgt. Die Ct-Ohymotrypsin-katalysierte Hydrolyse von Tyrosinäthylester wurde bei pH 6,3 in 0,25 21 NaOl bei 25⁰O durchgeführt. /~e/ « 10"^ Kj fS ] - 4 χ 1Q~^ M, bezogen auf das L-Isomere. Die Reaktionen wurden durch Zusatz eines gleichen Volumens 20 %iger SuIfοsalicylsäure beendet, und das Tyrosin wurde mit dem Analysator bestimmt. Es ist zu erkennen, daß das Fortschreiten der Reaktion in den beiden Fällen praktisch gleich war, was nahelegt, daß nur das L-Isomere hydrolysiert wurde, und daß diese Hydrolyse durch die Gegenwart des D-Isomeren nicht beeinträchtigt wurde. Die Reaktionen scheinen vor ihrem Abschluß beendet zu sein, nämlich nachdem etwa 88 % des einen Isomeren hydrolysiert waren. D-Syrosin-Äthylester wurde unter den gleichen Bedingungen nicht hydrolysiert, weder in Gegenwart noch in Abwesenheit von Enzym.

Durch die Durchführung des Grundverfahrens wurden die DL-Aminosäuren nach dem klassischen HGl/Äthanol-Verfahren in ihre Äthylester überführt. Um die Vollständigkeit der Reaktion sicherzustellen, wurde die Veresterung wiederholt, außer bei m-Tyrosin und DOPA, wofür es als unnötig gefundsn wurde. Die Ester, die nachweislich nicht mehr als 0,1 % freie Aminosäure enthielten, ausgenommen der o-Tyrosinester, der 0,4 % o-Tyrosin enthielt, wurden weder kristallisiert noch isoliert, sondern nur von Lösungsmittel und überschüssigem Chlorwasserstoff befreit und dann in Wasser gelöst. Sie wurden dann der Einwirkung des Ghymotrypsins bei pH 5 - 6 unterworfen, wobei der pH durch automatischen Alkalizusatz unter Verwendung des oben beschriebenen automatischen Titrationssystems gehalten wurde. Nach Aufhören der Alkaliaufnahme, in den meisten Fällen nach 30 min, aber länger für o-Tyrosin und p-Ohlorphenylalanin, wurden die L-Isomeren durch Kristallisation aus den konzentrierten

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wässrigen Fermentationslösungen erhalten, ausgenommen o- und m-Tyrosin, die in Salzlösungen zu löslich sind. Die letzteren wurden durch Ausfällen mit Äthanol nach Entfernung des Wassers durch Verdampfen erhalten. Die D-Aminosäureester wurden durch Extrahieren aus einer basischen Lösung in Äthylacetat isoliert und nachfolgend bei 4-5⁰C verseift, ausgenommen der Ester des D-DOPA, der in heißer Säure hydrolysiert wurde, um Ringöffnung zu vermeiden. Die Ausbeuten waren im allgemeinen im Bereich von 60 - 80 % für die L-Isomeren, und etwa 60 % für die D-Isomeren. Die D-Ester wurden nicht hydrolysiert unter den speziellen Bedingungen der enzymatisehen Hydrolyse, weder in Gegenwart noch in Abwesenheit von Enzym.

Die chemische Reinheit der Produkte wurde chromatographisch an einem Aminosäureanalysator nachgewiesen. Alle Isomeren ergaben im wesentlichen die gleichen Ninhydrin-Farbkonstanten wie die Ausgangsmaterialien. Bei Verwendung der nachfolgend beschriebenen chromatographischen Methode, die die relativen Mengen der beiden Isomeren in «jeder Probe maß, erwiesen sich alle Isomeren, ausgenommen D-o-Tyrosin, als zumindest 99,5 %ig optisch rein. Alle chromatographischen Daten sind unten in Tabelle II wiedergegeben.

Die optische Reinheit der Isomeren wurde durch Chromatographie ihrer L-Alanin-dipeptide bestimmt, die durch Reaktion mit L-Alanin-N-carboxyanhydrid nach einer Abwandlung der Methode von Manning und Moore (J. Biol. Chem., 24-3, 5591 (1968) hergestellt wurden, wonach die Dipeptide durch Reaktion der Aminosäure mit einem optisch reinen Aminosäure-N-carboxyanhydrid hergestellt und nachfolgend mit einem Ami no säureanalysator bestimmt werden.

