DE2442995A1

DE2442995A1 - Proteasefreie kallikreinloesungen, ein verfahren zu ihrer herstellung aus gereinigtem kallikrein und ihre verwendung als arzneimittel

Info

Publication number: DE2442995A1
Application number: DE2442995A
Authority: DE
Inventors: Alfred Dr Arens; Carl Dr Kutzbach; Guenter Dr Schmidt-Kastner
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1974-09-07
Filing date: 1974-09-07
Publication date: 1976-03-18
Also published as: US4045552A; JPS5154915A; DE2442995C2; FR2283696A1; GB1480867A; FR2283696B1; CA1053661A

Description

Proteasefreie Kallikreinlcsungen, ein Verfahren zu ihrer Herstellung aus gereinigter. Xailikrein und ihre Verwendung als Arzneimittel.

Die vorliegende Erfindung betrifft stabile, prcteasefreie und injizieroare Kallikrein-Lösungen bisher noch nicht erreichter Stabilität und Reinheit, ein Verfahren zu ihrer Herstellung aus gereinigtem Kallikrein sowie ihre Verwendung als Arzneimittel.

Bezüglich der therapeutischen Wirkung von Kallikrein ist folgendes zu sagen:

Bei Einwirkung auf körpereigenes Kininogen setzt Kallikrein die physiologisch-wirksamen Kinine (z.B. Kallidin) frei. Kallikrein-Präparate werden daher therapeutisch verwendet (E.K. Frey, K. Kraut, E. Werle, Das Kallikrein-Kinin-System und seine Inhibitoren, F. Erike, Stuttgart, 196S, S. 150 f).

Es ist bereits bekanntgeworden,, daß reines Kallikrein z.B. aus Pankreasdrüsen von Schweinen nach dem Verfahren der DT-OS 2 154 557 hergestellt werden kann. Die Anwendung an Patienten erfolgt bevorzugt oral oder durch intramuskuläre oder intravenöse Injektion.

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Bisher vrar es aber nichi: zi'i glich, up sr längere ζ,θΙϊ hai~"ba:ri

^ ν, _ .=-, X 1 _■ W ^ JL ±

.*-*·."c3c"1 ■"?.': 2. ν Ten j_nOj!r wen ^usa^^cn a_i_s

rrinzioiell unsrvranselite ?r"~:dstoffe

injizier-.

"•'eiterhin konnte bisher eins Stabilisierung der lösungen von Pis.!Ii"'""""2ir ^""undsätzlich dndu^c'i ^-^reicrt v."srdⁿr · ds ¹^ ^"s.r d^"^ Xalli/irein-lösung gaeinrnate, PZallikrein nicht herr.~-?nde inhibi~cren, zusetzto und eis ?rct3£S3n-T2runreinigung"h dadurch unv/irksani nachte. Derartige Zusätze von ?rD"ds~oizen mit biologischer ¥irltsar.ke-it sind jedoch bei einsn Arzneimittel höchst unervranscht,

Es war deshalb erstrebenswert, ein Verfahren zu finden, u~i über längere Zeit stabile hochreine Lösungen vcn Kailikrein ohne Frendzusätze herzustellen.

Es "wurde gefunden, daß nan stabile, proteasefreie und injizierbare Kallikrein-Lösungen bisher noch nicht bekannter Stabi lität und Reinheit durch Behandlung von reinen Kaiiikreinlösungen mit einem trägergebundenen vrasserunlcslichen Protease inhibitor, der Kallikrein nicht hemint, gewinnen kann.

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■"'^ 6 O 9 8 1 2 / O 9 U 3PAD ORIGINAL

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crhin Pfunden, daß auch die reinsten bisher
er_:?r Präparate vor. Kallikrein noch Spuren an
_c., ί'^ί-·.-οΐ.':Ξ^ε.1-?η;.3:Ί^>! Fer~en-en ir. einer Größen-

FrcTea2en-Vrirunr£ini~un:~en lassen sich r.it den üblichen ;ri~ und unter -rcßsn Verlusten an Kallii:ren-Ak~ivität

-aschendervreise ist es mit Hilfe des erfindungsgenäßen
ihrens auf eine selch einfache und elegante ".'."eise nieglich

über einen längeren ^eitraun stabile, hochreine Xallil-irein-1';'sung en herzustellen, ohne daß Stabilisatoren zugesetzt \v*er-

/-^^-^ _w *^.-. ~,-.... ozv"· o~~*~G oa3 cas "!^„ϋ-Ί ^ein zuerst "-'c^^ixisiert

ur.d erst l-:urz vor Gebrauch zur geeigneten isotonischen Lösung'

las erfindungsger.äße Verfahren von Kallikreirlcsungen bisher
noch nicht erreichter Stabilität und P.einheit stellt einen
großer Fcrtschritt auf den C-ebiet der Ph.arr.azie dar.

