DE2416842C2

DE2416842C2 -

Info

Publication number: DE2416842C2
Application number: DE2416842A
Authority: DE
Inventors: Sam Eggertsville N.Y. Us Rose
Original assignee: Bio-Response Inc Scarborough Ny Us
Current assignee: Bio-Response Inc Scarborough Ny Us
Priority date: 1973-04-09
Filing date: 1974-04-06
Publication date: 1987-10-08
Also published as: GB1471204A; FR2309635B1; FR2224134B1; JPS5913898B2; FR2309838B1; FR2309838A1; JPS5012226A; US4064006A; DE2416842A1; JPS5442073A; CA1041445A; CH624712A5; FR2224134A1; JPS5888324A; FR2309635A1; AU6769274A; FR2309282B1; GB2002266A; DE2835307A1; GB2002266B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro-Züchtung von Zellen. Die Erfindung betrifft weiter eine Zentrifuge zum Durchführen dieses Verfahrens.

Ein Verfahren zum Gewinnen von Antikörper-Produkten ist be kannt (US-PS 37 19 182). Das bekannte Verfahren läßt sich jedoch nur unter Mithilfe eines lebenden Organismus durch führen. Mit dem bekannten in vivo-Verfahren lassen sich als Heilmittel brauchbare Antikörper-Produkte gewinnen. Jedoch muß dem lebenden Organismus periodisch Lymphflüssigkeit abgezogen werden. Dies erhöht den Venendruck. Dem Organis mus wird jeweils Ersatzflüssigkeit zugeführt. Dennoch ist dieses Verfahren mit einer Schwächung der dafür eingesetz ten Organismen verbunden, ganz abgesehen davon, daß selbst verständlich eine genaue und sehr sorgfältige gesundheit liche Prüfung und Überwachung der für dieses Verfahren ein gesetzten Organismen erfolgen muß, was vergleichsweise auf wendig ist.

Andererseits sind Menge und Qualität des in vivo in der Lymphflüssigkeit erzeugten Antigen-Produktes sehr gut und auf den Gebieten der Biologie und Chemie, sowie der tier ärztlichen und klinischen Medizin vorteilhaft brauchbar.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Gewinnen von Antikörper-Produkten möglichst gleicher Qualität und Nützlichkeit ohne die Notwendigkeit der Mit hilfe lebender Organismen zu entwickeln.

Die Lösung für diese Aufgabe ergibt sich bei einem Ver fahren der eingangs genannten Gattung nach der Erfindung dadurch, daß das Verfahren in einer Zentrifuge durchge führt wird, die gekennzeichnet ist durch als zylin drisch geformter Hohlraum ausgebildeten, um die Hohl raumachse drehbaren, mit Einlaßrohr und Auslaßrohr be stückten Zentrifugenmantel sowie einen in dem Hohlraum an geordneten, im wesentlichen zylindrisch geformten Teil, der an dem Mantel befestigt ist und dessen Außenfläche der Innenwand des Mantels so dicht angepaßt ist, daß eine schmale zylindrische Kammer zwischen der Innenwand des Mantels und der Außenfläche des Teils vorhanden ist, wo bei als Kulturmedium eine kontinuierliche Strömung zellen freier Lymphe eingesetzt wird. In dieser Zentrifuge werden die Zellen sehr schnell von der Flüssigkeit, in der sie suspendiert sind, getrennt und in einer sehr dünnen Ober flächenschicht abgelagert.

In der Zentrifuge werden die Zellen kultiviert, wobei als Kulturmedium die zellenfreie Lymphflüssigkeit dient. Er schöpfte zellenfreie Lymphe kann periodisch oder kon tinuierlich durch frische zellenfreie Lymphe ersetzt wer den, während die Zellen in dünner Schicht gehalten werden. Die um die horizontale Achse rotierbare Zentrifugenkammer dient als Kulturkammer. Beim kontinuierlichen Vorbeiflie ßen der Lymphflüssigkeit erfolgt normale Ernährung der Zellen durch die zellenfreie Lymphe, so daß die Antikör perproduktion der Zellen während des Kreislaufs der zel lenfreien Lymphe innerhalb der Zentrifuge gewährleistet ist.

