DE2500802C2

DE2500802C2 - Gemische aus Salzen der α-N-Acetyl-L-asparagyl-L-glutaminsäure und der β-N-Acetyl-L-asparagyl-L-glutaminsäure, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Gemische enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE2500802C2
Application number: DE2500802A
Authority: DE
Inventors: Georges Cournon d' Auvergne Chibret; Nguyen-Cong Paris Duc
Original assignee: LES PRODUITS ORGANIQUES DU SANTERRE ORSAN 75009 PARIS FR; Thea (therapeutique Et Applications) Sa Joze Puy-De-Dome Fr
Current assignee: LES PRODUITS ORGANIQUES DU SANTERRE ORSAN 75009 PARIS FR; Thea (therapeutique Et Applications) Sa Joze Puy-De-Dome Fr
Priority date: 1974-01-11
Filing date: 1975-01-10
Publication date: 1984-08-16
Also published as: ES433711A1; JPS5827263B2; BE824301A; FR2257270A1; DE2500802A1; FR2257270B1; JPS50116419A

Description

2. Verfahren zur Herstellung der Gemische der Lithium-, Magnesium- oder Calciumsatze nach Anspruch Ij dadurch gekennzeichnet, daß man N-Acetyl-L-asparaginsäureanhydrid in Wasser mit einem Lithium-, Magnesium- oder Calciumsalz der L-Glutaminsäure bei einem pH-Wert zwischen 5 und 9 und bei einer Temperatur zwischen —5 und +25⁰C umsetzt, wobei man den pH-Wert durch Zugabe einer Lithium-, Magnesium- oder Calcium-Ionen liefernden Base in dem angegebenen Bereich hält.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man N-Acetyl-L-asparaginsäureanhydrid und das jeweilige L-Glutaminsäuresalz in Konzentrationen zwischen 05 und IJ5 MoI pro Liter ersetzt

4. Verfahren nach Anspmeh 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung bei einem pH-Wert zwischen 6 und 8 und bei einer Temperatur von etwa 0⁰C durchführt.

5. Verfahren zur Herstellung der Gemische des N.N-Dimcthylaminoälhanoisalzes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise ein Gemisch des betreffenden Alkali- oder Erdalkalimetallsalzes an einem Kationenaustauscherharz vom Arylsulfonsäuretyp in ein Gemisch aus alpha- und beta-N-Acetyl-L-asparagyl-L-glutaminsäure überführt und dieses mit Ν,Ν-Dimethylaminoäthanol in dem angegebenen Molverhältnis umsetzt.

6. Arzneimittel mit Wirkung auf das zentrale Nervensystem, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einem Stoffgemisch nach Anspruch 1 als Wirkstoff, gegebenenfalls in Kombination mit einem inerten, pharmazeutisch verträglichen Trägermaterial oder Bindemittel.

Die Erfindung betrifft Gemische aus Salzen der alpha-N-Acetyl-L-asparagyl-L-glutaminsäure und der beta-N-Acetyl-L-asparagyl-glutaminsäure, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Gemische enthaltende Arzneimittel, entsprechend den vorstehenden Patentansprüchen. Diesen Salzen liegen die Anionen I (beim Λ-lsomer) und II (beim ^-Isomer) zugrunde:

α-Isomer

H₃C-C-NH-CH-CONH-CH-CH₂-Ch₂-COO⁹ O CH₂COO⁶ COO®

jS-Isomer

H₃C-C— NH-CH- CH₂-CONH-Ch-CH₂-CH₂-COO⁹ O COO^e COO^e

OD

deren negative Ladungen gemäß den in Anspruch 1 angegebenen Molverhältnissen durch die Kaiionen von L.Uhium. Magnesium, Calcium oder protoniertcm N.N-Dimcthylaniinoäthanol kompensiert sind.

Diese Salzgcmischc sind in biologischer Hinsicht nützlich. Sie ermöglichen die Einführung eines Asparagylglutaminsäurepeptids, dessen Struktur derjenigen von gewissen natürlichen Substanzen entspricht, die im tierischen und menschlichen Organismus nachgewiesen wurden.

Im Journal of Neurochemistry 18, 1971. 2129—36 sowie in Chcm. Abstracts 67, 1967, 106512 wird über Versuche berichtet, die Anwesenheit der N-Acetyl-asparagyl-gluiaminsäure im Gehirn nachzuweisen. In Chem. Abstracts 68, 1968, 69325 sowie im J. Amer. chcm. Soc. 85. 1963, 1839-44 ist die Herstellung dieser Säure und einiger Ester beschrieben, unabhängig von der Verwendbarkeil dieser Verbindungen, über die darin keine Angaben zu finden sind.