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Die L-Alanyl-dipeptide für die Bestimmung optischer Reinheit wurden nach einer Abwandlung des von Manning und Moore beschriebenen Verfahrens hergestellt. Die Probe (100 iiimol) wurde in 100 χ 10 mm Testrohre aus hitzebeständigem Glas (bekannt unter dem Handelsnamen Pyrex) eingewogen, und 1 ml eiskalter 0,45 m Kaliumboratpuffer, pH 10,4 (hergestellt durch Zusatz von 5 B. EOH zu 0,45 m Borsäure bei 0°) (anstelle von Natriumboratpuffer zu einem pH von 10,2) und ein Tropfen Oaprylsäure wurden zugesetzt. Das Rohr wurde in einen (4°) kalten Raum genommen, L-Alanin-N-carboxyanhydrid (12,7 mg; 100yumol) (anstelle von Leucin-N-carboxyanhydrid) wurde rasch zugesetzt, und das Rohr wurde kräftig 2 min auf einem Rührer geschüttelt (bekannt unter dem Handelsnamen Vortex Genie). Die Lösung wurde mit 1 η HCl auf pH 2 gebracht, auf 10 ml mit Wasser verdünnt, filtriert (Gelite), und geeignete Mengen wurden auf dem Analysator analysiert. (Der Analysator für die Aminosäuren war ein Beckman Modell 120B Aminosäureanalysator).

Bei einer weiteren Ausführungsform wurde das Reaktionsgemisch bei pH 10,8 30 min bei 25° 0 nach dem Kuppeln gelassen, um irgendwelche Phenolester zu hydrolysieren.

ΦΑΤΤΕΤ.ΤΪΕ II

Chromatographische Daten des Beckman-Aminosäureanalysators

	0,9 x 15 cm	Aminex A-5	68 ml/h	0,9 χ 50 cm	AA-15 Harz,	68 ml/h	141 154 141,154
	Harz, 57°, <	iluiert mit	; Konstante a	57°, eluierl	; mit 0,20	Elutionszeit Elutions- (min) zeit des L-AIa.X dipeptide (min)	193 213 193,213
	0,20 n-Natriumcitrat	19,9 21,0 19,8	n-Natriumci trat	71 71 71	130 155 130,155
	pH 4,25}	23,0 23,2 22,0	PH 4,25;	85 85 85	6,48; 34 ml,
Isomer	Elutionszeii (min)	18,8 18,9 18,8	65 65 65	85 68 85,68
D-m-Tyrosin L-m-Tyrosin DL-m-Tyrosin	23 23 23		0,35 n, pH	177 126 177,126
D-Tyrosin L-Tyrosin DL-Tyrosin	25 25 25	20,0 18,5 18,8	92 92 92	99 76 99,76
D-DOPA L-DOPA DL-DOPA	22 22 22	20,7 21,0 21,0	219 219 219
		22,1 22,3 22,8	115 115 115
D-o-Tyrosin L-o-Tyrosin DL-o-Tyrosin	28 28 28
D-p-Ol-Phe L-p-Gl-Phe DL-p-Gl-Phe	54 54 54
D-p-F-Phe L-p-J7-Phe DL-p-J7-Phe	30 30 30

a: Peak-Höhe mal Breite dividiert durch Konzentration.

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(Aminex A-5-Harz ist der Handelsname der Bio Rad Laboratories, Richmond, Californien, für ihre Marke eines Kationenaustauscherharzes vom SuIfonsäuretyp. AA-15-Harz ist der Handelsname von Beckman für ein Kationenaustauscherharz vom SuIfonsäuretyp).

Beispiel 7

DL-DOPA [ (3,4-Dihydroxyphenylalanin) (3,95 Si 0,02 mol) ] wurde in 240 ml absolutem Äthanol suspendiert, und Chlorwasserstoff wurde 20 min durch das Gemisch geleitet« Am nächsten Tage wurde die klare Lösung bis zur Trockne eingeengt, und das Einengen wurde dreimal nach Zusatz von jeweils 50 ml Äthanol wiederholt. Der Rückstand wurde in 100 ml Wasser gelöst und der pH auf 5,5 mit Natriumhydroxid eingestellt. *%-Chymotrypsin (140 mg) \rarde zugesetzt, und das Gemisch wurde bei 37° C 30 min gehalten, während der pH durch automatischen Zusatz von 1 η NaOH aus a©a zuvor beschriebenen automatischen Titrator konstant gehalten wurde. Die Mischung wurde auf etwa 50 ml konzentriert w&a das L-DOPA, das auskristallisierte, wurde nach eiastiladigem Kühlen der Mischung filtriert. Ausbeuteι 1,54 g (78 %)« Das Produkt wurde durch Lösen in einem leichten Überschuß an 1 η HCl, Filtrieren und Neutralisieren auf pH 5,5 mit Natriumhydroxid umkristallisiert. Ausbeutet 1,38 g (70 %).