Infolge der gebildeten dünnen Zellenschicht erhalten eine sehr hohe Anzahl der Zellen, da sie sich in unmittelbarem Kontakt mit dem Kulturmedium befinden, die Möglichkeit, optimale Nahrung aus dem Medium zu bekommen. Lediglich die an der Schichtunterseite in direktem Kontakt mit der Innenfläche des Mantels befindlichen Zellen erhalten ihre Nahrung mittels Diffusion durch die Zellenschicht hindurch.

Eine zweckmäßige Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Ver fahrens ist gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
daß eine Mischung von zu kultivierenden Zellen und von Lymphzellen freier Lymphflüssigkeit hergestellt wird,
daß die Mischung zum Trennen der Zellen von der Lymph flüssigkeit und zum Bilden einer dünnen Zellenschicht ge schleudert wird,
daß die abgetrennte Lymphflüssigkeit durch frische zellen freie Lymphflüssigkeit ersetzt wird, während die Zellen in der dünnen Schicht gehalten werden,
daß die dünne Schicht der Zellen zu ihrer Dispersion in der frischen Lymphflüssigkeit umgerührt wird,
daß die Dispersion während einer vorhergewählten Zeitpe riode aufrechterhalten wird,
daß die Dispersion zum Trennen der Zellen von der frischen Lymphflüssigkeit und zum Bilden einer dünnen Zellenschicht geschleudert wird,
daß die unmittelbar vorhergehenden fünf Schritte in der an gegebenen Reihenfolge eine vorher gewählte Anzahl von Malen wiederholt werden und
daß ein Teil der kultivierten Zellen periodisch gesammelt wird, während sich die Zellen in der Dispersion befinden. Durch diese Unterteilung des Verfahrens in verschiedene Schritte oder Perioden ergeben sich zahlreiche Vorteile.

Die als Schleuderperiode bezeichnete Periode dient zur Ausbildung der dünnen Zellenschicht. Dabei wird, wie zuvor beschrieben, nach dem Einbringen der zu kultivierenden Zellen in die Zentrifuge der Zentrifugenmantel mit einer so ausreichend großen Drehzahl um seine Achse gedreht, daß die erforderliche Schwerkraft am Umfang des Mantels erzeugt wird und auf die zu kultivierenden Zellen zur Wirkung kommt, so daß diese sich in Form der dünnen Zellenschicht an der Wandung ablagern. Während der Schleuderperiode wird ein Volumen des Kulturmediums durch die Zentrifugenkammer gepumpt, so daß eine fast vollständige Erneuerung frischen Mediums innerhalb der Kammer erfolgt. Die Strömungsge schwindigkeit des Mediums wird so rasch wie möglich ge wählt, um die Dauer der Schleuderperiode so kurz wie mög lich zu halten. Die Strömungsgeschwindigkeit wird dabei zweckmäßig so begrenzt, daß die durch die Schwerkraft festgehaltenen Zellen nicht gestört und nicht bewegt wer den. Eine Bewegung der Zellen könnte einen unerwünschten Verlust von zu kultivierenden Zellen ergeben, falls diese zusammen mit abzuziehendem Kulturmedium aus der Kammer herausgeführt würden. Einen derartigen unerwünschten Ver lust von Zellen kann man durch entsprechende Wahl der Größe der Schwerkraft und der Strömungsgeschwindigkeit, angepaßt an die Form der Kulturkammer, verringern bzw. vollständig ausschließen, wenn man diese Größen so auf einander abstimmt, daß die Strömung in der Kammer eine la minare ist und Wirbelbildung und Pulsation der Flüssigkeit ausgeschlossen sind.

