DE2417642A1 - Verfahren zur enzymatischen isomerisierung von glucose zu fructose - Google Patents

Verfahren zur enzymatischen isomerisierung von glucose zu fructose

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Description

risierung von Glucose zu Fructose
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glucose zu Fructose, d.h. ein Verfahren solcher Art, bei denen die Eigenschaften der Enzyme, die durch bestimmte Mikroorganismen erzeugt werden, wenn sie in einem Xylose enthaltendem Medium gezüchtet werden, es diesen Mikroorganismen erlauben, Glucose zu Fructose zuisomerisieren, wenn sie mit Glucose kontaktiert werden.
Es ist bekannt, daß bestimmte Mikroorganismen, die den Familien Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus und Streptomyces · angehören, in der Lage sind, die vorstehenden Isomerisierungsenzyme zu erzeugen.
Es ist ebenfalls bekannt, daß die Mehrzahl der Mikroorganismen, von denen die Rede sein wird, trotz der Tatsache, daß sie dazu befähigt sind, Enzyme zu produzieren, die Glucose isome-
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risieren, schwerwiegende.Nachteile aufweist, wie insbesondere Schwierigkeiten bei der Filtration nach der Isomerisierung und bei der Reinigung der erhaltenen isomerisierten Sirupe, auf Grund der Anwesenheit von kolloidalen Substanzen, die Trübung oder Färbungen (Pigmente, die durch den Mikroorganismus abgesondert werden und die nicht vollständig vom Mycelium bei seinem Waschen entfernt werden) hervorrufen.
Die vorstehenden bekannten Mikroorganismen besitzen auch andere Nachteile, wie Schwierigkeiten bei der Rückgewinnung des Myceliums bzw. Mycels am Ende eines Isomerisierungszyklus, schnellen Abbau der enzymatischen Aktivität des genannten Myceliums, was verhindert, daß es durch Rezyklisierung auf eine Mehrzahl aufeinanderfolgender Chargen aus zu isomerisierendem Glucosesirup einwirkt.
Es wurde nunmehr in überraschender Weise ein besonderer Mikroorganismus gefunden, und zwar ein Stamm der Gattung Strep tomyces violaceoniger, der nicht nur in der.Lage ist, ein Enzym zur Isomerisierung von Glucose zu Fructose zu erzeugen, sondern auch zusätzlich die vorstehenden Nachteile nicht mehr aufweist.
Dieser Mikroorganismus, dessen Zuordnungseigenschaften nachstehend beschrieben werden, wurde beim Centralbureau voor Schimmel Cultures de Baarn (Niederlande) unter der Nr. CBS 409-73 hinterlegt.
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glucose zu Fructose, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Isomerisierungsenzym erzeugenden Mikroorganismus einen Stamm von Streptomyces violaceoniger, hinterlegt beim Centralbureau voor Schimmel Cultures de Baarn (Niederlande) unter der Nr. CBS 409-73, oder Mutanten davon einsetzt.
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Weitere Charakteristika des Verfahrens gehen aus der nachstehenden Beschreibung hervor, die durch die Beispiele und die entsprechenden Figuren, die sich, auf vorteilhafte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beziehen, veranschaulicht werden.
In den beigefügten Figuren beziehen sich die Fig. 1, 2 und 3 auf das Beispiel 1 und zeigen die Entwicklung einerseits des ρ -Werts (Kurve C^,, Fig. 1), andererseits der Menge Q der im Milieu anwesenden reduzierenden Zucker, ausgedrückt in g/l, (Kurve C~, Fig. 2) und weiterhin des Ver-
V
hältnisses _1_ des Volumens V^ des Mikroorganismus zum Vo-
lumen V2 der Kultur (Kurve C3, Fig. 3) in Abhängigkeit von der Zeit t, ausgedrückt in Stunden, und
die Fig. 4 bezieht sich ebenfalls auf das Beispiel 1 und zeigt die Entwicklung des absoluten'Drehwerts αβ, ausgedrückt in Grad,(Kurve C-) und des wahren Fructosegehaltes des Milieus, ausgedrückt in %, (Kurve C1-) in Abhängigkeit von der Zeit t, ausgedrückt in Stunden.