Glutaminsäuren der eingangs genannten Art, deren Ester und die Verseifung dieser Ester sind beschrieben in der FR-PS 14 77 573, jedoch sind die Eigenschaften der hergestellten. Produkte, insbesondere ihre pharmakologische Aktivität undToxizität, nicht behandelt. In Chem. Abstracts 64,1966,56308 wird die Auffassung vertreten, daß die pharmakologische Aktivität der N-Aeeiyl-asparagyl-gluiaminsiiurc allein auf ihre Acidität zurückzuführen sei und die neutralisierten Peptide keinerlei Aktivität aufweisen würden.

Es hat sich jedoch gezeigt, daß die Salzgcmischc selektiv in dem Bereich des zentralen Nervensystems wirken und ihre therapeutische Wirkung betrifft das AllgcmcinvcrhnUcn, so daß sie insbesondere nützlich sind zur Behandlung von Zerebralcrmüdungcn, Schock/iisiändcn, Schwüehczusiiindcn, Dcprcssions/.tiständen. Gedacht-

25 OO 802

nisschwäche, Schwierigkeiten bei der Beruhigung nach wiederholten Anstrengungen und gegebenenfalls motorischen Schwächezuständen, die ihre Ursache in Zerebralgefäßsiörungen haben.

Neben ihrer Wirkung auf das zentrale Nervensystem zeigen sie weitere Eigenschaften, darunter eine kardiovaskuläre Aküvitäu

Aufgrund dieser Eigenschaften unterscheiden sich die erfindungsgemäßen Verbindungen von der N-Aceiyl-L-asparagyl-glutaminsäure, die bereits in der Literatur beschrieben wurde und deren Ester, wie dem Diäthylester der beta-N-Acetyl-L-asparagyl-L-glutaminsäure.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der eingangs erwähnten Salzgemische.

Die bislang zur Herstellung der bekannten Verbindungen angewandten Verfahrensweisen sind insbesondere auf den Laboratoriumsmaßstab anwendbar. Sie erfordern die Anwendung von Lösungsmitteln. Demgegenüber wird ein Verfahren bereitgestellt das mit Vorteil in industriellem Maßstab angewandt werden kann, da es im wesentlichen in zwei aufeinanderfolgenden Stufen abläuft, die in Gegenwart des Lösungsmittels Wasser durchgeführt werden. Weiterhin erhält man das Produkt direkt in der vorteilhaftesten Form, nämlich der Salzform, wodurch es vermieden wird, als Zwischenprodukt die Säure o»ier den Ester zu bereiten.

Das Verfahren besteht darin, daß man ein Salz der Glutaminsäure im Lösungsmittel Wasser mit dem Anyhdrid der N-Acetyl-L-asparaginsäure umsetzt, wodurch man eine wäßrige Lösung der Salze entsprechend der Formel 1 und II erhält.

Die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugten Bedingungen ergeben sich aus der Beschreibung, die den Einfluß verschiedener Paramter, wie der Temperatur, des pH-Werts, der relativen Konzentrationen der Reaktionsteilnehmer, die Reihenfolge und die Geschwindigkeit ihrer Zugabe auf diese Reaktion angibt.

Erfindungsgemäß erfolgt die Herstellung der Salz-Gemische I und II mit Vorteil in zwei Stufen wie folgt:

I.Stufe

N-Acetyl-L-asparaginsäureanhydridilll)

In einer ersten Stufe setzt man Essigsäurcanhydrid (A) in wäßrigem Medium mit einem Salz der Asparaginsäure, insbesondere dem Calciumsalz der Asparaginsäure, um und behandelt dann in einer zweiten Stufe die aus dem Reaktionsmedium isolierte N-Acetyl-asparaginsäure mit einer neuen Meng« des Anhydrids (A), wodurch man zu N-Acetyksparaginsäureanhydrid (III) gelangt.

2. Stufe

Herstellung von (alpha- und betaJ-N-Acetyl-asparagyl-glutaminsäureverbindungen entsprechend

den Formeln 1 und Il

Es erfolgt eine Peptidkondcnsation in wäßrigem Medium zwischen dem N-Acetyl-L-asparaginsäureanhydrid und einem L-Glutaminsäuresalz gemäß Anspruch 2.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens verfährt man wie folgt:

Man bereitet die wäßrige Lösung des Glutaminsäurcsalzes entweder dadurch, daß man dieses Salz direkt in Wasser löst oder daß man sie in situ dadurch bildet, dayman eine das genannte Kation liefernde Base in eine wäßrige Glutaminsäuresuspension einbringt und den pH-Wert der Lösung auf einen Wert zwischen 5 und 9, vorzugsweise zwischen 6 und 8 bringt.