Eine zweite Periode eines Zyklus wird als die Zellendis persionsperiode bezeichnet. Während dieser Periode werden die in dünner Schicht zentrifugierten Zellen mittels ver gleichsweise geringer Schwerkraft wieder dispergiert. Dazu wird die Strömung des Kulturmediums durch die Kulturkammer zum Stillstand gebracht, und der Eingang der Kulturkammer der Zentrifuge wird abgesperrt. Dann wird der Zentrifugen mantel mit einer geregelten Geschwindigkeit verlangsamt. Die Bewegungsenergie bzw. kinetische Energie der kulti vierten Zellen einerseits und des Kulturmediums anderer seits in Zusammenwirkung mit der Verlangsamung des Zen trifugenmantels bewirken eine geregelte relative Bewe gung zwischen dem Mantel und dem Inhalt der Kammer. Infol ge dieser Bewegung werden die kultivierten Zellen aus ihrer vorherigen stabilen Lage an der Innenfläche des Man tels verdrängt. Die dünne Schicht der Zellen wird umge rührt und so die Zellen in der in der Kammer vorhandenen frischen zellenfreien Lymphe dispergiert. Die Geschwindig keit der Verlangsamung des Mantels regelt das Ausmaß, mit dem die Zellen in dem Kulturmedium möglichst gleichmäßig dispergiert werden.

Eine dritte Periode des Zyklus, während derer keine Strö mung des Mediums durch die Kammer erfolgt, wird mit Auf rechterhaltung der Zellendispersion bezeichnet. Die Dis persion wird vorteilhaft während einer vorgegebenen Zeit spanne aufrechterhalten.

Dies läßt sich auf zweierlei Weise bewirken:

Bei der ersten Art wird der Mantel um die waagerechte Ach se mit einer so konstanten niedrigen Drehzahl gedreht, daß ein Schwerkraftfeld X, wobei X kleiner als 1 ist, erzeugt wird. Wenn sich die Zellen in der unteren Hälfte des Man tels befinden, werden sie einer Kraft von (1 + X)G unter worfen, welche gegen den Umfang des Mantels gerichtet ist. Wenn die Zellen sich in der oberen Hälfte des Mantels be finden, werden sie einer Kraft von (1 - X)G unterworfen, welche gegen die Mitte des Mantels gerichtet ist. Die Kräf te während des ersten Halbzyklus jeder Umdrehung und wäh rend des zweiten Halbzyklus jeder Umdrehung sind ent sprechend verschieden. Diese kontinuierliche Veränderung der Schwerkraft, die sich sowohl in der Größe als auch in der Richtung ändert, hält die Zellen in der frischen Lymph flüssigkeit in Suspension.

Bei der anderen Arbeitsweise dreht sich der Mantel kon tinuierlich während Perioden der Beschleunigung und der Verlangsamung. Beide Perioden bewirken eine relative Be wegung zwischen dem Inhalt des Mantels und dem Mantel selbst. Es erfolgt daher eine kontinuierliche Dispersions wirkung auf die Zellen, so daß diese während der gesamten dritten Periode in der frischen Lymphflüssigkeit in Sus pension bleiben.

Eine vierte Periode des Zyklus wird als Zellenpackungs periode bezeichnet. Während dieser vierten Periode erfolgt keine Strömung des Mediums durch den Mantel. Der Zentri fugenmantel wird beschleunigt, bis er eine vorher gewähl te Drehzahl erreicht, welche aufrechterhalten wird, bis die in Suspension befindlichen Zellen in ihrer Schleuder stellung in einer dünnen Schicht längs der Oberfläche der Innenwand des Mantels zurückgeführt sind. Es ist manchmal von Vorteil, die so erzeugte Schwerkraft zu verringern, um eine entsprechende Packungsdichte zu gewährleisten, oder diesen Zustand aufrechtzuerhalten, sobald die Zellen gepackt sind. Eine Verringerung der Schwerkraft verringert die Packungsdichte und erleichtert eine spätere Dispersion der Zellen.

Am Ende der vierten Periode beginnt ein neuer Zyklus.

