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Reagens und Verfahren zur Bestimmung von in Körperflüssigkeiten enthaltenen
Stoffen Die Erfindung betrifft ein Reagens zur insbesondere halbquantitativen und
quantitativen Bestimmung von in Körperflüssigkeiten enthaltenen Stoffen, mit Hilfe
von kleinen auf eine vorbestimmte Menge der Körperflüssigkeit bezogenen Einwaagen
von Testreagentien.
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In den letzten Jahren wurden die Untersuchungsmethoden zur Feststellung
von normalen oder abnormen Zusammensetzungen von Körperflüssigkeiten immer weiter
verfeinert und die bei der Untersuchung zum Einsatz kommenden Substanzmengen auch
ständig verringert, was darauf zurückzuführen ist, daß man einerseits mit geringen
Mengen an
den jeweiligen Körperflüssigkeiten, z.B. Blut, Harn, Liquor
und dgl. auskommen muß, zum anderen die zur Durchführung der Bestimmung benötigten
Testsubstanzen bzw.
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Testreagentien zum Teil außerordentlich teuer sind. Auf der anderen
Seite ist es so, aaß die Einwaagen von sehr kleinen Substanzmengen außerordentlich
schwierig und zeitraubend ist. Man ist deshalb dazu übergegangen, sogenannte Packungseinheiten
zur Durchführung von ca. 10 Einzel tests zu schaffen. Es wird dann die 10-fach höhere
Substanzmenge angesetzt, d.h. aufgelöst, die zur Durchführung eines Einzeltests
notwendig wäre, wonach die angesetzte Substanzmenge dann, z.B. mit Hilfe von Pipetten,
in zehn Teile aufgeteilt und die Einzel tests nacheinander durchgeführt werden.
Da viele Testreagentien außerordentlich luft- und lichtempfindlich sind, sind die
angesetzten Lösungen der Testreagentien in der Regel nur kurze Zeit haltbar. Deshalb
eignen sich die sogenannten Zehnerpackungen nur für größere Labors, bei denen immer
mehrere gleichartige Diagnosetests innerhalb kurzer Zeit nacheinander durchgeführt
werden können. Bei kleineren Labors und insbesondere beim Praktiker ist es häufig
der Fall, daß nur einzelne Diagnosetests durchzuführen sind, wobei wegen der Eilbedürftigkeit
und wegen der mangelnden Haltbarkeit der Körperflüssigkeit häufig nicht so lange
gewartet werden kann, bis die für eine wirtschaftliche Durchführung der Untersuchung
erforderliche Anzahl an Einzel tests zusammengekommen ist. Man ist deshalb darauf
angewiesen, eine Zehnerpackung auch dann schon anzubrechen, wenn nur wenige Einzeluntersuchungen
durchgeführt werden, was dazu führt, daß der Rest der Testsubstanzen verworfen werden
muß. Bei einzelnen Reagentien, bei denen eine quantitative Einwaage bzw. das Einpipettieren
eines bestimmten Volumens nicht erforderlich ist, wird gelegentlich auch nur ein
kleiner Teil der Zehnerpackung angesetzt, der dann aber
in der Regel,
bezogen auf den einzelnen Test, einen erheblichen Überschuß und damit immer noch
eine Verschwendung darstellt.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die dosierte Zugabe der
einzelnen Reagentien für die Durchführung der einzelnen Bestimmungsmethoden zu erleichtern
und gleichzeitig die bisher unvermeidlichen Verluste an Testreagentien zu vermeiden.
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Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens in auf poröses
Papier aufgetrockneter Form vorliegt und das Papier in seiner Größe so bemessen
ist, daß die darin enthaltene Substanzmenge der für die Durchführung der Bestimmung
gewünschten Einwaage entspricht.