Bezüglich der beir. erfindungsgenäßeη Verfahren eingesetzten
trägergecur.dencn Inhibitoren ist folgendes zu sagen:

Als Inhibitoren eigr^r. sich dabei insbesondere natürlich vor- > erbende Inhibitoren r.it Polyp ept ids truktur ζ.3. ein Gerasch verschiedener Proteaseinhibitoren aus Sojabohne oder aus Kartoffel, oder der gereinigte Trypsininhibitor aus Sojabohne

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(Zunitz) cder gereinigte Proteaseinhibitoren aus Kartoffel cder der Cvor.ucoid-Irx-ibitor aus Hühnerei. Insbesondere das Prc-eas-ninhibitor-Oomisch aus Kartoffel ist ein leicht zugängliches Material, das sich für den erfindungsger.äßen Zweck

Hit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens könr.en in Prinzip auch Proteasen aus Lösungen von anderen Naturstoffen als Kalli krein entfernt werden, für diesen Zweck ist neben den bereits genannten Inhibitoren insbesondere auch der Kunitζ-IrypsinInhibitor aus P.indercrganen geeignet.

Solche andere Lösungen, auf die sich das erfindungsgemäße Verhren sinnentsprechend anwenden läßt sind insbesondere sungen von Enzymen, z.3. Asparaginase, Carbcxypeptidase A

und Ξ, von Zyr,cgenen, von Peptidhornonen, z.3. Ox^.'tocin,

Vascpressin, Insulin, Glucagon, sowie Blutplasna und daraus

hergestellte gereinigte Fraktionen.

Die rindung der obengenannten Inhibitoren an wasserunlösliche "rager erfolgt nach allgemeinen, dem Fachmann bekannten Verfahren. Dabei müssen jedoch in jedem Einzelfall die optimalen Bedingungen in einer großen Zahl τοπ Versuchen ermittelt·werden.

Z.B. kann man die genannten Inhibitoren oder weitere mit ähnlichen Eigenschaften nach DOS 1 907 365 an vernetzte Agarose ("Sepharose"^¹"') binden, indem man diese zuvor mit BrCN aktiviert. In der gleichen Weise kann man die Inhibitoren auch an andere hydroxylgruppenhaltige Träger binden, z.B. an Cellulpse cder quervernetztes Dextran ("Sephadex"' ').

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BAD ORIGINAL

Oder man karr, zunächst eine niedermolekulare Amino-Verbindung mit SrCIT an einen der 'vorgenannten Träger binden, so da3 ein Derivat ~i~ einer freien Amine- oder Carocxyl-Grupps entsteht, an die man i^n Inhibitor mittels eines wasserlöslichen Carbodiimids bindet. Als niedermolekulare Aminoverbindung verwendet man dabei z.B. 1 ,6-Diaminche::an oder 6-Aminocapronsäure.

Des v/eiteren kann man die Inhibitoren an caroonsäureanhvdridhaltige Polymere binden, z.B. an ein Copolymer!sat aus Tetraathylenglykoldimethacrylat und I-Ialeinsäureralrydrid nach DT-OS 2 215 539 oder ein Copolymerisat aus Tetraäthylenglykcldinethacrylat;, I-Ialeinsäurearihydrid und einem l-rydrophilen Kononeren z.B. Methacrylsäure nach DT-CS 2 215 cS7.

V.'eitere anv/endbare Verfahren zur Herstellung wasserunlöslicher trägorgebundener Inhibitoren sind z.B. von P. Cuatrecasas und Ch. 3. Anfinsen (Annual Reviews of Biochemistry", 19⁷I) zusar.r.enfassend beschrieben worden.