Die Einführung des N-Acctyl-L-asparaginsäurcanhydrids in das Reaktionsmedium führt zu einer praktisch augenblicklichen Verminderung des pH-Werics, den man durch die gleichzeitige Zugabe der die Glutaminsäure in das Salz überführenden Base in dem angegebenen Verfahrensschritt hält.

Vorzugsweise wendet man bei dieser Reaktion die in das SaI/. überführte Glutaminsäure und das Anhydrid der N-Acetyl-L-asparaginsäure in stöchiomctrischen Mengenverhältnissen und Konzentrationen zwischen 0,5 und 15MoI pro Liter, vorzugsweise zwischen 0,7 und 1,1 Mol pro Liter an, wobei die maximale Abweichung gegenüber den stöchiometrischen Mengenverhältnissen 10% beträgt.

Die Auswahl der oben erwähnten Kon/.cntrationsintcrvalle ist durch die Tatsache bedingt, daß bei Konzentrationen oberhalb 1,5 Mol pro Liter die Steuerung der Temperatur und des pH-Werts schwierig wird und bei Konzentrationen unterhalb 0,5 Mol pro Liter eine verstärkte Hydrolyse des Anhydrids III auf Kosten der Peptidkondensation erfolgt. Diese Hydrolyse hängt ebenfalls von der Steigerung der Temperatur des Reaktionsmediums ab.

Gemäß Anspruch 2 hält man die Temperatur des Reaktionsmediums /wischen —5°C und +25⁰C, wobei man am vorteilhaftesten bei der für die verwendete Hase niedrigstmöglichcn Temperatur arbeitet. Da die Peptidkondensation eine exotherme Reaktion ist, hält man die Temperatur in dem angegebenen Bereich, indem man in entsprechender Weise von außen kühlt und/oder indem man nach und nach Eis in das Reaktionsmedium einträgt.

Beim Einhalten der oben angegebenen Bedingungen kann man die Hydrolysereaktionen des Anhydrids III praktisch vermeiden, so daß der Gehall an freier Glutaminsäure, die nicht mit der N-Acetyl-L-asparaginsäure kondensiert worden ist, auf einem sehr geringen Wert gehallen werden kann.

Wenn man das Verfahren unter Anwendung der oben angegebenen Reaktionsbedingungen durchführt, so erhält man die Verbindungen in Form von wäßrigen Lösungen ihrer Salze der r\- und der /-Form, deren Verhältnisse von den angewandten Bedingungen abhängt.

Nach dem Einengen der schließlich erhaltenen wäßrigen Lösung im Vakuum kann man das Gemisch dieser

25 OO 802

Salze entweder durch Gefriertrocknen oder durch Sprühtrocknen oder mit Hilfe eines anderen geeigneten Trocknungsverfahrens in fester Form gewinnen.

Das in dieser Weise erhaltene Gemisch kann verschiedenen Anwendungszwecken, insbesondere der Verwendung für therapeutische Zwecke zugeführt werden, ohne daß es notwendig ist, die genannten Isomeren voneinander zu trennen.

Zur Herstellung der Säuren als Ausgangsmaterialien können die Salze verwendet werden, die ! und II entsprechen.

Man behandelt die Lösung dieser Salze, bei der es sich entweder um die bei dem obigen Verfahren als Endprodukt erhaltene Lösung oder eine Lösung handeln kann, die man durch Auflösen des in fester Form gewonnenen Gemisches der «- undß-Verbindungen in entmineralisiertcm Wasser erhält, indem man sie über ein Kationenaustauscherharz vom Arylsulfonsäuretyp führt, das die Mclallkationen und die nicht umgesetzte Glutaminsäure zurückhält Anschließend führt die Abtrennung der gegebenenfalls in der wäßrigen Lösung in geringer Menge vorhandene N-Acetyl-L-asparaginsäure durch Gelfiltration über ein Dextrangel zu alpha- und beta-N-Acetyl-L-asparagyl-glutaminsäuren mit sehr zufriedenstellendem Reinheitsgrad.

Die Reinigung der Salze kann mit Vorteil dadurch bewirkt werden, daß man diese Salze in der obigen Weise in die entsprechenden Säuren überführt. Anschließend wandelt man die in dieser Weise erhaltenen Säuren in wäßriger Lösung unter der Kontrolle eines pH-Meßgerätes mil Hilfe der Base, die die Bildung des Ausgangssalzes ermöglicht, erneut in die Salze um.
Dieses Verfahren zur Reinigung durch Umwandeln dieser Salze in die entsprechenden Säuren kann mit Vorteil zur Herstellung neuer Salze angewandt werden. Mit Hilfe dieser Technik der dire··-lan Salzbildung der Säuren bereitet man die Salze mit Ν,Ν-Dimethylaminoäihanoi.

