DE2435302B2 - Reagens zur bestimmung von in koerperfluessigkeiten enthaltenen liproproteinen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Reagens zur insbesondere halbquantitativen und quantitativen Bestimmung von in Körperflüssigkeiten enthaltenen Lipoproteinen.

In den letzten Jahren wurden die Üntersuchungsmethoden zur Feststellung von normalen oder abnormen Zusammensetzungen von Körperflüssigkeiten immer weiter verfeinert und die bei der Untersuchung zum Einsatz kommenden Substanzmengen auch ständig verringert, was darauf zurückzuführen ist. daß man einerseits mit geringen Mengen an den jeweiligen Körperflüssigkeiten, z. B. Blut. Harn, Liquor und dgl. auskommen muß, zum anderen die zur Durchführung der Bestimmung benötigten Testsubstanzen bzw. Testreagentien zum Teil außerordentlich teuer sind. Auf der anderen Seite ist es so, daß die Einwaagen von sehr kleinen Substanzmengen außerordentlich schwierig und zeitraubend ist. Man ist deshalb dazu übergegangen, sogenannte Packungseinheiten zur Durchführung von ca. 10 Einzeltests zu schaffen. Es wird dann die lOfach höhere Substanzmenge angesetzt, d. h. aufgelöst, die zur Durchführung eines Einzeltests notwendig wäre, wonach die angesetzte Substanzmenge dann, z. B. mit Hilfe von Pipetten, in zehn Teile aufgeteilt und die Einzeltests nacheinander durchgeführt werden. Da viele Testreagentien außerordentlich luft- und lichtempfindlich sind, sind die angesetzten Lösungen der Testreagentien in der Regel nur kurze Zeit haltbar. Deshalb eignen sich die sogenannten Zehnerpackungen nur für größere Labors, bei denen immer mehrere gleichartige Diagnosetests innerhalb kurzer Zeit nacheinander durchgeführt werden können. Bei kleineren Labors und insbesondere beim Praktiker ist es häufig der Fall, daß nur einzelne Diagnosetests durchzuführen sind, wobei wegen der Eilbedürftigkeit und wegen der mangelenden Haltbarkeit der Körperflüssigkeit häufig nicht so lange gewartet werden kann, bis die für eine wirtschaftliche Durchführung der Untersuchung erforderliche Anzahl an Einzeltests zusammengekommen ist. Man ist deshalb darauf angewiesen, eine Zehnerpackung auch dann schon anzubrechen, wenn nur wenige Einzeluntersuchungen durchgeführt werden, was dazu führt, daß der Rest der Testsubstanzen verworfen werden muß. Bei einzelnen Reagentien, bei denen eine quantitative Einwaage bzw. das Einpipettieren eines bestimmten Volumens nicht erforderlich ist, wird gelegentlich auch nur ein kleiner Teil der Zehnerpackung angesetzt, der dann aber in der Regel, bezogen auf den einzelnen Test, einen erheblichen Überschuß und damit immer noch eine Verschwendung darstellt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die dosierte Zugabe von Reagentien bei der Durchführung eines Verfahrens zur Lipoproteinbestimmung zu erleichtern und gleichzeitig die bisher unvermeidlichen Verluste an Testreagentien zu vermeiden.

Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens aus einem Stück porösen Papiers besteht, welches mit farblosem Tetrazoliumsalz und Phenazin methosulfat imprägniert ist, und das in seiner Größe so bemessen ist, daß die aufimprägnierlen Substanzmengen den für die Durchführung einer Bestimmung gewünschten Einwaagen entsprechen.

Aufgrund der Erfindung ist es nunmehr möglich, zumindest teure oder sehr empfindliche Substar.zen für die Lipoproteinbestimmung in Einzel- oder Mehrfachpackungen anzubieten, in denen die für die Durchführung eines Einzeltests erforderlichen Einwaagemengen der einzelnen Substanzen bereits in räumlich getrennter Form vorliegen, wobei die Verwendung des Papiers als Trägermaterial eine leichte Handhabung der an sich sehr geringen Substanzmengen ermöglicht. Dadurch, daß die einzelnen Reagentien in fester Form in dem damit imprägnierten Papier vorliegen, entspricht die Haltbarkeit der einzelnen Packung derjenigen der trockenen Substanzen.

Bei Verwendung von porösem Papier guter Qualität, also einem Papier, das nicht zum Zerfasern neigt, wird eine gute Einwaage-Konstanz gewährleistet, so daß das jeweilige Papierstückchen von vorbestimmter Größe als quantitative Einwaage dient. Durch die Zugabe des Reagens in Form eines Papierstückchens bestimmter Größe kann der erforderliche Überschuß an den Reagentien in vernünftigen Grenzen gehalten werden, so daß hier unnötige Substanzveriuste vermieden werden.