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Aufgrund der Erfindung ist es nunmehr möglich, zumindest die teuren
oder sehr empfindlichen Substanzen in Einzel-oder Mehrfachpackungen anzubieten,
in denen die für die Durchführung eines Einzeltests erforderlichen Einwaagemengen
der einzelnen Substanzen bereits in räumlich getrennter Form vorliegen, wobei die
Verwendung des Papiers als Trägermaterial eine leichte Handhabung der an sich sehr
geringen Substanzmengen ermöglicht. Dadurch, daß die einzelnen Reagentien in fester
Form in dem damit imprägnierten Papier vorliegen, entspricht die Haltbarkeit der
einzelnen Packung derjenigen der trockenen Substanzen.
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Falls es erforderlich ist, so z.B. dann, wenn es sich bei den Substanzen
um Enzyme handelt, dann können die imprägnierten Papierchen in gleicher Weise wie
die reine Substanz in einem entsprechenden Kühlraum gelagert werden und besitzen
die selbe Haltbarkeit. Das erfindungsgemäße Reagenspapier ist daher insbesondere
für die Durchführung enzymatischer Tests bestimmt.
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Zur Durchführung der jeweiligen Bestimmung wird das mit dem Reagens
imprägnierte Papierstückchen entweder direkt
in die zu untersuchende
Flüssigkeit gegeben, oder es wird, sofern die Substanz in gelöster Form zuzugeben
ist, das Papierchen zuvor in ein entsprechendes Lösungsmittel, z.B.
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eine Pufferlösung, gegeben. Bei Verwendung von Filterpapier guter
Qualität, also einem Papier, das nicht zum Zerfasern neigt, wird eine gute Einwaage-Konstanz
gewährleistet, so daß das jeweilige Papierstückchen von vorbestimmter Größe als
quantitative Einwaage dient. Das erfindungsgemäße Reagens in Form eines mit einer
bestimmten Reagensmenge imprägnierten Papierstückchens ist aber auch dann von Vorteil,
wenn das Reagens bei einer Bestimmung im Überschuß zugegeben wird, wie es bei Anfärbeverfahren
häufig der Fall ist.
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Durch die Zugabe des Reagens in Form eines Papierstückchens bestimmter
Größe kann nämlich der Überschuß an dem Reagens in vernünftigen Grenzen gehalten
werden, so daß hier unnötige Substanzverluste vermieden werden.
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Das Auf trocknen der einzelnen Substanzen auf das Filterpapier kann
in der Weise erfolgen, wie es bei den bekannten Indikatorpapieren der Fall ist,
wobei in entsprechender Weise auf Luft-, Feuchtigkeit- und Lichtempfindlichkeit
des einzelnen Reagens Rücksicht genommen wird. So kann das Filterpapier mit einer
gesättigten Lösung, vorzugsweise einer gesättigten wässrigen Lösung, des Reagens
imprägniert werden. Ist die Löslichkeit des Reagens in dem Lösungsmittel besonders
hoch, so daß u.U. die Bildung von nur lose im Filterpapier sitzenden Einzelkristallen
zu befürchten ist, dann kann natürlich auch mit entsprechend eingestellten verdünnten
Lösungen gearbeitet werden. Auch kann ein gutes Haften des Reagens im Filterpapier
dadurch gewährleistet werden, daß das Reagens zusammen mit einem Bindemittel auf
das Papier aufgetrocknet wird, das sich in der jeweiligen Körperflüssigkeit gut
löst, an der Körperflüssigkeit jedoch
keine Veränderungen vornimmt,
insbesondere die durchzuführende Reaktion nicht stört, und wie es auch beim Filterpapier
der Fall ist, lediglich als inerter, die Reaktion nicht beeinflusserder Träger dient.
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Auf der anderen Seite kann das Reagens aber auch in Kombination mit
weiteren miteinander verträglichen Reagentien auf das Papier aufgetrocknet sein.
Das kombinierte Aufbringen von mehreren miteinander verträglichen Substanzen ist
z.B. dann erwünscht, wenn die Reihenfolge der zum Reaktionsmedium zuzugebenden Substanzen
beliebig ist. Ist bei der Testreaktion eine Pufferung erforderlich, dann kann, insbesondere
bei Mikromethoden, auch der Puffer in dem Papier mitenthalten sein.
