DE2432760A1

DE2432760A1 - Teststreifen zum nachweis von homocystin und cystin

Info

Publication number: DE2432760A1
Application number: DE2432760A
Authority: DE
Inventors: Yasunao Ogawa; Yukio Yonetani
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1973-10-18
Filing date: 1974-07-08
Publication date: 1975-04-24
Also published as: AU7053174A; FR2248508A1; NL7410507A; ES427745A1; SE397732B; DK332374A; GB1435877A; SE7408131L; BE816925A; CA1021673A; FR2248508B1; IT1016772B; CH588698A5; JPS5068189A; NO742322L; JPS5246838B2

Description

243276Q

u.Z.: K 879 (Vo/Mü/kä)
Case: F 2247 YKI

SHIONOGI & CO., LTD.
Osaka, Japan

" Teststreifen zum Nachweis von Homocystin und Cystin " Priorität: <I8. Oktober 1973, Japan, Nr. 117 111/73

Die Erfindung betrifft Teststreifen zum Nachweis von Homocystin und Cystin, insbesondere zur Diagnose von Hoinocystinurie und Cystinurie. Ferner betrifft die Erfindung eine Testkombination zum Nachweis dieser Stoffwechselstörungen.

Das Auftreten von Homocystin und Cystin in Körperflüssigkeiten, insbesondere im Urin, ist ein Anzeichen von Homocystinurie und Cystinurie, angeborenen Störungen im Aminosäurestoffwechsel, die auf das Fehlen der Cystathioninsynthethase im Gehirn oder der Leber zurückzuführen sind. Bei Patienten mit Homocystinurie läßt sich der normale Methioninstoffwechsel zu Homocystin, Cystathionin und Cystin nicht feststellen. Die Methionin- und Homocystinkonzentrationen im Blut steigen an. Infolgedessen werden diese Aminosäuren mit dem Urin ausgeschieden. Der Nachweis von Homocystin in Körperflüssigkeiten, wie Urin, Plasma oder Serum, ermöglicht"daher eine Homocystinuriediagnose. Homocystinurie läßt sich oft bei Neugeborenen und kleinen Kindern fest- _j

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stellen. Nach der Phenylketonurie ist sie die häufigste Stoffwechselerkrankung. Bei Homocystinurie treten Störungen des Zentralnervensystems, Störungen der Linsen, Herzgefäßstörungen und Thrombosen auf.

Bisher sind im Handel keine Teststreifen zum Nachweis von Homocystinurie und Cystinurie erhältlich. Beim Nachweis im Laboratorium wird das Homocystin im Urin mit Natriumcyanid zu Homocystein reduziert und anschließend mit Natriumnitroprussiat. umgesetzt. Da jedoch Natriumcyanid hochgiftig ist, läßt sich dieses Verfahren in der Praxis nicht mit Teststreifen ausführen. Daher sind die bisher für diesen Nachweis zur Verfügung gestellten Teststreifen nur begrenzt einsatzfähig.

Aufgabe der Erfindung ist es, Teststreifen zum raschen und einfachen Nachweis von Homocystinurie oder Cystinurie zu schaffen, bei denen kein toxisches Reduktionsmittel verwendet wird und die infolgedessen in der Praxis eingesetzt werden können.

Gegenstand der Erfindung sind Teststreifen zum Nachweis von Homocystin und Cystin, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie ein adsorbierendes Material, ein Nitroprussiat salz und ein Sulfit, Hydrogensulfit, Hyposulfit, Pyrosulfit oder eine entsprechende Säure dieser Salze als Reduktionsmittel und gegebenenfalls einen Chelatbildner und/oder einen Farbstoff enthalten.

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■ Die Teststreifen der Erfindung enthalten kein stark toxisches Reduktionsmittel. Außerdem weisen sie folgende Vorteile auf:

(1) Ihre Empfindlichkeit gegenüber Homocystin und Cystin ist groß.

(2) Beim Test ergibt sich eine deutlich erkennbare und stabile Färbung (rot bis purpurstichig-rot).

(3) Die bei der Reaktion gebildete Färbung neigt nicht zum raschen Verblassen.

(4) Ein halbquantitativer Nachweis von Homocystin und Cystin ist leicht möglich.

(5) Dieser Nachweis ist auch an mit Urin befeuchteten Windeln möglich.