Die Behandlung des nach DT-OS 2 154 557 oder anderen geeigneten Verfahren hergestellten hochgereinigten gegebenenfalls kristallisierten Kallikreins mit den trägergebundenen Inhibitoren zum Zwecke der Stabilisierung erfolgt erfindungsgemä-i in verdünnter v;ässriger Lösung, enthaltend 1 bis 50.000 ΒΙΞ/nl bei einem pK-?/ert vcn 5,0 bis 8,0. Die Lösung kann die üblichen Neutral- oder Puffer-Salze in Konzentrationen bis zu 1,0 H enthalten, z.B. Alkalimetall- oder Ammoniumchlorid, -acetate, -forniate, -carbonate, -citrate, -phosphate u.a. Bevorzugt■erfolgt die Behandlung in salzfreier oder gegebenenfalls isotonischer NaCl- oder acetathaltiger Lösung, damit die stabilisierte Lösung unmittelbar ohne Entsalzung zur Herstellung therapeutischer Präparate verwendet werden kann. Die Lösung kann ferner geeignete

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BAD

"i.allil:rein-Lesun~ τ.it dor. träge

! τ λι

l~rs.ticri ci?r Z32itriiuza'bicn ab~rorm^, Z~vcrzu;~ "-:ird aber n Chrcr.ato.^rapnicrclir siiifull'i v.r.l die Kalli>rci::l23ung hin-

^rerv;endeten Inhibitor und de~ Grad de der ζ ν. oehar. lelndsn Losung. Di

j_nnici-

τ ^J.-

Ί_.τ;ο.^ ^ΐ ^^ dl'^O P ^-^ " ^^ ^ Ί ^{Ί ?}· 0* ^t

auren Puffern regenerieren und ™ehr:;ais ver

er Erfolg

der Behandlung der Äallihrein-Lesung r.it trägerge-

unden

nsn Inhibitoren zei:~t sich ar. v

erringe

en Preteasenge-

hal"c und der verbesserten S~abili"t:ä~.

Der Prcteasengehalt wird gemessen durch .Titration der freigesetzten Aränosäuren-Carboxylgruppen bei der Einvirhung der proteasenhaltigen ?Iallikreinlösung auf Casein. I-Ian verwendet eine β ;:.ige Lesung von Casein (nach Harnnersten, Ms-rel·: 2242) in 0,1 N KCl und titriert mit 0,02 y, ΖΠλ bei pH 9_f5 und 3O⁰C. 1 Proteasen-Einheit ist definiert als die Znzyr_rr.enge, die in 1 Minute unter den angegebenen Bedingungen 1 Mikrcäquivalent ?ep~idbindung spaltet.

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BAD ORJGiNAL

;iu:t.~ der .VeTllikreinpräparate ~vurde zur Ver

, cei '4C C durchgeführt. Die Kalli-

• c*. *.λ. ν._ -*. L, j. V'.- „ri^aO- 1-i.j. i_.*··-. C- J- O^. -i» O. j-ο

1.?.-Z-inlieit is~ definier

:.":"iiTc, g.:.d ir. oiror Ilir.uts csi ~H S.O und

;ehnunj in lie recrliuchlichen Kallil-irein-^inheiten (ΚΞ) nach ^:r Definiiien vor. 7rev. .Vreutund Verlo erfol-rt durch I-Iulti-

_e eeira erfindungsge".-:"..;en Verfahren hergestellten Kallikroin- :.r^i~z?n leeierun'cen direh~ als Arzneimittel eingesetzt und oral

cde

intrav~nc

:rd~u. lic Trrriniun-τΞτtt.'lIJ:"n Drc"O3.cofrci9n, sta'oilsn Kalli·- "cinlOJUnTi¹Dn Vtricn "■■'oclir.li/.l-i^ervrsicc in Ar.pullenicrrr. aufbe-

ε· z.rzino.ung virc euren cig ncigerasn. j^eispi9_e naner erxau^ τ .^edocii nicht auf die- in den Beispielen dargestellten Ver— nrens'reιsen dosciraivw.

1 iieser Anr.sldung enthält einen Vergleich der HaIt η "."er3onie-o.'cn?n ICallihrefnpräparaten aus den nachste spiSxGr., TJare — vurc-c die A-*i~ivitä"fc in Prozent der

'*-"-■./—i^ —'- - — .—■-'--.- ^- i^-^^ — ..t_i^_.r. rr._ -^ csr La— usgedrück* in lagen) gecracht. Die einzelnen Kurven

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_BAD

behandeltes Kallikrein aus Beispiel 1 b behandeltes Kallikrein aus Beispiel 6 behandeltes Kallikrein aus Beispiel 5c behandeltes Kallikrein aus Beispiel 3b unbehandeltes Kailikrein aus Beispiel 2 behandeltes Kallikrein aus Beispiel 10

unbehandeltes Kallikrein aus Beispielen 1 und 3 bis 10

Bei allen in den folgenden Beispielen angegebenen Kallikrein-Einheiten (KE) handelt es sich um Einheiten nach Frey, Kraut und Vi'ehrle.