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Ein wesentliches Merkmal der Erfindung ist noch darin zu sehen, daß
es durch die Erfindung ermöglicht ist, dasjeweilige Reagens zu kennzeichnen, indem
Art und Menge der jeweils als Reagens verwendeten Substanz durch Aufdrucke, Farbgebung,
Papierform und/oder durch bestimmte Symbole auf dem Papier kenntlich gemacht werden.
Auf diese Weise kann auch die jeweilige Bestimmungsmethode, bei der das Reagens
zum Einsatz kommen soll, durch entsprechende Kennzeichnung zum Ausdruck gebracht
werden, so daß Verwechslungen von einzelnen Reagentien vermieden werden. Die Erfindung
betrifft auch ein Verfahren zur Durchführung von insbesondere halbquantitativen
oder quantitativen Bestimmungen von in Körperflüssigkeiten enthaltenen Stoffen,
bei dem auf eine bestimmte Menge der Körperflüssigkeit abgestimmte Einwaagen von
Testreagentien zur Anwendung kommen.
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Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines
der Testreagentien in Form eines mit dem Testreagens imprägnierten Papier eingesetzt
wird, wobei die Größe des vorgefertigten Papiers der gewünschten vorbestimmten
Einwaage
des Reagens entspricht. Es ist also bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Testreagentien
für die einzelnen Bestimmungsmethoden lediglich darauf zu achten, daß das Volumen
der zu untersuchenden Körperflüssigkeit den Angaben der jeweiligen standardisierten
Untersuchungsmethode entspricht, auf die die Größe des Papiers, d.h. die Einwaage
des jeweiligen Testreagens abgestimmt ist.
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Bei teuren Reagentien, insbesondere bei Coenzymen und Enzymen wählt
man vorzugsweise eine Papierform der Papierstückchen bzw. Plättchen, die sich ohne
Abfall aus einem größeren Papierbogen bzw. Streifen herstellen läßt. Im übrigen
kann die Gestalt der Papierstückchen beliebig gewählt werden, wobei möglichst leicht
unterscheidbare Formen von Vorteil sind. Die Größe der einzelnen Papierplättchen
hängt im wesentlichen von der Substanzmenge ab, die beim jeweiligen Test zum Einsatz
kommt und damit auch von der Konzentration des einzelnen Reagens in der Lösung,
mit der das Filterpapier imprägniert wird. Zweckmäßige und leicht handhabbare Papiergrößen
liegen im Bereich zwischen ca. lO und 150 Quadratmillimeter, wobei bei Ansetzen
mit größerem Flüssigkeitsvolumen bei der Durchführung der Bestimmungsmethode natürlich
auch größere Papierstücke eingesetzt werden können. Die Papierstärke kann im Bereich
der Stärke von normalem Filterpapier guter Qualität gehalten werden. In besonderen
Fällen können aber auch dickere Filterpapiere zur Anwendung kommen.
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Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung
eines Beispiels in Verbindung mit den Ansprüchen.
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Beispiel 1 Bei der folgenden Beschreibung einer Lipoprotein-Elektrophorese
werden die Testreagentien dem Blutserum bzw.
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Blutplasma nicht in einem bestimmten stöchiometrischen Verhältnis
zu den darin vorliegenden zu bestimmenden Lipoproteinen zugegeben sondern in einem
gewissen Überschuß, wobei jedoch Wert darauf gelegt wird, daß der Überschuß wegen
des hohen Preises einzelner Testreagentien möglichst klein gehalten wird. Außerdem
zeigt das Beispiel die leichte Durchführbarkeit der Bestimmung infolge der einfachen
Zugabeweise der Testreagentien.
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Ein Papierstreifen von guter Filterpapierqualität wird in eine wässrige
Lösung getaucht, die oxydiertes farbloses Tetrazoliumsalz (Tetranitro-blau) und
Phenazinmetiosulfat in gesättigter Konzentration enthält. Man läßt kurz abtropfen
und trocknet im Exsiccator über einem geeigneten Trocknungsmittel. Nach dem Trocknen
werden aus dem Papier runde Scheibchen mit einem Durchmesser von ca. 5 Millimeter
ausgestanzt.