Aus den vorstehenden Gründen finden die Teststreifen der Erfindung einen breiten Anwendungsbereich zum klinischen und biologischen Nachweis von Homocystin und Cystin. Insbesondere sind sie zur frühen Diagnose von Homocystinurie oder Cystinurie geeignet.

Zur Herstellung der Teststreifen der Erfindung wird zuerst ein . Nitroprussiatsalz gegebenenfalls zusammen mit einem Chelatbildner in einer alkalischen Lösung gelöst. Anschließend wird ein

Textilgewebe adsorbierendes Material, wie Papier, / oder Holzstäbchen in die Lösung getaucht. Sodann wird an der Luft oder unter vermindertem Druck getrocknet. Gegebenenfalls wird das adsorbierende Material anschließend in eine Farbstofflösung getaucht und wieder getrocknet. Sodann taucht man das adsorbierende Material in eine Lösung eines Reduktionsmittels. Als Reduktionsmittel werden Sulfite, Hydrogensulfite, Hyposulfite, Pyrosulfite und

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Säuren dieser Salze verwendet. Nach dem Trocknen erhält man die gewünschten Teststreifen zum Nachweis von Homocystinurie und Cystinurie. Eine andere Möglichkeit zur Herstellung der Teststreifen der Erfindung besteht darin, das adsorbierende Material in eine Lösung, die alle notwendigen Bestandteile gleichzeitig erhält, zu tauchen. Die Reihenfolge der Zugabe der einzelnen Bestandteile spielt keine wesentliche Rolle. Zur Stabilisierung der aktiven Bestandteile kann die Imprägnierlösung mit einem grenzflächenaktiven Mittel, wie Polyäthylenglykol 4000, versetzt werden.

Wie bereits erwähnt, leiten sich die als Reduktionsmittel verwendeten Salze von der schwefligen Säure, der hyposchwefligen Säure oder pyroschwefligen Säure ab. Beispiele für diese Salze sind anorganische Salze, insbesondere Alkalimetallsalze, wie Natrium- oder Kaliumsalze. Typische Beispiele für diese Reduktionsmittel sind Natriumsulfit, Natriumhyposulfit, Kaliumpyrosulfit und schweflige Säure. Aufgrund ihrer Reduktionskraft und ihrer Empfindlichkeit bei der Farbreaktion sind Sulfite besonders bevorzugt. Das Reduktionsmittel kann in Form einer 0,5 bis lOprozentigen, vorzugsweise etwa 5prozentigen wäßrigen Lösung verwendet werden.

Bevorzugte Nitroprussiate sind anorganische Nitroprussiate, insbesondere Alkalimetallsalze, wie Natriumnitroprussiat oder Kaliumnitroprussiat. Vorzugsweise werden die Nitroprussiate in wäßriger Lösung eingesetzt, im allgemeinen in einer Konzentration von 0,2 bis 20 Prozent, insbesondere etwa 5 Prozent.

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Spezielle Beispiele für Chelatbildner, die zur Herstellung der Teststreifen der Erfindung verwendet werden können, sind Äthylendiamintetraessigsäure, Nitrilotriessigsäure, 1,2-Cyclohexandiamintetraessigsäure, Glykolätherdiamintetraessigsäure, Diäthylentriaminpentaessigsäure, Triäthanolamin, Diäthanolamin, Diacetylmonoxim und anorganische Salze dieser Verbindungen, wie Alkalimetallsalze, z.B. Natrium- oder Kaliumsalze. Bevorzugt werden Äthylendiamintetraessigsäure und ihre Alkalimetallsalze verwendet. Die bevorzugte Konzentration des Chelatbildners beträgt im allgemeinen 0,1 bis 10 Prozent, insbesondere etwa 5 Prozent. Mit dem Teststreifen der Erfindung werden S~-Ionen nachgewiesen, die nach Reduktion von Homocystin und Cystin zu Homocystein und Cystein gebildet werden. Es wird angenommen, daß die Gegenwart von Metallionen, beispielsweise Kupfer- oder Eisenionen, in den Körperflüssigkeiten, wie Urin, Plasma oder Serum, die Farbreaktion stören, v/obei Homocystein und Cystein in Gegenwart dieser Metallkatalysatoren katalytisch zu Homocystin und Cystin oxidiert werden. Da die Teststreifen der Erfindung jedoch zusätzlich einen Chelatbildner enthalten, ist gewährleistet, daß die Farbreaktion rasch eintritt und die gebildete Farbe nicht rasch verschwindet. Die Chelatbildner bewirken also, daß die die genannte Oxidation katalysierenden Metallionen maskiert werden, die Farbreaktion beschleunigt und das Verblassen der gebildeten Farbe verzögert wird.