Beispiel 1

üurve	1
Kurve	2
Kurve
Kurve	L
Kurve	6
Kurve	7

a) Bindung von Soja-Trypsin-Inhibitoren an Sepharose

10 ml Sepharose^ 4 B (Pharmacia), einer vernetzten Agarose, werden mit Wasser gewaschen, in 20 ml Wasser suspendiert und bei pH 11 bis 11,5 mit 550 mg BrCN in 20 ml Wasser 5 Minuten aktiviert. Es wird über eine Glasfritte abgesaugt und mit eiskalter 0,1 M NaHCO^-Lösung kurz gewaschen. Die aktivierte

Sepharose^ wird sofort in 30 ml kalter 0,1 M NaKCO-^- Lösung suspendiert und 100 mg Sοja-Trypsin-Inhibitor (reinst, Serva) zugefügt. Die Mischung wird 24 Stunden bei ca. 4 C gerührt. Dann saugt man den trägergebundenen Inhibitor über eine Fritte ab und wäscht mit 0,1 M Borat pH 8,0, 0,1 M Acetat pH 4,0 und Wasser.

Aus der spektrophotometrischen Bestimmung des ungebundenen Inhibitors im Filtrat und Waschwasser ergab sich eine Bindung von 94 mg.

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b) Behandlung von Kallikrein mit trägergebundenem Sοja-TrypsinInhibitor

50 mg Kallikrein mit einer spezifischen Aktivität von 1013 KB/mg und einein Proteasengehalt von 0,065 E/mg wurden in 10 r.l H₂O gelöst und über eine Säule (0,9 χ 15 er.) enthaltend 10 ml des nach 1a) hergestellten trägergebundenen Inhibitors filtriert. Das Kallikrein enthaltende Filtrat wurde lyophilisiert und ergab 49 mg mit 1010 KE/'mg

(= 97,5 % der Theorie) und einem Proteasengehalt von 0,005 E/mg.

Der Vergleich der Stabilität von Ausgangsmaterial und Produkt ist in Figur 1 dargestellt.

In der Figur 1 (Vergleich der Haltbarkeit von KallikreinPräparaten) ist auf der Crdinatenachse die jeweilige- Aktivität der Kallikreinpräparate in Prozent der- Ausgangsaktivität (=100) aufgetragen, während auf der Abszinenachse die Lagerzeit der Kallikrein-Präparate in Tagen angegeben ist.

Beispiel 2

mg Kallikrein mit einer spezifischen Aktivität von KS/mg und einem Proteasen-Gehalt von 0,058 Ξ/mg wurden in Wasser gelöst und über 22 ml eines nach 1a) hergestellten trägergebundenen Soja-Trypsin-Inhibitors filtriert. Das Filtrat ergab nach der Gefriertrocknung 695 mg mit einer spezifischen Aktivität von 1050 KE/mg (= 95 % der Theorie) und einem Proteasengehalt von 0,005 E/mg.

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a) Bindung von Ovoirucoid-xnhibitor an· Sepharose

.In analoger 7»*cise wie unter la) 03schrieben, wurden 10 ml Sepharose mit BrCN aktiviert und mit 100 τ:.ζ Ovonuccid (V/or thington) umgesetzt. Ss wurden 73 ir.g Cvcnuccid gebunden .

b) 50 mg Kallikrein (spez. Aktivität: 1013 KE/ης; Proteasen: 0,065 E/mg) vrurden in 0,02 Anmoniumacetat pH 6,0 gelöst und über eine Säule (0,9 x 15 cm) enthaltend 10 r.l des nach 3a) hergestellten trägergebundenon Inhibitors filtriert. Die Kallikrsin-Ausbeute in Filtrat betrug 92 ^o der Theorie. Sir.-e Probe vrarde über 3-ephadex G-25 entsalzt vjnd lycphilisiert: spezifische Aktivität: 9SO ίΞ/mg; Froteasen:

G,003 E/ng. Zur Stabilität dieser Probe s. Figur 1.