Der erfindungsgemäß eingesetzte Stamm von Streptomyces violaceoniger wird unter aeroben Bedingungen in untergetauchter Kultur in einem die geeigneten Nährstoffe sowie Xylose und Kohlehydrat enthaltenden Milieu gezüchtet. Das so gebildete Mycelium wird gesammelt und kann bei Glucosesirupen eingesetzt werden. . '
Die Kulturmedien, die zur Herstellung eines Myceliums von Streptomyces violaceoniger, das gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann, verwendet werden, enthalten 5 bis 15 g Xylose pro 1 sowie 5 bis 50 g Stickstoffverbindungen pro 1, wie z.B. Soja, Maiswasser, Rückstände des Vegetationswasser von Kartoffeln und Hefeextrakte.
Die ρ,,-, Temperatur- und Zeitdauer-Bedingungen dieser Kultur bzw. Züchtung sind im übrigen:
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5,0 <^p„ ζ 8,5, vorzugsweise 5,5 <( PH ^7,5, 2-5°C < t < 40°C, vorzugsweise 30°C < £ < 35°C, Zeitdauer 24 bis 48 Stunden.
Es zeigte sich, daß dieses Verfahren der Kultur es ermöglicht, unter diesen Bedingungen ein leicht filtrierbares ausgiebiges Mycelium bzw. ein leicht filtrierbares Mycelium im Überfluß zu erhalten, das eine gute Isomierisierungsaktivität auf<weist.
Im "Hinblick auf seinen Einsatz an einem Glucosesirup filtriert man das so erhaltene Mycelium, wäscht es durch Versprühen bzw. Pulvrisation mit Wasser und sammelt es in Pastenform. Es kann in dieser Form in der Kälte (im allgemeinen bei einer Temperatur in der Größenordnung von -20 C) aufbewahrt werden oder durch Lyophilisierung getrocknet werden, wodurch seine Aufbewahrung ebenfalls ermöglicht wird, jedoch verwendet man es im allgemeinen sofort, indem man es in dem zu isomerisierenden Sirup dispergiert.
Das filtrierte Mycelium wird gewaschen und unter den folgenden allgemeinen Isomerisierungsbedingungen eingesetzt:
Temperatur: 50 bis 75°C
p„: 6 bis 8
Konzentration des Milieus an "Glucosiden": 25 bis 60 %
CoCl2: 0,0 bis 0,50 g/l MgSO4: 0,0 bis 2,4 g/l
Die Zeitdauer hängt von den Bedingungen und der Menge des eingesetzten Myceliums ab.
Es hat sich gezeigt, daß die Umwandlungsausbeuten von Glucose zu Fructose durch Einsatz des erfindungsgemäßen Mikroorganismus für eine Mycelium-Menge bzw.—Konzentration von 1 Volumen
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Kulturbrühe auf 1 Volumen einer 50%-igen Dextroselösung innerhalb 24 Stunden in der Größenordnung 'von 45 % liegt.
Die Klassifizierungseigenschaften bzw. die taxonomischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Stammes von Streptomyces violaceoniger sind wie folgt:
Aussehen der Sporen: kugelförmig^mit einer Dimension von 0,9bis 1,2 u und mit glatten oder wenig rauhen Wandungen;
Aussehen des aerialen Myceliums bzw. Luftmyceliums: Sporen tragend und bildend, graubräunlich, das sich zu schwarzen feuchten Flecken verflüssigt und das Verzweigungen von monopodialen Sporophoren bzw. Sporenträgern aufweist;
Aussehen der Spiralen: sie sind kurz, agglomeriert,' mit 1 oder2 Ranken (viticula);'
Aussehen des vegetativen Myceliums: es ist weißlich bis gelblich (bis.gemsfarben).
Es ist möglich, ein lösliches Pigment zu extrahieren, das schwachrosa ist und das in der abgerahmten Milch erzeugt wird.
Kultur auf einem "Eisen-Pepton-Agar"-Medium: keine melanoiden Pigmente (die auch bei der Kultur auf einem Tyrosin-Agar-Medium nicht auftreten).
Diastase-Aktivität: Agar +; Stärke + Proteolytische Aktivität: Milchkoagulation
gute Peptonisierung Gelatineverflüssigung
Durch den Stamm assimilierte Zucker: Saccharose
Inosit .
■ Rhamnose
Raffinose .