Von Zeit zu Zeit wird einer der Perioden, in denen sich die Zellen in Suspension befinden, ein beliebiger aliquoter Teil der kultivierten Zellen mittels durch die Kulturkammer strömender Flüssigkeit aus der Kammer entnom men und gesammelt.

Statt der vorstehend erläuterten Zentrifuge kann erfin dungsgemäß auch eine Perfusionskammer eingesetzt werden, wobei die Zellen auf kollageniertem Glas liegen und mit einem Nylonnetz oder Linsenpapier bedeckt sind. Ebenso kann anstelle der Zentrifuge erfindungsgemäß auch eine Perfusionskammer eingesetzt werden, wobei die Zellen einer dünnen Schicht aus 0,8% Agar einverleibt sind.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens hat sich eine Zentrifuge als besonders vorteilhaft herausgestellt, die durch die in Patentanspruch 5 aufgeführten Merkmale gekennzeichnet ist. Eine zweckmäßige Ausgestaltung dieser Zentrifuge ist in Patentanspruch 6 gekennzeichnet.

Mit dem erfindungsgemäßen in vitro-Verfahren lassen sich Zellen unter Umgebungsbedingungen züchten, die denjenigen Umgebungsbedingungen, unter denen die Zellen natürlicher weise wachsen und sich vermehren, praktisch vollkommen entsprechen, so daß das erfindungsgemäße Verfahren den na türlichen Wachstumsvorgang der Zellen zu simulieren ver mag. Die Zellen können sich vermehren, während sie von der ständig daran vorbeifließenden Lymphe umspült wird.

Besonders vorteilhaft ist die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren mögliche kontinuierliche Massensuspensionskulti vierung von Zellen in vitro.

Am Beispiel der in der Zeichnung gezeigten Ausführungsformen von Zentrifugen und der sich anschließenden Beschreibung wird die Erfindung weiter beschrieben. In der Zeichnung ist

Fig. 1 ein Längsschnitt durch eine in der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwandten Zentrifuge,

Fig. 2 eine Seitenansicht dieser Vorrichtung,

Fig. 3 ein Längsschnitt durch eine andere Ausführungsform ei ner Zentrifuge und

Fig. 4 eine Stirnansicht dieser Zentrifuge.

Die Zentrifuge 40 (Fig. 1) besteht aus einem ringförmigen Teil oder Kern 44, der durch Bolzen 47 (von denen nur einer darge stellt ist) an einem Mantel 45 und einer Endkappe 46 befestigt ist. Diese sitzt in einer abgestuften Ausnehmung an der Basis des Kerns 44. Die Nabe 48, an der eine Welle 49 ansitzt, ist an der Endkappe 46 durch Bolzen 47′ (von diesen ist nur einer dargestellt) befestigt. Die Welle 49 ist in Stützlagerblöcken 50 (Fig. 2) gelagert. Eine elektromagnetische Bremse 51 und eine Riemenscheibe 52 sind auf dem anderen Ende der Welle 49 angeordnet. Ein mit strichpunktierten Linien dargestellter Rie men 53 kuppelt die durch den Motor 55 angetriebene Riemenschei be 54 mit der Riemenscheibe 52, um die Welle 49 um die Achse 43 zu drehen (Fig. 1). Die zu trennenden Materialien werden in die Zentrifuge 40 durch das Polytetrafluoräthylenrohr 56 a einge führt, welches am Mantel 45 durch den Knopf 45 a aus dem glei chen Material befestigt ist (Fig. 1).