Die gegebenenfalls im Teststreifen der Erfindung vorhandenen Farbstoffe beeinträchtigen die Farbreaktion nicht. Sie werden zugesetzt, um eine Farbänderung des Teststreifens während einer

langen Lagerung zu verhindern, bzw. um eine klarere Unterschei-L -¹

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dung zwischen einer roten oder rotstichig purpurfarbenen Färbung zu ermöglichen, wenn Homocystin oder Cystin in den Körper-· flüssigkeiten vorhanden sind. Vorzugsweise werden blaue und . grüne bzw. blaugrüne Farbstoffe verwendet, wie Methylenblau, Malachitgrün und Food Blue Nr.1. Diese Farbstoffe werden im allgemeinen in einer Konzentration von 0,01 bis 0,001 Prozent verwendet.

Als Adsorptionsmaterial, das in die Lösung, die die aktiven Bestandteile und die notwendigen Zusätze enthält, eingetaucht

Textilgewebe
wird, können Papier, / oder Holzstäbchen verwendet werden. Beispiele für Papier sind Filterpapier, Löschpapier, Adsorptionspapier, wie Kieselgelpapier oder Aluminiumoxidpapier, Ionenaustauschercellulosepapier, beispielsweise auf der Basis von Phosphonomethylcellulose, Sulfoäthylcellulose, Phosphorcellulose, Carboxymethylcellulose, GuaiLdinoäthylcellulose, Diäthylaminoäthylcellulose, Aminoäthylcellulose, Ecteolacellulose, p-Aminobenzylcellulose oder Polyäthylenimincellulose, Ionenaustauscherpapier auf der Basis von modifiziertem, dreidimensio-

(Sephadex)

nal vernetztem Dextran/und Ionenaustauscherpapier auf der Basis von Kunstharzen. Vorzugsweise werden Papiere auf der Basis von Ionenaustauschercellulose und insbesondere auf der Basis von Diäthylaminoäthylcellulose verwendet. Die Form des Adsorptionsmaterials ist nicht kritisch, aber im allgemeinen wird es in Streifenform eingesetzt.

Im allgemeinen bestehen die Lösungen, die die aktiven Bestandteile und die Zusätze enthalten, aus wäßrigen Lösungen. Die Nitroprussiatlösung wird im allgemeinen mit einer alkalischen

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Verbindung oder einem Puffer auf einen alkalischen pH-Wert, vorzugsweise im Bereich 9,5 bis iQ 5 eingestellt. Anstelle von Wasser können auch Methanol, Äthanol, Aceton, Diäthyläther, Dimethylsulfoxid und Gemische dieser Lösungsmittel mit Wasser verwendet werden. Bei Verwendung eines wäßrigen organischen Lösungsmittels wird das Reagens homogen vom adsorbierenden Material adsorbiert. Ein weiterer Vorteil dieser Lösungsmittelgemische besteht darin, daß die Trocknung der Teststreifen erleichtert wird und eine einheitliche Färbung bei der Farbreaktion erhalten wird.

Erfindungsgemäß kann auch die die aktiven Bestandteile und die notwendigen Zusätze enthaltende Lösung selbst zum Nachweis von Homocystin und Cystin verwendet werden, indem man sie mit einer Probe einer Körperflüssigkeit, wie Urin, Plasma oder Serum, versetzt und die Farbänderung beobachtet. Vorzugsweise wird jedoch anstelle der Imprägnierlösung selbst ein Präparat in fester Form verwendet, da es leichter zu handhaben und stabiler ist. Feste Präparate, wie Tabletten, Granulate, Pillen oder Pulver, die die notwendigen Bestandteile enthalten, können auf übliche Weise hergestellt werden. Bei der Herstellung dieser Präparate können geeignete Zusatzstoffe, wie Trägerstoffe, Sprengmittel, Dispersionsmittel und Bindemittel zugegeben werden, ohne daß der Erfindungsbereich verlassen wird. Die Farbänderung ist nur nachzuweisen, wenn man diese festen Präparate in Körperflüssigkeiten, die Homocystin oder Cystin enthalten/, auflöst. Man kann diese Farbreaktion auch so erhalten, indem man eine ein Nitroprussiat enthaltende Tablette und eine ein Reduktionsmittel enthaltende Tablette, die mit einem Überzug versehen ist, der die _j

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Oxidation des Reagens verhindert, in einer Probe einer Körperflüssigkeit zusammen auflöst. In diesem Fall sind die Tabletten im allgemeinen getrennt voneinander verpackt.