Die Salz-Gemische besitzen interessante pharmakologischc Eigenschaften, die sich bei Tierversuchen im Laboratorium zeigen. Diese Verbindungen zeigen ermutigende Ergebnisse im Zerebralbereich. Weiterhin hat es sich gezeigt, daß die Wirkung der oben erwähnten Produkte stärker ist, wenn die Tiere sich in einem pathologisehen Zustand befinden, was beispielsweise im Verlaufe einer durch einen Elektroschock verursachten Amnesie der Fall ist.

Die Salz-Gemische, die frei von allgemeinen toxischen Wirkungen sind, besitzen insbesondere ein starkes Interesse aufgrund ihrer thymoanaleptischen Eigenschaften, ihrer Anliamnesie-Eigenschaften sowie ihrer herzstimulierenden Eigenschaften.

Gegenstand der Erfindung sind daher auch Arzneimittel, die neben üblichen Bindemitteln oder Trägermaterialien eine oder mehrere der Salzgemische als Wirkstoffe enthalten. Die auf oralem oder parenteralem Wege zu verabreichenden pharmazeutischen Zubereitungen können in Form von einfachen Tabletten oder Dragees, die ggfs. zum Zwecke einer Wirkstofffreisetzung im Darm oder einer verzögerten Wirkstofffreisetzung umhüllt sein können, in Form von Kapseln,Gelkügelchen, Lösungen oder Ampullen mit trinkbarem oder injizierbarem Inhalt vorliegen und werden üblicherweise mit Hilfe der für die einzelnen Anwendungsformcn geeigneten Trägermaterialien und Bindemittel hergestellt.

Die Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Um die Ergebnisse der in den Beispielen angegebenen pharmakologischen Untersuchungen zu vereinheitlichen, sind die angewandten Dosierungen, in denen die Salzgemische verwendet werden, in einer Menge ausgewählt worden, die derjenigen der (alpha- und beiaJ-N-Acetyl-L-asparagyl-L-glutaminsäuren (NAAGA) äquivalent ist Sie sind als Menge des wasserfreien Produkts angegeben.

Beispiel 1

Lithiumsalze der alpha- und bcta-N-Acelyl-L-asparagyl-L-glutaminsäuren
(Verbindungen Nr. I)

a) Bildung des N-Acetyl-L-asparaginsäureanhydrids

Man beschickt einen lOOO-ml-Reaktionskolbcn, der mit einem Rührer und einem mit einem Calciumchloridröhrchen versehenen aufsteigenden Kühler ausgerüstet ist, mit 1 Mol (175 g) W-Acctyl-L-asparaginsäure und 240 ml (etwa 2,5 Mol) Essigsäureanhydrid.

Man rührt die Mischung während 30 Minuten bei 60⁰C, kühlt dann auf 20⁰C ab und rührt weitere 6 Stunden. Man filtriert die Kristalle des N-Acetyl-L-as)>araginsäurcanhydrids von dem Reakiionsmcdium ab, wäscht sie mit 1,2-Dichloräthan und trocknet sie im Vakuum. Das Produkt besitzt die folgenden physikalischen Kenndaten:

Schmelzpunkt (Kofier) 180^cC

(λ) γ° —48° (c = 2,5 in Essigsäureanhydrid)

b) Peptidkondensätion

Man beschickt ein 5000-ml-Reaktionsgcfäß, das mit einem Tropf trichter, einem Rührer, einem Feststoffeinfülltrichter Und einer mit einem pH-Meßgerät verbundenen Elektrode ausgerüstet ist, nach und nach mit 707.7 g b5 Glutaminsäure, 625 ml entmineralisicricm Wasser und 407 g Lithiumhydroxid (LiOH · H2O) (pH = 7,6). Man kühlt ai)f 0°C ab und gibt unter Rühren im Verlaufe von 30 Minuten portionsweise 196,5 g N-Acctyl-L-asparaginsaure^hhydrid und 250 g Eis zu. Man hält dun pH-Wert des Rcakiionsmcdiums durch progressive Zugabe von 850 Reiber wäßrigen, 15%igen Lilhiumhyclroxidlösung auf einem Wert von 7,25.