Das Rohr 56 a mündet in die ringförmige Kammer 40 a, die durch die Wand des Kerns 44 und die Innenwand 41 des Mantels 45, des sen Außenwand mit 42 bezeichnet ist, begrenzt wird. Die ring förmige Kammer 40 a bildet die Zentrifugenkammer. Ein Dich tungsring 44 c bildet die Abdichtung für diese Kammer. Im Ba sisende des Kerns 44 ausgebildete radiale Bohrungen 44 a münden in die Zentrifugenkammer 40 a. Die entfernten Enden 44 b der Boh rungen 44 a münden in das Polytetrafluoräthylenrohr 56 b, welches an dem Kern 44 mittels Preßsitz innerhalb einer Welle 56 c aus dem gleichen Material befestigt ist. Dazwischen angeordnete Polytetrafluoräthylen-Führungsteile 57 (Fig. 2) stützen die Enden der Rohre 56 a, 56 b ab, die mit üblichen Drehdichtungen 58 a, 58 b verbunden sind. Die Einlaßöffnung ist mit 59 a, die Auslaßöffnung mit 59 b (Fig. 2) bezeichnet.

Die Fig. 3 und 4 veranschaulichen die Konstruktion einer anderen Zentrifuge 400 mit einem Kern 401, der aus Aluminium hergestellt werden kann und der eine vorstehende hohle Welle 402 aufweist, die in Lagern 403, 404 zwecks Drehung um die Achse 405 gelagert ist. Die Welle 402 wird durch eine (nicht dargestellte) übliche Einrichtung angetrieben. Eine Stirnplat te 406 ist am Ende 407 des Kerns 401 durch (nicht dargestellte) übliche Befestigungsmittel befestigt. Das Ende 407 des Kerns 401 ist mit einer eingeschnittenen Nut 408 versehen, die das die Flüssigkeit führende Rohr 409 aufzunehmen vermag. Ein Ende des Rohres 409 ist mit einer üblichen Drehdichtung 410 verbun den, geht durch die Bohrung 411 der Stirnplatte 406 hindurch und ist in der Nut 408 angeordnet, wie Fig. 4 zeigt. Das Rohr 409 geht dann durch die Bohrung 412 des Kerns 401 und durch die hohle Welle 402 zu einer zweiten üblichen Drehdichtung 413 hindurch.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen in-vitro-Züchtungsver fahrens werden zunächst die zu kultivierenden Zellen in dünner Schicht an der Zentrifugenkammerwand abgelagert, und dann wird als Kulturmedium zellenfreie Lymphe zugeführt. Man kann eine zellenfreie Lymphe verwenden, die direkt von einem Spender-Le bewesen erhalten und nach Abziehen vom Spender zellenfrei ge macht worden ist. Es kann auch eine Mischung von zu kultivieren den Zellen und zellenfreier Lymphe zubereitet und der Zentrifu ge zugeführt werden. Die Flüssigkeit kann dazu durch geeignete Flüssigkeitsverarbeitungs- und Übertragungsvorrichtungen in mittels bekannter Meßgeräte, zum Beispiel über einen automati schen Pipetter, abgemessenen Mengen und mit bestimmten Ge schwindigkeiten in die Zentrifuge so eingeführt werden, daß die vorhandenen Zellen sehr rasch und praktisch ohne Beschädi gung von der Lymphflüssigkeit abgetrennt und in dünner Schicht auf der Innenfläche des Zentrifugenmantels abgelagert werden. Die zu kultivierenden Zellen werden durch entsprechende Rege lung der Umdrehungsbewegung des Zentrifugenmantels um seine Achse als Zellenschicht an der Zentrifugenkammerwandung gehal ten, und die zellenfreie Lymphe wird kontinuierlich durch die Kammer geleitet und dabei in Kontakt mit den Zellen gebracht.

Mittels des erfindungsgemäßen in-vitro-Kulturverfahrens können beliebige kultivierbare Zellen, wie Säugetier- und Nichtsäuge tier-, Mikroorganismen- und Parasiten-Zellen gezüchtet werden. Diese oder deren Produkte können für diagnostische und thera peutische Zwecke bei Menschen und Tieren und für wissenschaft liche Untersuchungen verwendet werden.