Beispiel ^-

a) Herstellung von Inhibit'oren-Genisch aus Kartoffel

Gewaschene Kartoffeln werden zerkleinert und in einer Mischung von 0,95 kg Methanol, 0,375 kg destillierten Wasser und 0,025 kg 60 % Perchlorsäure je kg Kartoffel suspendiert. Ungelöstes wird über eine Filterpresse abgetrennt. Die Perchlorsäure wird durch Zugabe von Kaliumcarbonat bis pH 5,5 neutralisiert. Ausgefälltes Kaliu~perchlorat wird abfiltriert. Das Filtrat durch Eindampfen im Vakuum konzentriert, dann dialysiert und schließlich gefriergetrocknet. Nan erhält ca. 450 ir.g Inhibitor/kg Kartoffel.

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) Bindung vcn Inhibitoren-Go-nisch aus Kartoffel an Sepharose

160 ir.g eines Inhibitoren-Fräparatss nach 4a) vrarden in analoger ".'."eise -.-.-ie unter la) beschrieben mit'A-O ml BrCN-aktivierter Sopharcse umgss3tzt. Es wurden 139 mg Inhibitor

c) 50 ~g ΚΞ-llikroin (spez. Aktivität 1013 Ki/ng; Proteasen: 0.055 Z/~s) wurden in 0,05 K Anmoniumacetat pH 6,0 gelöst

und über eine Säule (0,9 x 15 cn) enthaltend 10 r.l des nach 4b) hergestellten trägergebundenen Inhibitors filtriert. Die Kallikrein-Ausbeute in: Filtrat betrug 89 % der Theorie. Sine entsalzte und lyophilisierte Probe hatte eine spezifische Aktivität von 1010 KE/ng und einen Proteasen-Gehalt von 0.CC4 E/ng.

3 e i ρ "C' i β 1 5

a) Herstellung vcn gereinigtem Proteasen-Inhibitor aus Kartoffel

60 g eines nach Beispiel 4a hergestellten Proteaseninhibitorgemisches aus Kartoffel werden auf eine Säule (0,5 x 110 er.) enthaltend 7 1 Carboxyinethyl-Sephadex C-50 in 0,01 K Arnmcniumacetat pH 5,4 aufgetragen. Man wäscht anschließend zuerst mit 2 1 des Ausgangspuffers und eluiert dann nit einem linearen Konzentrationsgradienten bis .1 M Ammcniur.acetat pH 5,4. Fraktionen mit hoher Inhibitorwirksamkeit gegen Pankreasproteasen werden vereinigt, konzentriert, dialysiert und gefriergetrocknet. Man erhält ein angereichertes Inhibitorpräparat in ca. 12 % Gewichtsausbeute bezogen auf das eingesetzte Rohpräparat bzw. 55 mg/kg Kartoffel.

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. BAD. ORIGINAL

"-·' ---'Vj-r -/on Fereini~ten Proteasen-Inhibitor aus Kartoffel.

W r. :j. e " η a r c r e

— —o -_■ ." _L w J__i ,Uy LO C: Oi j. J. J- ~ u -> ·-- - -'-..i-.-^ ·- j. υ C_ — JTl üj..'c;_ i_ υδ

J-. ..U-.!;-, -·Ο - Oi..^, ^_ O I₁UI U-'-iJ, I H-O J-JX u3c -1 ^..'_'^v... O

^ j_n ~Z.zi.chsT ^riss "vie in ^#4c^ '•■■"j.rd.cn i;C n:g Kallilir-in ~.it 13 r.l 'üdg nr.eh ^o herg-Tste'-Z-tsr-. trägorgDbunisi'.rn Inlii'ei" er; ceneniolt, Lie Ausbeute t;-;ru_:s 93 ^ eier Tr.ecrie. :.ie s~e::iiis^he Aktivität ICiC ΓίΖ-rr- der ProteasiT.grhar.":

Zur Hr.r.tcr.rkeii: dieses ?r:Vcc.rc.ts5 vgl. ?i.s;ur ^ .