25 OO 802

Durch Getriertrocknen erhält man die l.ilhiumsalzc der alpha- und bcta-N-Acetyl-L-usparagyl-L-glutaminsäuren mit einer Ausbeute von 84% in Form eines weißen Pulvers, das 11 % Wasser enthält.

ber.: C 41,02 H 4.07 N 8,70 Li 6,46% gef.: C 41,07 H 4,28 N 8,75 Li 6,65%

Beispiel 2

Calciumsalze der alpha- und bcta-N-Acetyl-L-asparagyl-L-glutaminsäuren to

(Verbindungen Nr. 2)

Ausgehend von 14,7 g (0,1 Mol) Glutaminsäure in 100 ml Wasser und 9,5 g wasserfreiem Calciumoxid bereitet man Calciumglutamai. Dann gibt man im Verlaufe von 15 Minuten 15.7 g N-Acetyl-L-asparaginsäureanhydrid zu, wobei der pH-Wert des Reaktionsmcdiums wegen der geringen Löslichkeit des Calciumoxids bei 0⁰C, der Temperatur des Reaktionsmcdiums, praktisch konstant bei 8,2 bleibt.

Nach Beendigung der Zugabe rührt man während weiterer l!> Minuten bei 0°C. Durch Gefriertrocknen erhält man die obigen Calciumsalze mit einer Ausbeute von 80% in Form eines weißen Pulvers, das 11,1% Wasser enthält.

20 Analyse: Cj2H₂hN4Oi(,Cai

ber.: C 36.45 H 3,62 N 7,73 Ca 16,59%

gef.: C 36.66 H 3.50 N 7,80 Ca 16,42%

B e i s ρ i c 1 3

Magnesiumsalze der alpha- und beta-N-Acetyl-L-asparagyl-L-glutaminsäuren (Verbindungen Nr. 3)

Zur Bildung von Magnesiumglutamat setzt man 2500 ml Wasser unter Rühren 473 g Glutaminsäure mit 230 g Magnesiumoxid um. Unter Aufrechterhaltung einer Temperatur der Reaktionsmischung von 25°C gibt man anschließend 460 g N-Acctyl-L-asparaginsäurcanhydrid im Verlaufe von 30 Minuten portionsweise zu (wobei der pH-Wert des Reaktionsmediums nicht kleiner als 8 werden darf). Dann rührt man während weiterer 2 Stunden.

Man trocknet die aus dem Reaktionsmedium isolierten Magnesiumsalze der alpha- und beta-N-Acetyl-L-asparagyl-L-glutaminsäuren im Vakuumofen bei 6O⁰C. Man erzielt eine Ausbeute von 95%. Die Salze liegen in Form eines weißen, kristallinen Pulvers vor, das 26% Wasser enthält.

Analyse: g

ber.: C 39,11 Η3ί8 N 8.29 Mg 10,79% gef.: C 38,83 H 3,98 N 8.48 Mg 10,71%

Beispiel 4

N,N-Dimethy!aminoäthanolsalz der (alpha und betaJ-N-Acctyl-L-asparagyl-L-glutaminsäure

(Verbindungen Nr. 4)

Man führt eine Lösung der gemäß Beispiel 1 hergestellten Salze der alpha- und beta-N-Acetyl-L-asparagyl-L-glutaminsäuren in 3500 ml entmineralisicrtem Wasser über ein Kationenaustauscherharz (IRC® 120), wobei man einen Durchsatz von 2 Volumen Lösung pro Volumen Harz und pro Stunde anwendet.

Nach Überführung über das Kationenaustauscherharz wäscht man das Harz systematisch. Die Waschwässer, die mit der wäßrigen Lösung vereinigt werden, die durch das Harzbett geführt worden ist, werden über ein Dextrangel (Sephadex®G-10) filtriert, um die N-Acetyl-L-asparaginsäure-Spuren zu entfernen, die sich durch eine Hydrolyse des Anhydrids während der Peptidkondensation gebildet haben.

Die erhaltene Lösung kann gefriergetrocknet werden, so daß man die alpha- und beta-N-Acetyl-L-asparagyl-L-g!utaminsäuren in Form eines weißen Puivers erhält.

Die nach dem Reinigen mit Hilfe des Kationenaustauscherharzes und der Molekularfiltration erhaltene wäßrige Lösung der alpha- und beta-N-Acetyl-L-asparagyl-L-glutaminsäuren wird dann in einem Vakuum von 20 mm Hg bei einer Temperatur unter 50⁰C eingeengt, so daß man einen Sirup mit 50° Brix und einer Dichte d 'T^c von 1,269 g/cm³ erhälL

Man erhält diese Salze dadurch, daß man den erhaltenen Sirup mit einer Dichte d ²^ von 1,269 g/cm³ bei 0^cC in Gegenwart von Dimethylaminoäthanol in das Salz überführt.