Ferner können erfindungsgemäß auch Teststrei fen, die ein Nitroprussiat, gegebenenfalls zusammen mit einem Chelatbildner und/oder einem Farbstoff enthalten, eingesetzt werden, nachdem das in den Körperflüssigkeiten vorhandene Homocystin und Cystin mit einem der vorgenannten Reduktionsmittel bzw. mit einem anderen geeigneten Reduktionsmittel reduziert worden ist.

Im allgemeinen^ werden die Teststreifen der Erfindung verwendet, indem man sie in eine Probe eintaucht oder mit der Probe imprägniert, wobei eine Farbänderung auftritt. Homocystinurie läßt sich auch nachweisen, indem man eine mit dem Urin eines neugeborenen Kindes befeuchtete Windel in Kontakt mit dem Teststreifen bringt. Bei der Untersuchung von Plasma oder Serum kann der Teststreifen auf die gleiche Weise angewendet werden. Gegebenenfalls kann der Teststreifen auch an einer Kunststoffolie angebracht werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispieli

1 g Dinatriumsalz der Äthylendiamintetraessigsäure werden zu 20 ml einer 5prozentigen wäßrigen Lösung von. Natriumnitroprussiat gegeben. Das Gemisch wird mit 4 η Natriumhydroxidlösung auf den pH-Wert 10 eingestellt. Sodann wird ein Stück Diäthylaminoäthylcellulosepapier DE-81 (Whatman Co.) der Abmessungen

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5 χ 1.5 cm bei Raumtemperatur in die Lösung eingetaucht. Das überschüssige Reagens wird anschließend mit Filterpapier entfernt. Der Teststreifen wird getrocknet, in 10 ml einer 0,001prozentigen wäßrigen Lösung von Methylenblau eingetaucht und sodann an der Luft getrocknet. Der getrocknete Teststreifen wird in 10 ml einer lOprozentigen wäßrigen Lösung von Natriumsulfit eingetaucht. Nach dem Entfernen des überschüssigen Reagens mit Filterpapier wird der Streifen wieder getrocknet. Anschließend befestigt man den Streifen an einer Kunststoffolie und schneidet ihn in Stücke der Abmessungen 5x1 cm. Diese Streifen werden unabhängig voneinander in Urinproben mit verschiedener Homocystinkonzentration eingetaucht. Man gelangt zu folgenden Ergebnissen:

Homocystinkonzentration, · (mg/100 ml)	Farbsättigung
0	gelblich orange (5 YR 9/2)
10	rot (5 R 9/3)
20	rot (5 R 8/4)
50	rotstichig purpurfarben (2,5 RP 6/8)
100	rotstichig purpurfarben (2,5 RP 6/10)

Anmerkung:

Die Farbe wird 30 Sekunden nach dem Eintauchen in die zu unter suchende Probe bestimmt Die Farbsättigung wird gemäß den Standard Colour Chip (JIS (Japanese Industrial Standard) Z 8721-1964) angegeben. Mit dem auf die vorbeschriebene Weise hergestellten Teststreifen läßt sich Homocystin in einer Konzentration von mehr als 5 mg/100 ml nachweisen.

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Beispiel 2

1 g Dinatriumsalz der Äthylendiamintetraessigsäure wird zu 20 ml einer 5prozentigen wäßrigen Natriumnitroprussiatlösung gegeben. Die Lösung wird mit 4 η Natriumhydroxidlösung auf den pH-Wert 10,5 eingestellt. Anschließend wird ein Stück Diäthylaminoäthylcellulosepapier SG-81 (Whatman Co.) der Abmessungen 5 x 5 cm in die Lösung getaucht und sodann getrocknet. Hieraufwird das Papier in eine 5prozentige wäßrige Natriumsulfitlösung getaucht und im dunklen unter vermindertem Druck getrocknet. Der erhaltene Teststreifen wird in Gegenwart von Urin, der mehr als 10 mg/100 ml Cystin enthält rot bis rotstichig purpurfar- , ben.