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In ähnlicher Weise imprägniert man Filterpapier mit einer gesättigten
Lösung von NADH. Nach dem Trocknen werden Rechtecke mit einer Grundfläche von 20
Quadratmillimeter ausgeschnitten. Die Rechte;-form wurde gewählt, um gegenüber den
runden Plättchen leicht unterscheiden zu können und eine abfallfreie Teilung das
Filterpapiers zu erhalten.
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Die trockenen Plättchen werden getrennt voneinander in bestimmten
Mengeneinheiten verpackt Ul: entsprechend der Empfindlichkeit der einzelnen Reagentie..
aufbewahrt.
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0,2 Milliliter Patientenserum, das nicht älter als 24 Sunden ist werden
nun zunächst mit einem runden Plättchen versetzt, das den Tetrazoliumleukofarbstoff
und den Elektronenüberträger enthält. Man schüttelt einige Zeit, um die beiden Substanzen
aus dem Papier in Lösung zu bringen. Nunmehr gibt man ein rechteckiges Plättchen
hinzu und schüttelt ebenfalls. Dabei färbt sich das Serum dunkelblau bis graphitschwarz.
Man läßt noch ca. 10 Minuten stehen und trägt das Serum dann in geeignerter Weise
auf einen entsprechend vorbereiteten Objektträger für die Elektrophorese auf.
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Die Elektrophorese wird über einen Zeitraum von 20 bis 30 Minuten
durchgeführt, wobei mit einer Stromstärke von 4 m/A pro Objektträger gearbeitet
wird.
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Bei der Reduktion des Leukofarbstoffs wurde ein lipophiler Farbstoff
gebildet, der sich direkt an die Lipoproteine anlagerte. Dadurch, daß der Farbstoff
in Gegenwart der Lipoproteine gebildet wird, ist die Einfärbung der Lipoproteine
sehr intensiv und beständig. Die mit deri Filterpapierstückchen eingebrachte Substanzmenge
reicht aus, um die im Serum vorhandenen Lipoproteinevollständig anzufärben, wobei
ein im Serum verbliebener Farbüberschuß sich bei der Elektrophorese nicht nachteilig
auswirkt. Die einzelnen Lipoproteine werden während der Elektrophorese aufgetrennt,
wobei sie als farbige Streifen wandern. Nach Beendigung der Elektrophorese kann
direkt mit de Auswertung begonnen werden, was makroskopisch oder densitometrisch
mit einem Elektrophoreseschreiber erfolgen kann. Einebesondere nachträgliche Fixierung
ist nicht erforderlich.
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-ln gleicher Weise eignet sich die erfindungsgemäße Zugabeform der
Reagentien auch für andere Testmethoden. So
können die meisten
Reagentien, die in Form von vorbestimmten Mengen zum Einsatz kommen, in der erfindungsgemäßen
Weise auf Papier aufgetrocknet und zusammen mit dem Papierträger zugegeben werden.
Als weitere Beispiele für die Anwendbarkeit der mit Reagentien imprägnierten Papierstückchen
seien enzymatische Triglyceridbestimmung sowie die bekannten Tests zur Bestimmung
von GOT, GPT, LDH und dgl. erwähnt.
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Beispiel 2 Die Bestimmung der GPT Ein Filterpapier von bestimmter
Größe wird in geeigneter Weise gleichmäßig mit einer Lösung imprägniert, die Phosphat,
L-Alanin, NADH und LDH in aufeinander abgestimmten Mengenverhältnissen enthält.
Dabei wird so vorgegangen, daß das Filterpapier soviel von der Lösung aufnimmt,
daß es mit der für die Durchführung von 10 Einzelbestimmungen ausreichenden Substanzmenge
imprägniert ist. Dies sind im vorliegenden Fall 800 mM Phosphat 8 M L-Alanin 1,6
mM NADH 68 rg LDH.