Man setzt 24 g Dimethylaminoäthanol in Form einer Lösung in 60 ml entmineralisiertem Wasser zu 433 g dieses Sirups. Man erhält eine Salzlösung mit einem pH-Wert von 530, einem Stickstoffgehalt von 530% und einer Saizkonzentraiion von 48%.

Optischer Drehwcri:

(λ) i, —7,20° (angesäuerte Lösung mit einer Konzentration von 5%).

25 OO 802

Analyse: C2iH«Oi ι Ns

ber.: C 48.58 H 8.68 N 12,32%
gef.: C 48.10 H 8,40 N 12,29%

B e i s ρ i e I 5

Untersuchung der fördernden Wirkung auf das Wicdcrholungslcrnvcrmögen der Ratte

Wasserlabyrinth-Tcst

Dieser Test wurde von C. Giurgea und F. Mouiavieff-Lcsuisse(]. Pharmac. (Paris) 1972,3 (I). Seiten 17 bis 30) entwickelt. Die Wirkung der erfindungsgcmäßcn Verbindungen auf das l.crnvcrniögen von Rallen wird mit Hilfe des Wasserlabyrinth-Tests ermitteil, bei dem normale Ratten und Raticn verwendet werden, die mit Hilfe eines Elektroschocks eine Amnesie erlitten haben.

Als Vergleichssubstanz verwendet man 2-(2-Oxo-pyrolidin-l-yl)-aeelamid (Piracctam). Parallel dazu werden die Wirkungen der alpha- und beta-N-Acelyl-L-asparagyl-L-glutaminsiiurcn (NAAGA) untersucht.

Methode

Die Untersuchung erfolgt in einem Labyrinth, das mit Wasser mil einer Temperatur von 15"C gefüllt ist. Der Ausgang wird durch ein geneigtes Gitter gebildet, auf das die Ratten zum Verlassen des Wassers klettern müssen. Die Untersuchung erfolgt mil Hilfe von männlichen Sprague Dawlcy-Ralien mit einem mittleren Gewicht von 120 g.

Zunächst wird eine Vorauswahl durchgeführt. Es werden lediglich jene Ratten eingesetzt, die nicht in der Lage sind, im Verlaufe von 5 Minuten das Gitter des Ausgangs zu finden.

Die eigentliche Untersuchung erfolgt im Verlaufe von 3 Tagen. Während der ersten beiden Tage werden die zu untersuchenden Verbindungen 2mal täglich am Morgen und am Nachmittag auf intraperitonealem Wege verabreicht. Jedesmal werden die Tiere 30 Minuten nach der Verabreichung des zu untersuchenden Produktes mit Hilfe des Labyrinth-Tests untersucht.

jo Am dritten Tage unterwirft man die Tiere 30 Minuten nach der Verabreichung des zu untersuchenden Produktes einem Elektroschock, der von Krämpfen begleitet wird. Anschließend führt man den Labyrinth-Test zweimal durch, nämlich 15 Minuten und 60 Minuten nach dem Elektroschock.

Bei allen Untersuchungen bestimmt man die Zeit, die die Raticn benötigen, um den Ausgang des Labyrinths zu finden und berechnet den Prozentsatz der Verminderung dieser Zeit im Vergleich zu den Tieren, die nur mit einer physiologischen Salzlösung behandelt worden sind.

Dieser Prozentsatz der Verkürzung der Zeit des Durchlaufens des Labyrinths steht für die Förderung des Lernvermögens. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt.

Es läßt sich erkennen, daß die erfindungsgemäßen Produkte das Lernvermögen der Tiere im Vergleich zu den Vergleichstieren (siehe die Untersuchungen des ersten und des zweiten Tags) fördern und in äußerst bemerkcnswener Weise eine bessere Wiederherstellung nach dein Elektroschock am dritten Tage der Untersuchung begünstigen.

Die Anti-Amnesie-Eigenschaften bestimmter Verbindungen sind den entsprechenden Eigenschaften der Vergleichsverbindung Piracetam überlegen.

Die erfindungsgemäßen Produkte besitzen weiterhin den Vorteil, daß sie eine natürliche Pcptidstruktur besitzen.

Beispiel 6

Untersuchung der neurotoxischen Wirkungen

so Es ist versucht worden, die stimulierende oder beruhigende Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen auf das zentrale Nervensystem von Mäusen nachzuweisen, wozu die folgenden Tests angewandt wurden: Aktimeter-Test, nach der Technik von DEWS, bei dem die Wirkung auf die spontane Motilität bestimmt wird. Untersuchung der Verstärkung der Hexobarbitalnarkose und Lochbrett-Test nach Boissier, bei dem die Wirkung auf die Neugierde und den Erforschungsreflex untersucht wird.