·„ 3 4 Γ-1 der nach Beisriel Is.), ja) "uri ja) hergestellten

~ra\gergebundoren Inhibitoren "Turden gemischt und 5 C ~-~ "."Iiv^^-'-v-- s-^^i.^- Tr₁= - ς-»·; ο ι L·") r-' — ■-- - —· ("!<->—-■ ΐ"-"~ V-V-;-.--^--- ρ-"- '.---_ beute betrug So ;'., die spezifische Aktivität "¹CTC "l/rg, z:s Preteasen-Gehalt 0,C37. Zur Haltbarkeit ::.?:rs "alli?_r.:ir.-.-rrparaxes ~~ζ!.. Figur 1.

a) Bindung von 1 ,6-Dianinohexa.n an Sepharcse

ICC nl Sephaross ?~arden mit 15 g ZrCi" aktiviert und dann ir.it 23,3 g 1 ,6-Diaminchexan ur-gesot2t. Das FrcduJit vrx-de nit Eoratpuffer pH 8,5, Acetatpuifer τ>'Λ 4,0 und 'vasser gc-'.•:asclien. Sine gefriergetrocknet:· Probe hatte einen N-Sehalt

vcn 5-9

: ι

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BAD ORiGiiMAL '

b) Bindung von Proteaseninhibitor aus'Kartoffel an mit 1,6-Diaminohexan substituierte Sepharose

16 ml des Sepharose-Darivats nach 7a) wurden in 15 ml Wasser suspendiert und nach Zugabe von 200 mg Proteaseninhibitor aus Kartoffel (nach Beispiel 5a)) und 200 mg Äthyl-(3-äimethylaraino-propyl) -carbodiimid-hydrochlorid (Merck) 24 Stunden bei pH 4,7 gerührt. Sodann wurde abfiltriert und mit 1 M NaCl und Wasser gewaschen. Es wurden 189 ng Inhibitor gebunden.

c) 50 mg Kallikrein wurden wie in Beispiel 4c) beschrieben mit dem nach 7b) hergestellten trägergebundenen Inhibitor behandelt. Die Ausbeute betrug 93 % der Theorie, die spezifische Aktivität 995 KE/mg, der Proteasengehalt 0,011 E/mg.

Beispiel 8

a) Bindung von Proteaseninhibitor aus Kartoffel an mit 6-Aninocapronsäure substituierte Sepharose

16 ml mit 6-Aminocapronsäure substituierte Sepharose

f R)

(CH-Sepharose^ , Fa. Pharmacia, Uppsala) wurden wie in

Beispiel 7b) beschrieben mit 200 mg Proteaseninhibitor aus . Kartoffel umgesetzt: Es wurden 195 mg Inhibitor gebunden.

b) 50 mg Kallikrein wurden wie in Beispiel 4c) beschrieben mit dem nach 8a) hergestellten trägergebundenen Inhibitor behandelt. Die Ausbeute betrug 92 % der Theorie, die spezifische Aktivität 983 KE/mg, der Proteasengehalt 0,0095 E/mg.

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BAD ORIGINAL

"^¹ "Λ " C* """I ~ ΓΪ ~ Q

a) Herstellung eines Ccpolyr.erisats aus Tetraäthylenglykcidimethacrylat, Methacrylsäure und Maleinsäureanhydrid

60 g Tetraäthylenglykeldi-e-hacrylat, 30 g Methacrylsäure, 10 ~ Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoiscbuttersäursnitril

vriTii³ ηη tv-, 7""^" ,—.1 Λ ρ — -τ- ριη ή 4- -ρ -5 ~-5ι~ρτ{- T^¹ ■; Ρ> C^ ■= ",ΓΠ'νΛ- -.π r"i in

A «.^ J. X-J. -^* J.X J-Xj. ^. *~t *~j - ..—. —τ. Ο >^ U O XX-L UX — . -* — O O O · J_y _i_ t^ O >_* -^V^ i~- w—j-j. —. »( ^- -i. »X -UXX

Λ Ί t^o^'T'"--^-' / T-" "O ^ OO Ί Zi. ^ *" ί"¹ ' -*-n ^ ^Vi .^ c* '-λ ~ ^ - -^ C r: :1?^-| ς^>,ρις

von Gl}.*cerin-:.icnc- und dioleat enthält, suspendiert und 22 Stunden bei SC⁰C polymerisiert.

Die Poiyirerperlerx werden aef iltriert, dreimal in Benzol und zweimal in Petroläther (Kp 30 - 5O⁰C) suspendiert und im setrocknet.