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Die Gesamtheit der vorstehenden Eigenschaften erlaubt es, zu bestätigen, daß der in Rede stehende-Stamm der Gattung Streptomyces violaceoniger (Kataloge Waksman & Curtis und Waksman & Henrici) angehört. Es wird jedoch darauf hingewiesen, daß das Kohlenstoff-Assimilätionsspektrum sich etwas unterscheidet.
Selbstverständlich umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren * den Einsatz von Mutanten des-genannten Stammes, die z.B. natürliche oder künstliche Mutanten sein können, weichletztere z.B. durch Bestrahlung mit Ultraviolettstrahlen oder durch Behandlung des Ausgangsstammes mit mutagenen Chemikalien, wie z.B. Nitrosoguanidin und Athylmethylsulfonat, erhalten werden können.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie einzuschränken.
Beispiel 1
a) Herstellung des Myceliums
In ein Fermentiergefäß von.20 1, das 15 1 Wasser enthält, bringt man 525 g Maiswasser mit 50 % Trockenextrakten, 1050 g Xylose und 15 g Magnesiumsulfat ein, wobei alles sterilisiert wird.
Man stellt den p„-Wert vor der Sterilisation mit Ammoniak auf 6,8 ein und gibt 10 g Maisöl hinzu, um ein übermäßiges Schäumen bzw. Sprudeln zu verhindern.
Nach einer 10-minütigen Sterilisation bei 120 C wird das Milieu mit 400 ml einer 48-stündigen Vorkultur von Streptomyces violaceoniger, das dem Stamm CBS 409-73 angehört, enthalten in einem Erlenmeyer-Kolben von 2 1, angeimpft.
Das Fermentiergefäß ist mit einem System zum mechanischen . Rühren, eingestellt auf 600 UpM, versehen, und die Belüftung ist auf 8 1 sterilisierte Luft pro Minute eingestellt«
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Die Kurven der Fig. 1, 2 und 3 zeigen die Entwicklung des p„-Werts (Fig. 1, Kurve C1), der Menge der anwesenden reduzierenden Zucker (Fig. 2, Kurve Cp) und des Mikroorganismus-Volumens pro Kultur-Volumen (Fig. 3, Kurve CU) in Abhängigkeit von der Zeit, wobei die letztere Größe durch die Höhe des Bodensatzes nach dem Zentrifugieren in einem graduierten Meßzylinder bzw. Reagensglas unter Standardbedingungen, d.h. 5000 UpM,während 10 Minuten gemessen wird.
Aus Fig. 3 ergibt sich, daß nach 24 Stunden Kultur die erhaltene Streptomyces-Menge ein Maximum erreicht und nicht mehr ansteigt.
Die 15 1 der Kultur werden auf einem Büchner-Filter, der mit einer Vorschicht aus Filtererde versehen ist, filtriert. Der gesammelte Streptomyces wird mit Trinkwasser gewaschen.
Man sammelt auf diese Weise ohne Schwierigkeiten 800 g feuchte Zellen auf.
b) Glucose-Isomerisierunq
Die vorstehend erhaltenen 800 g Streptomyces werden in 15 einer Dextroselösung mit 500 g/kg der Lösung, die Spuren von Magnesium-und Kobaltsalzen, nämlich 2,4 g/l MgSO. und 0,24 g/l CoCl2, enthält, suspendiert.
Der p„-Wert wird mit Hilfe einer Lösung von Natriumhydroxyd und Natriumsulfit auf 6,8 eingestellt, anschließend wird die Temperatur der Suspension auf 65°C gebracht und der p„ mit Hilfe eines automatischen p„-Meßgeräts auf dem Wert von 6,8 gehalten.
In der nachstehenden Tabelle I sind die fortschreitenden Werte des absoluten Drehwerts aD und des wahren Fructosegehalts des Mediums und des ρ in Abhängigkeit von der Zeit zu saramengefaßt.