Aus den in der Tabelle II angegebenen Ergebnissen ist festzustellen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen bei den genannten Untersuchungen keine oder nur geringe ncurotoxische Wirkungen entfalten.

Die sedative Wirkung der Verbindungen 1 und 4 ist geringer als die thymoanaieptische und antidepressive Wirkung,die man mit äquimolekularen Mengen von Lithium und Dimethylaminoäthanol erzielt.

Beispiel 7

Untersuchung der kardiovaskulären Wirkungen

Die erfindungsgemäßen Derivate werden in bezug auf ihre kardiovaskulären Wirkungen am mil Chloral betäubten Hund untersucht. Es werden die folgenden Paramtei¹ bestimmt:

Arterienblutdruck (Statham-Zelle),
Herzkontraktionskraft (Dehnungsmeßstreifen),

Ii

25 OO 802

ein Elektrokardiogramm in der Ableitung D II,

der Obcrschenkelartcricndurchsatz (physiometrischer Meßfühler) und

die Atmung(Pneumograph).

Die /u untersuchenden Verbindungen werden auf intravenösem Wege verabreicht.

Ergebnisse

Die Verbindung NAA(JA zeigt als einzige keine signifikante Wirkung auf die untersuchten Parameter, weder bei einer Dosis von 5 mg/kg noch bei einer Dosis von 10 mg/kg. Es kann keine Wechselwirkung mit den chemischen Mittlern beobachtet werden.

Demgegenüber zeigt die Verbindung Nr. 5 in einer Dosis von 13,6 m/kg, die 10 mg/kg NAAGA entspricht, eine erhebliche inoirope Wirkung, die durch die Effekte auf die I lcrzkontraktionskrafi beobachtet werden kann.

Tabelle I

Verbindungen

Dosis in mg/kg des durch Injektion

VCriibrCiCMtCn

wasserfreien Produktes

NAAGA
Nr. 1
Nr. 3
Piracetam

30 31,6 31,6 30

Pru/cntsat/ der Verminderung der Labyrinth- Durchlniifv/.cit, verglichen mil den Vergleichsticrcn

morgens abends

2. Tau
morgens

abends

3.Tag nachdem
Elektroschock

Minuten 1 Stunde

8 0 0 0

32 47 Elektroschock 64 88

0 0 Elektroschock 8 50

70 80 Elektroschock 54 63

61 80 Elektroschock 55 41

Nr. 1 = Lithiiimsalze Nr. 3 = Magnesiumsal/e

Tabelle!!

Verbindungen Motilität Dosis

Ergebnisse

Narkoseverslärkung

Dosis Ergebnisse

Lochbrctl-Test

Dosis Ergebnisse

NAAGA

Nr. 3

Nr. 4

< 100 mg/kg Ln. geringe Vcr- < 100 mg/kg i.p. keine Sund

50 bis 1000 minderung < 300 mg/kg p.o. keine 25 mg/kg

mg/kg p.o. keine i.p.

Veränderung

26 und 105 mg/kg geringe Vcr- 26 und 105 mg/kg geringe 5 und

i.p. minderung i.p. Verstärkung 26 mg/kg

i.p.

26 und 105 mg/kg keine 26 und 105 mg/kg geringe 6 und

i.p. Veränderung i.p. Verstärkung 28 mg/kg

170 bis keine i.p.

1050 mg/kg Veränderung

p.o.

46 und 185 mg/kg schwache 128 und schwacher 4,5 und

i.p. sedative 256 mg/kg Effekt 22 mg/kg

Wirkung i.p. i.p.

Verminderter Erforschungsreflex, äußeres Verhalten nicht modifiziert Verminderung des Erforschungsreflexes, vergleichbar mit derjenigen, die mit einer äquimolaren Dosis NAAGA erreicht wird
Verminderung des Erforschungsreflexes, vergleichbar mit derjenigen, die mit einer äquimolaren Dosis NAAGA erreicht wird

Verminderung des Erforschungsreflexes

i. p. = imraperitoneal verabreicht p.o. = per os verabreicht Nr. 1 = Lithiumsalze Nr. 3= Magnesiumsalze Nr. 4 = Dimethylaminoäthanolsalze

Weiterhin ergibt die Verbindung Nr. 3 bei schwacher Dosierung eine Verstärkung der Wirkung von Noradrenalin und eine erhebliche Oberschenkclgefäßerweiterung.