Ausbeute: 94 £■
Schüttvolumen: ^- r.l/g Quellvclumen in Nasser: 5,5 ml/g

ι- - 2 ' Spezizische Ooer::.i2iche: ο,Ό π: /g

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen: 4,3 ~- Aqu/g b) Bindung von Proteaseninhibitor aus Plartoffel

1Cg eines Copelyr.erisats nach Beispiel 9a) warden mit 100 ml Aceton gewaschen und anschließend in SSC ml Wasser suspendiert. Es wurden 40 ml 0,1 M Triäthylamin zugefügt und genau 1 Minute mit 0,1 M Essigsäure pH 6,2 eingestellt. Dann wurde 1,0 g Proteaseninhibitor aus Kartoffel nach Beispiel 5a) zugefügt und der pH auf 6.2 gehalten. ITaeh 24 Stunden wurde der trägergebundene Inhibitor abfiltriert, mit 0,1 M Borat pH 3,5? 0,1 M Acetat pH 4,0 und Vass. waschen.
Es wurden 280 mg Inhibitor gebunden.

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BAD ORiGS^AL

2U2995 JS

.i-'.reir. vrj.ricn ν;ie in Eeis^iel ^c) beschrieben mit

^ s- S S " .

.^:.ucb"u~e betrug cc y? dor iheorie, die "",~. "C'.": IZZ/ry, der Froteasongehalt

3s? der Ζεΐιεηί.ΐν.η." vcn }.a_iil:reir. r.it den vertrL'gergccuidenrr. IrJr.ibitoren sind.in der folgenden c.rjr.cHS'ci'"βΐ.

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BAD

tr¹ co

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VO VJl

m	609	I
a	OO	(Tv
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Ergebnis der

Ta bo 11

; von Kallikro.in mit tr i i.»; c ι '

d c η ο r ι In h i b itoi oh

Beispiel	Λυ	KE/mg	N	J	1080	s gang's material	Au	behandeltes Kr	KE/mg	illikrcin
			97	sbcute %	1010
1b)			92	,5	980
3b)			89		1010
4c)			95		1010
5c)			96		1000
6			93		995
7c)			92		988
8b)			88		1005
9c)			95		1050'
2	" 1013
	Proboane-E/rng	Proteasen-E/in/
		0,005
		0,008
	0,004
0,065	0,009
	0,007
	0,011
	0,0095
	0,011
0,058	* 0,005

Alt

10. Vergleichsbeispiel

" ' . . Il I "■ I . ι ,

Chror.atografie von hochgereinigtem Kallikrein an DEAE-sephadex A-50 \

103 ag Kallikrein mit einer spezifischen. Aktivität von 1013 KE/ir.g und einem Proteasengehalt von 0,065 E/ng wurden in 50 ml Natriumacetatpuffer pH 5,0, 12 nS/cn gelöst und über eine Säule 2,5 x 40 cn mit DEAE-Sephadex A-50 im
gleichen Puffer gegeben. Die Säule vrurde nachgev/aschen mit 3CO ml Natriumacetat pH 5,0, 14 mS/cm und eluiert mit einen linearen Gradienten aus je 300 ml Natriumacetat
pH 5,0 14 mS/cm bzw. 0,5 M.

Die aktiven Fraktionen des Eluats (210 ml) vairden verreinigt, durch Ultrafiltration auf 20 ml konzentriert, über eine Säule von Sephadex G-25 entsalzt und gefriergetrocknet.

Ausbeute; 61 mg nit 1320 KE/mg = 79 tf Proteasengehalt: 0,014 E/mg

Die Stabilität dieses Präparates ist in Figur 1 dargestellt.

L-. A 15 950 - 17 -

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BAD

Claims

*) 5

5 ^abile , Ore '.ecso-Troie ZaIlikreirulösunken hergestellt du^ch Behandlung vcn reiner. IvalLikreinlösur.ger 'r.it einen trägergebunden-?:' TS-SSOrUr-I^-JsIiChTr- Proteas "'inhibitor, ν.'β Icher Kallikr^in r.islit hc-ir.;t.
2) VerJahren zur Herstellung von stabilen preteasefreien Hallikreinlcsungen dadurch gekennzeichnet, da3 nän rs ine Kalli-

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3) Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an XaIIikreinlösuns ~o::Jil An^rruch "Ί .

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geändert

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ORIGINAL