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- 8 ~ Tabelle I
Isomerisierung einer 50%-igen Dextroselösung PH 6,8 ± 0,2· Temperatur: 65°C ± 1
Zeit in Stunden aD. % Fructose PH
2 + 40°5 8,5 6,9
■4 + 29°1 16,5 6,8
6 + 12°2 28,0 6,9
16 - /I3°1 45,5 7,0
20 - 15°2 47,5 7,1
Mit Hilfe der in Tabelle I zusammengefaßten Werte wurden die entsprechenden Kurven C4 (aß) und C5 (% Fructose) des Diagramms der Fig. 4 erstellt, was auf eine wesentliche Isomerisierungsaktivität schließen läßt, wobei innerhalb von Stunden Isomerisierungszeit 47,5 % Lävulose bzw. d-Fructose gebildet werden.
Beispiel 2
a) Herstellung des Myceliums
Die Herstellung erfolgte unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1, mit dem Unterschied, daß die Maiswasser durch 300 g Proteine ersetzt wurden, die der Ausflockung der Vegetationswasser von Kartoffeln entstammten, wobei der ρ -Wert immer mit Ammoniak auf 6,8 eingestellt wurde.
Nach 26-stündiger Fermentation (Rühren bei 600 UpM, Luftzufuhr 8 l/Min.) sammelt man nach der Filtration 750 g feuchte Zellen von Streptomyces violaceoniger.
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b) Isomerisierung von Glucose
Der vorstehend erhaltene Streptomyces-Kuchen wird in 15 1 einer 50-gewichtsprozentigen Dextroselösung unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen dispergiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.
Stunden 52
.+ 18
- 15		 Tabelle D II PH
°5
*1
*6		 6,8
7,0
6,9
Zeit in 3 % Fructose
O
5
21		 0
27,5
47,5
Beispiel
Dieses Beispiel veranschaulicht die Leichtigkeit der Filtration des Stamms und die Möglichkeit, ihn zu rezyklisieren.
a) Herstellung des Myceliums
Zwei Fermentierungsgefäße von 15 1 werden unter den in Beispiel 1 beschriebenen allgemeinen Bedingungen vorbereitet.
Die Maiswasser wurden durch ein proteolytisches Hydrolysat von Casein (1 % Casein, d.h. 150 g, wurden in einer ammoniakalischen Lösung durch die alkalische Protease während 8 Stunden hydrolysiert) ersetzt.
Nach 24-stündiger Fermentation und praktisch vollständigem Verschwinden von reduzierenden Substanzen erhält man nach 10-minütigem Zentrifugieren bei 5000 UpM ein Streptomyces-Volumen von 0,6 ccm/l0 ml Kultur.
Die Filtration dieser Kulturmedien ergibt 580 bzw. 560 g feuchte Streptomyces-Zellen.
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b) Isomerisierung mit Rezyklisierung des Enzyms
Man führt sieben aufeinanderfolgende Isomerisierungen an 15 1 einer 50%-igen Dextroselösung durch.
Die erste Isomerisierung wird mit 560 g Streptomyces-Zellen, die dem zweiten Fermentiergefäß entstammen, durchgeführt.
Die zweite Isomerisierung wird mit einer neuen Charge von 15 1 50%-igem Glucosesirup mit dem nach der Filtration des der 1. Operation entstammenden Reaktionsmediums wiedergewonnenen Streptomyces durchgeführt.
anderen Die Isomerisierungen 3, 4, 5 und 6 werden an/Chargen von 15 1 des Sirups durchgeführt, indem man dem Mycelium,das nach der Filtration aus der vorgangegangenen Operation wiedergewonnen wurde, 145 g frische Zellen aus dem Fermentiergefäß 1 zusetzte.
Eine 7. und letzte Isomerisierung wird ohne Zugabe von frischen Streptomyces-Zellen durchgeführt.
Die Ergebnisse dieser ganzen. Operationen sind in der nachstehenden Tabelle III zusammengefaßt.
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Tabelle III
Sieben aufeinanderfolgende Isomerisierungen, durchgeführt mit demselben Mycelium
1 1. O/ 2. V 3. Fruc 4. Fruc 5. . Fruc- 6'· ■ '% 7. Of
*·>
O 		Isomerisierung Fruc Isomerisierung Fruc Isomerisierung tose isomerisierung tose . Isomerisierung ; tose isomerisierung Fruc . Is-omeri sierung Fruc-
(O tose tose 28,5 tose ■ tose
Zeit 42,0 Zeit 33,0 Zeit Zeit Zeit Zeit Zeit
in • '
107 14 · 20 14 21 ,o :
ο Std. Std. Std. 42,5 42,0 42,5
39,0 40,0 20 .