25 OO 802

Beispiel 8
Untersuchung der allgemeinen Toxizität

Die akuten Toxizitäten wurden an der Maus bei intraperiionealer und bei oraler Verabreichung untersucht. Die Mortaliät wird 8 Tage nach der Verabreichung der erfindungsgcinäßcn Verbindung bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IM zusammengestellt. Sämtliche Dosierungen sind auf das wasserfreie Produkt bezogen.

Tabelle 111	Intraperitonealc Verabreichung	< DL 50 < 1000	Orale Verabreichung
	700	< DL 50 < 2100	DLO >4800
Dosis letalis in mg/kg	1500	< DL 50 < 2100	3000 < DL 50 < 4000
Verbindungen	1500		DL 0 > 4200
NAAGA	DLO		Dl. 50 > 6275
Nr. 1
Nr. 3
Nr. 4

Nr. 1 <= Lithiumsalze

Nr. 3 - Magnesiumsalzc

Nr. 4 = Dimcthylaminoäthanolsalze

Es scheint, daß die Verbindungen Nr. 1 und Nr.3 bei intrupcritoncalcr Verabreichung eine vergleichbare Toxizität besitzen. Sie sind jedoch in äquimolckularer Dosis im Vergleich /.u NAAGA weniger toxisch.

Die Verbindung Nr. 1 besitzt eine Toxizität, die in einer dem Lithium äquimolarcn Dosis geringer ist als die von Lithiumcarbonat.

Da der Lithiumgehalt der wasserfreien Verbindung Nr. 1 etwa 6.5% beträgt, ergeben sich die auf die Lithiummenge bezogenen letalen Dosierungen wie folgt:

100 < DL 50 < 135 mg/kg bei intrapcritoncaler Verabreichung 200 < DL 50 < 260 mg/kg bei oraler Verabreichung

Im Vergleich dazu besitzt das in der Therapie zur Behandlung und zur Verhinderung von depressiven Manien verwendete Lithiumcarbonat (vgl. Schou »Encephale«, 60 (4), 1971. Seiten 281 bis 295) eine DL50 von etwa 260 mg/kg bei intraperitonealer Verabreichung an die Maus, was einer Lithiumdosis von 50 mg/kg entspricht.

Die Verbindung Nr. 4 ist in einer in bezug auf das Dimethylaminoäthanol äquimolaren Dosis wesentlich weniger toxisch als Dimethylaminoäthanol. Tatsächlich beträgt der Dimethytaninoäthanolgehdt der Verbindung Nr.4 47%. Die durch 2600 mg des Derivats Nr.4 zugeführic Dimethylaminoäthanolmenge beträgt 1220 mg. Somit liegt die DL_W von Dimethylaminoäthanol bei intrapcritoncaler Verabreichung zwischen 150 und 300 mg/kg.

Beispiel 9

Tabletten

Für die Humantherapie kann man Tabletten verwenden, die vorteilhafterweise die folgende Zusammensetzung besitzen:

Verbindung Nr. 3 0,100 g

Bindemittel ad 1 Tablette mit einem
Gewichi von 0.500 g

Dosierung: 2 bis 6 Tabletten täglich.

Beispiel 10
Gelkügelchen
Man kann Gelkügelchen folgender Zusammensetzung verwenden:

Verbindung Nr. 1 100 mg

Bindemittel ad 1 Gelkügelchen mit
einem Gewicht von 240 mg

f>5 Dosierung: 2 bis 6 Gelkügelchen täglich.

25 OO 802

Beispiel 11
Ampullen mil trinkbarem Inhalt

Verbindung Nr. 4 Ig 5

Bindemittel ad I Ampulle mit einem
trinkbaren Inhalt von 10 ml

Dosierung: 2 bis 3 Ampullen täglich.

Beispiel 12 u>

Ampullen mit injizierbarem Inhalt

Verbindung Nr. 3 50 mg

Bindemittel ad 1 Ampulle mit 15

5 ml injizierbarem Inhalt

Dosierung: I bis 2 Ampullen täglich, liin- bis dreimal täglich durch sehr langsame intravenöse Injektion oder einbis zweimal täglich durch intramuskuläre Injektion.

■»0 te

Claims

Patentansprüche:

1. Gemische aus Salzen der alpha-N-Acetyl-L-asparagyl-L-glutaminsäure und der beta-N-Acetyl-L-asparagyl-L-glutaminsäure mit

a) Lithium-Ionen oder

b) Ν,Ν-Dimethylaminoäthanol
jeweils im Molverhältnis 1 · 3 und

c) Magnesium-Ionen oder

d) Calcium-Ionen

jeweils im Molverhältnis 2 :3.