Die ursprüngliche Mutterlauge wurde auf pH 9,0 mit Natriumhydroxid gebracht, mit Natriumchlorid gesättigt und dreisal mit 100 ml Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde getrocknet (MgSO^) und in 50 ml Äthylacetat, das Chlorwasserstoff enthielt, filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde 1 h in 120 ml 1 η Salzsäure rückflußgekocht. Die Mischung wurde dreimal nach Zusatz von jeweils 30 ml Wasser zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in 20 ml Wasser gelöst, mit Natriumhydroxid auf pH 5,5 eingestellt, und das kristallisierte D-DOPA wurde mit Hilfe von Äthanol filtriert. Ausbeutes 1,18 g (60 %).

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Die Identität und Reinheit der Produkte wurde wie oben beschrieben bestimmt. Das L-DOPA enthielt weniger als 0,2 % des D-Isomeren. Das D-DOPA enthielt 0,5 % des L-Isomeren. Die chÄiatogaphischen Daten sind die gleichen wie in Tabelle I.

Die optische Drehung der Produkte wurde mit einem Perkin-Elmer-Modell 141 Polarimeter unter Verwendung eines 10 cm-Rohres bestimmt. Die Ergebnisse waren die gleichen wie in Tabelle I.

- Patentansprüche -

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Claims

Patentansprüche

Verfahren zur enzymati sehen Spaltung von racemischen mono- und di-ringsubstituierten Phenylalaninen, die beispielsweise methoxy-, hydroxy-, chlor- oder fluor-substituiert sind, gekennzeichnet durch die Kombination folgender

Stufen:

Verestern des Racemats mit Methyl-_? Äthyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, η-Butyl-, sec.-Butyl- oder Isobutylalkoholj

Unterwerfen dieses racemischen Esters der Einwirkung eines Chymotrypsins bei einem sauren pH; und

Gewinnen der L-Isomerensäure in optischer Reinheit von wenigstens 99)8 % als vom D-Isomerenester praktisch freie Fällung aus dem Reaktionsgemisch.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Chymotrypsin Ct-Chymotrypsin verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Phenylalanin 3-Methoxphenylalanin, 2-Hydroxyphenylalanin, 3-Hydroxyphenylalani.n, 4-Hydroxyphenylalanin, 3,4-Dihydroxyphenylalanin, 4-Chlorphenylalanin oder 4-i'luorphenylalanin verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß bei einem pH von 5 bis 7 gearbeitet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß bei einem pH von 5 bis 6 gearbeitet wird.

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6. Verfahren nach Anspruch 5> dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Hydrolyse bei einer Umgebungstemperatur von etwa 25°C für eine Zeit von etwa einer halben' bis 1 1/2 Stunden durchgeführt wird.
7· Verfahren nach einem der Ansprüche 2,4,5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Phenylalanin racemisches DL-3_}4-Dihydroxyphenylalanin zur Gewinnung von L-3,4-Dihydroxyphenylalanin verwendet wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2,4,5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Phenylalanin racemisches DL-3THydroxyphenylalanin zur Gewinnung von L-m-Tyrosin verwendet wird.
9. Verfahren zur enzymatisehen Spaltung von racemischem 3»4-Dihydroxyphenylalanin, gekennzeichnet durch die Kombination folgender Stufen:

Bilden des Äthylesters durch Umsetzung des Racemats mit Chlorwasserstoffgas in Äthanol;

Unterwerfen einer wässrigen Lösung des Esters der Einwirkung von Qt-Chymotrypsin (E.C. 3,4,4,5) bei einem pH von etwa 5 bis etwa 6 bei einer Raumtemperatur von etwa 25⁰C, wobei der pH praktisch konstant gehalten wird, vorzugsweise mit HaOH, bis eine wesentliche Menge des L-Esters hydrolysiert ist;

Konzentrieren der wässrigen Lösung; und Gewinnen des so gebildeten L-DOPA-Niederschlage.

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10. Verfahren zur enzymatisehen Spaltung von racemisch em J-jphenylalanin, gekennzeichnet durch die Kombina tion folgender Stufen:

Bilden des Äthylesters durch Umsetzung des Racemats mit Chlorwasserstoffgas in Äthanol;

Unterwerfen einer wässrigen Lösung des Esters der Einwirkung von X-Chymotrypsin (E.C. 3,4,4,5) bei einem pH von etwa 5 bei einer Raumtemperatur von etwa 25°C für etwa eine halbe bis 1 1/2 Stunden;

im wesentlichen Konstanthalten des pH, bevorzugt mit LiOH, bis eine wesentliche Menge des L-Esters hydrolysiert ist;

Einengen zur Trockne; Verreiben des Rückstands; und Gewinnen des so angefallenen L-m-Tyrosine.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, gekennzeichnet durch die zusätzlichen Stufen der Extraktion des Filtrats nach Gewinnung des L-Isomeren zur Gewinnung des D-Isomerenesters, Verseifen des D-Isomerenesters und Gewinnen der D-Isomerensäure in optischer Reinheit von wenigstens 99,5 %·

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