Std.
27 i 38 27 38 45 • 41 ,0
Std. Std. Std. Std. Std. ■
68 ·
Std.
Dieses Vorgehen erlaubt es, 107 1 50%-igen Glukosesirups zu isomerisieren, wobei das Mycelium 30 1 Kulturbrühe entstammt, während es ohne Rezyklisierung notwendig wäre, das 107 1 Kulturbrühe entstammende Mycelium zu verwenden.
Des weiteren erlauben es die Zahlen der Tabelle III, festzustellen, daß, während der durchschnittliche Fructosegehalt der sieben Sirupe etwa 42 % betrug, die gute Beibehaltung der isomerisierenden Aktivität des Myceliums während seines ganzen Einsatzes klar bewiesen wurde.
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Claims (5)

Patentansprüche
1.) Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glucose zu Fructose, gekennzeichnet durch den Einsatz eines Stammes von Streptomyces violaceoniger als Isomerisierungsenzym erzeugenden Mikroorganismus, der die folgenden taxonomischen Eigenschaften bzw. Klassifizierungseigenschaften aufweist:
Aussehen der Sporen: kugelförmig, mit einer Dimension vonO,9 bis 1,2 μ und mit glatten oder wenig rauhen Wandungen; Aussehen des aerial en Myceliums bzw. Luftmyceliums: Sporen tragend und bildend, graubräunlich, das sich zu . schwarzen feuchten Flecken verflüssigt und das Verzweigugungen von monopodialen Sporophoren bzw. Sporenträgern aufweist.
Aussehen der Spiralen: sie sind kurz, agglomeriert, mit oder 2 Ranken (viticula);
Aussehen des vegetativen Myceliums: es ist weißlich bis gelblich (bis gemsfarben);
es ist möglich, ein lösliches Pigment zu extrahieren, das schwachrosa ist und das in der abgerahmten Milch erzeugt wird;
Kultur auf einem "Eisen-Pepton-Agar"-Medium: keine melanoiden Pigmente (die auch bei der Kultur auf einem Tyrosin-Agar-Medium nicht auftreten);
Diastase-Aktivität: Agar +; Stärke +; proteolytische Aktivität: Milchkoagulation
gute Peptonisierung Gelatineverflüssigung;
durch den Stamm assimilierte Zucker: Saccharose
Inosit
Rhamnose Raffinose
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- 14 oder eines.MutantenStammes dieses Stammes.
2.) Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glucose zu Fructose, gekennzeichnet durch den Einsatz eines Stammes von Streptornyces violaceoniger, eingetragen beim Centralbureau voor Schimmel Cultures de Baarn (Niederlande) unter der Nr. CBS 409-73, als Isomerisierungsenzym erzeugenden Mikroorganismus.
3.) Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mutantenstamm des beim Centralbureau voor Schimmel Cultures de Baarn (Niederlande), unter der Nr. CBS 409-73 hinterlegten verwendet.
4.) Verfahren zur Züchtung eines der Stämme von Streptomyces violaceoniger, die beim Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 verwendet werden, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm unter aeroben Bedingungen·in einem Kulturmedium, das 5 bis 15 g Xylose pro 1 sowie 5 bis 50 g stickstoffhaltige Substanzen, wie z.B. Soja, Maiswasser, Rückstände von Vegetationswasser von Kartoffeln und Hefeextrakte, pro 1 enthält, kultiviert wird, wobei die PH-» Temperatur- und Zeitdauer-Bedingungen die folgenden sind:
5, 0 ( ρ» < 8,5, vorzugsweise 5,5 < p„ < 7,5, 25°C < t <40°C, vorzugsweise 30°C < t < 35°C, Zeitdauer 24 bis 48 Stunden,
wobei das so erhaltene Mycelium nach der Filtration und dem Waschen in Pastenform gesammelt wird.
5.) Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glucose zu Fructose, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Stämme gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 unter den folgenden Bedingungen eingesetzt wird:
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Temperatur: 50 bis 75°C
pH: 6 bis 8 -
Konzentration des Milieus an Glucose : 25 bis 60 %
an CoCl2: O bis 0,50 g/l an MgSO4: 0 bis 2,4 g/l
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