Beispiel 3

20 ml einer 5prozentigen wäßrigen Natriumnitroprussiatlösung werden mit einer 4 η Natriumhydroxidlösung auf den pH-Wert 10,5 eingestellt. Sodann wird ein Stück Silikagelpapier

der Abmessungen 5 x 6 cm

M3F 8860 (Schleicher & Schüll Co.)/in die Lösung getaucht und sodann an der Luft getrocknet. Hierauf wird das Papier in eine 5prozentige wäßrige Natriumsulfitlösung eingetaucht und im Dunklen unter vermindertem Druck getrocknet.

Beispiel 4

ν Unter Verwendung von Filterpapier (Toyo Filterpapier Nr. 13I) anstelle von Diäthylaminoäthylcellulosepapier erhält man gemäß Beispiel 1 einen Teststreifen.

L ■ _ .J

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Γ - 11 -

Beispiel 5

Unter Verwendung von schwefliger Säure, Natriumbisulfit, Natriumhyposulfit oder Kaliumpyrosulfit anstelle von Natriumsulfit erhält man gemäß Beispiel 1 Teststreifen.

Beispiel 6

0,3 g Natriumnitroprussiat und 1 g Dinatriumsalz der Äthylen- diamintetraessigsäure (Dihydrat) werden in 20 ml Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit 4 η Natriumhydroxidlösung auf den pH-Wert 10,5 eingestellt. Sodann werden 2 g wasserfreies Natriumsulfit in dieser Lösung gelöst und 0,1 ml , Food Blue Nr.1. (250 mg/100 ml) werden zugegeben. In die erhaltene Lösung wird ein Streifen von Diäthylaminoäthylcellulosepapier (Whatman Co.) der Abmessungen 15 x 46 cm eingetaucht und hierauf 60 Minuten bei 40 bis 43⁰C und 10 bis 15 Torr getrocknet. Der getrocknete Streifen wird auf einer Kunststoffolie befestigt und in Streifen mit kleineren Abmessungen zerschnitten.

Beispiel 7

0,3 g Natriumnitroprussiat und 1 g Dinatriumsalz der Äthylendiamintetraessigsäure (Dihydrat) werden in 20 ml Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit 4 η Natriumhydroxidlösung auf den pH-Wert 10,5 eingestellt. Hierauf werden 2 g wasserfreies Natriumsulfit und 2 g Polyäthylenglykol 4000 in dieser Lösung gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit 0,1 ml Food Blue Nr. 1 (250 mg/100 ml) versetzt. Sodann verfährt man gemäß Beispiel 6 und erhält den gewünschten Teststreifen.

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Claims

Patentansprüche

1.) Teststreifen zum Nachweis von Homocystin und Cystin,

dadurch gekennzeichnet, daß sie ein adsorbierendes Material, ein Nitroprussiatsalz und ein Sulfit, Hydrogensulfit, Hyposulfit, Pyrosulfit oder eine entsprechende Säure dieser Salze als Reduktionsmittel und gegebenenfalls einen ■ Chelatbildner und/oder einen Farbstoff enthalten.

2. Teststreifen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Reduktionsmittel Natriumsulfit, Natriumhydrogensulfit, Natriumhyposulfit, Kaliumpyrosulfit oder schweflige Säure enthalten.

3. Teststreifen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Nitroprussiatsalz Natriumnitroprussiat oder Kaliumnitroprussiat enthalten.

4. Teststreifen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Chelatbildner Äthylendiamintetraessigsäure, Nitrilotriessigsäure, 1,2-Cyclohexandia'mintetraessigsäure, Glykolätherdiamintetraessigsäurej, Diäthylentriaminpentaessigsäure, Triäthanolamin, Diäthanolamin, Diacetylmonoxim oder Alkalimetallsalze dieser Verbindungen enthalten.

5. Teststreifen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Farbstoff Methylenblau, Malachitgrün oder Food Blue Nr.1 enthalten.

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6. -Testkombination zum Nachweis von Homocystin oder Cystin, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Nitroprussiatsalz und ein Sulfit, Hydrogensulfit, Hyposulfit, Pyrosulfit oder eine entsprechende Säure dieser Salze als Reduktionsmittel und gegebenenfalls einen Chelatbildner und/oder einen Farbstoff enthält.

7. Testkombination nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Reduktionsmittel gemäß Anspruch 2 enthält.

8. Testkombination nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Nitroprussiatsalz gemäß Anspruch 3 enthält.

9. Testkombination nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Chelatbildner nach Anspruch 4 enthält.

10. Testkombination nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Farbstoff gemäß Anspruch 6 enthält.

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