Das Auftrocknen der einzelnen Substanzen auf das Filterpapier kann in der Weise erfolgen, wie es bei den bekannten Indikatorpapieren der Fall ist, wobei in entsprechender Weise auf Luft-, Feuchtigkeit- und Lichtempfindlichkeit des einzelnen Reagens Rücksicht genommen wird.

Das Reagens kann durch Aufdrucke, Farbgebung, Papierform und/oder durch bestimmte Symbole auf dem Papier gekennzeichnet werden.

Man wählt vorzugsweise eine Papierform der Papierstückchen bzw. Plättchen, die sich ohne Abfall aus einem größeren Papierbogen bzw. Streifen herstellen läßt. Im übrigen kann die Gestalt der Papierstücken beliebig gewählt werden. Die Größe des Papierplättchens hängt im wesentlichen von der Substanzmenge ab. die beim Test zum Einsatz kommt und damit auch von der gewünschten Konzentration der Reagentien in der Lösung. Zweckmäßige und leicht handhabbare Papie^rgrößcn liegen im Bereich zwischen ca. 10 und 150 Quadratmillimeter, wobei bei Ansetzen mit größerem Flüssigkeitsvolumen bei der Durchführung der Bestimmungsmethode natürlich auch größere Papierstücke eingesetzt werden können. Die Papierstärke kann im Bereich der Stärke von normalem Filterpapier guter Qualität gehalten werden. Es können aber auch dickere Filterpapier? ^Tur Anwendung kommen.

Die Erfindung wird durch die folgende Beschreibung eines Beispiels näher erläutert.

Beispiel

Ein Papierstreifen von guter Filterpapierqualität wird in eine wäßrige Lösung getaucht, die oxydiertes farbloses Tetrazoliumsalz (Tetranitro-blau) und Phenazinmethosulfat in gesättigter Konzentration enthält. Man läßt kurz abtropfen und trocknet im Exsiccator

über einem geeigneten Trocknungsmittel. Nach dem Trocknen werden aus dem Papier runde Scheibchen mit einem Durchmesser von ca. 5 Millimeter ausgestanzt.

In ähnlicher Weise imprägniert man Filterpapier mit einer gesättigten Lösung von NADH. Nach dem Trocknen werden Rechtecke mit einer Grundfläche von 20 QuadratmiUimeter ausgeschnitten. Die Rechteckform wurde gewählt, um gegenüber den runden Plättchen leicht unterscheiden zu können und eine abfallfreie Teilung des Filterpapiers zu erhalten.

Die trockenen Plättchen werden getrennt voneinander in bestimmten Mengeneinheiten verpackt und entsprechend der Empfindlichkeit der einzelnen Reagentien aufbewahrt.

0,2 Milliliter Patientenserum, das nicht älter als 24 Stunden ist, werden nun zunächst mit einem runden Plättchen versetzt, das den Tetrazoliumleukofarbstoff und den Elektronenüberträger enthält. Man schüttelt einige Zeit, um die beiden Substanzen aus dem Papier in Lösung zu bringen. Nunmehr gibt man ein rechteckiges Plättchen hinzu und schüttelt ebenfalls. Dabei färbt sich das Serum dunkelblau bis graphitschwarz. Man läßt noch ca. 10 Minuten stehen und trägt das Serum dann in geeigneter Weise auf einen entsprechend vorbereiteten Objektträger für die Elektrophorese auf.

Die Elektrophorese wird über einen Zeitraum von 20 bis 30 Minuten durchgeführt, wobei mit einer Stromstärke von 4 m/A pro Objektträger gearbeitet wird.

Bei der Reduktion des Leukofarbstoffs wurde ein lipophiler Farbstoff gebildet, der sich direkt an die Lipoproteine anlagerte. Dadurch, daß der Farbstoff in Gegenwart der Lipoproteine gebildet wird, ist die Einfäroung der Lipoproteine sehr intensiv und beständig. Die mit den Filterpapierstückchen eingebrachte Substanzmenge reicht aus, um die im Serum vorhandenen Lipoproteine vollständig anzufärben, wobei ein im Serum verbliebener Farbüberschuß sich bei der Elektrophorese nicht nachteilig auswirkt. Die einzelnen Lipoproteine werden während der Elektrophorese aufgetrennt, wobei sie als farbige Streifen wandern. Nach Beendigung der Elektrophorese kann direkt mit der Auswertung begonnen werden, was makroskopisch oder densitometrisch mit einem Elektrophoreseschreiber erfolgen kann. Eine besondere nachträgliche Fixierung ist nicht erforderlich.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Reagens zur insbesondere balbquantitativen und quantitativen Bestimmung von in Körperflüssigkeiten enthaltenen Lipoproteinen, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem Stück porösen Papiers besteht, welches mit farblosem Tetrazoliumsalz und Phenazinmethosulfat imprägniert ist, und das in seiner Größe so bemessen ist, daß die aufimprägnierten Substanzmengen den für die Durchführung einer Bestimmung gewünschten Einwaagen entsprechen.