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Nach dem Trocknen wird dieses erste Filterpapier in 10 gleiche Teile
geschnitten, so daß ein Teil die für eine Einzelbestimmung erforderliche Menge der
Substanzen enthält. In ähnlicher Weise wird ein zweites Filterpapier mit einer Lösung
von oC-Ketoglutarat imprägniert, wobei die Konzentration der Lösung, die Lösungsmenge
und die Papiergröße so aufeinander abgestimmt sind, daß das Papier 180 mM oG-Ketoglutarat
aufgenommen hat. Auch dieses Papier wird nach dem Trocknen in 10 gleiche Teile geschnitten.
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Zur Durchführung der Bestimmung wird nun ein Teil von Papier 1 in
3 ml Wasser gegeben, wobei zum Auflösen der einzelnen
Substanzen
leicht geschüttelt wird. Es werden dann 0,l ml Blutserum zugegeben. Es wird in üblicher
Weise 10 Minuten gewartet, wonach die Reaktion durch Zugabe eines Teiles des Filterpapiers
2 gestartet wird. Die Extinktionswerte werden dann wie üblich im UV-Bereich dreimal
in Abständen von einer Minute abgelesen. Dieses Beispiel zeigt, daß ein gemeinsames
Auflösen der für 10 Bestimmungen gedachten Substanzmenge undAbpipettieren der jeweiligen
Anteile für eine Einzelbestimmung nicht mehr erforderlich ist.
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Hierdurch wird das Vorgehen nicht nur vereinfacht, sondern es werden
auch mögliche Fehler beimAbpipettieren vermieden.
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Weiterhin ist es möglich, nur einen einzelnen Test durchzuführen und
die Papiere für die übrigen Tests dann in geeigneter Weise weiter aufzubewahren.
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Beispiel 3 Die Bestimmung von GOT ähnlich wie in Beispiel 2 wird
ein Filterpapier 1 mit 800 mM Phosphat 2 M L-Aspartat 1,8 mM NADH 75 U MDH 37 U
LDH imprägniert, wobei mit möglichst konzentrierten Lösungen gearbeitet wird. Das
zweite Papier wird, ähnlich wie in Beispiel 1 mit einer Menge von 120 mM oC-Ketoglutarat
imprägniert. Die Einzelbestimmungen werden in gleicher Weise wie in Beispiel 2 durchgeführt.
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Beispiel 4 Die Bestimmung der γ- GT Ein Filterpapier von bestimmter
Größe wird in der Weise mit einer Lösung imprägniert, daß es 40 0 mM L - d- - Glutamyl-p-nitroanilid
500 mM Glycylglycin 100 mM Magnesiumchlorid x 6 H 0 480 mM 2-Amino-2 methyl-propan-1,3
diol enthält. Nach dem Trocknen wird das Papier, wie auch in Beispiel 2 und 3 in
10 gleiche Teile aufgeteilt. Zur Durchrührung einer Einzelbestimmung wird dann ein
Teil des Filterpapiers in 2 ml Wasser gegeben, um die darin enthaltenen Substanzen
aufzulösen. Es werden dann 0,1 ml Serum zugegeben, wonach in Ublicher Weise nach
1,2 und 3 Minuten die Extinktion im UV-Bereich abgelesen wird.
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Beispiel 5 Die Bestimmung der LDH Ähnlich wie bei den vorhergehenden
Beispielen wird ein Filterpapier von bestimmter Größe mit 800 mM Puffer 6 mM Pyruvat
1,8 mM NADH imprägniert und dann in 10 gleiche Teile aufgeteilt. Zur Durchführung
der Bestimmung wird ein Teil in 3 ml Wasser gegeben, um die darin enthaltenen Substanzen
zu lösen, ttsnach 0,1 ml Serum zugegeben werden. Die Extinktion wird wie üblich,
direkt nach Serumzugabe und dann nochmals nach 20 Minuten abgelesen, worauf aus
der Differenz die LDH-Menge errechnet wird.