Die erfindungsgemäße in-vitro-Methode erlaubt ein vorteilhaft gleichmäßiges Kultivieren, weil die Umgebung rund um jede Zel le die gleiche ist und jede Zelle ihre Nahrung direkt aus dem Kulturmedium entnehmen und ihre Stoffwechselprodukte in das Medium, das die Zelle vollständig umgibt, abstoßen kann. Die in der Suspensionskultur ausgeführten Bewegungsvorgänge ermög lichen es ferner, daß pro Kulturkammervolumen eine große Anzahl von Zellen kultiviert wird. Die Population ist vorteilhaft hoch. Das Kulturmedium kann während der gesamten Kulturzeit in prak tisch konstanter Zusammensetzung gehalten werden. Die Konstanz des Kulturmediums ist eine der Voraussetzungen für gleichförmi ges Wachstumsverhalten der Zellen und die Beibehaltung der ur sprünglichen Eigenschaften bei der Zellenvermehrung. Die Erzeu gung von Zellenmaterial mit möglichst konstanten Eigenschaften ist wichtig, wenn diese Zellen oder deren Produkte für wissen schaftliche Untersuchungen oder für diagnostische oder thera peutische Zwecke verwendet werden sollen.

Es gelingt so mit dem erfindungsgemäßen in-vitro-Verfahren, Zellen unter Umgebungsbedingungen zu züchten, die denjenigen Umgebungsbedingungen, unter denen die Zellen natürlicherweise wachsen und sich vermehren, praktisch vollständig entsprechen können, so daß das erfindungsgemäße Verfahren den natürlichen Wachstumsvorgang der Zellen zu simulieren vermag. Die Zellen können sich vermehren, während sie von der ständig daran vor beifließenden Lymphe umspült sind. Dies simuliert den Vorgang im lebenden Gewebe, denn im lebenden Organismus umspült die Lymphe die Gewebezellen ebenfalls.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß man die Zellen, während sie sich an der Innenwand der Zentrifuge in dünner Schicht befinden, für verschiedene Verwendungszwecke gezielt behandeln kann. Sie können bei spielsweise mit Arzneimitteln oder spezifischen Verbindungen, beispielsweise mit Enzymen, wie Trypsin und Neuraminidase, be handelt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch von Nutzen für die Her stellung von Impfstoffen für die aktive Immunisierung, bei spielsweise gegen Treponema pallidum, Lepra und Parasiten in Menschen und Tieren. Dazu wird als Kulturmedium, in welchem zu kultivierende Zellen gebadet werden, eine extrazellulare Flüs sigkeit eingesetzt, deren Zusammensetzung ähnlich derjenigen von Lymphe ist. Dabei kann es zweckmäßig sein, als Kulturkam mer eine Perfusionskammer zu verwenden, durch die man die Kul turflüssigkeit hindurch fließen läßt. Dies ist für zu züchten de Gewebezellen geeignet, welche durch das fließende Kulturme dium nicht weggeschwemmt werden sollen. Beispiele sind Zellen von Organismen, Transplantate, wie beispielsweise Endocringe webe, Lymphdrüsen, Zahnbakterien oder Tumorfragmente, dünne Gewebezellenschichten, wie zum Beispiel Omentum, befruchtetes Ei oder dispergierte Zellen, welche an einem kollagenierten Glasboden der Kammer anhaften. Es kann auch zweckmäßig sein, die Kulturflüssigkeit durch Kammern zu perfundieren, welche ein Nylonnetz von beispielsweise etwa 100 Mikron Maschenweite auf dem Boden der Kammer aufweist. Es liegen dann die zu züchtenden Zellen auf dem kollagnierten Glas und sind von dem Nylonnetz bedeckt, welches verhindert, daß die Zellen durch die Strömung des Kulturmediums gestört werden, selbst wenn sie nicht an dem Glas befestigt sind. Es kann dabei für bestimmte Zwecke vor teilhaft sein, die Kulturflüssigkeit durch eine Kammer zum Durchfließen zu bringen, in der die zu züchtenden Zellen einer dünnen Schicht aus Agar einverleibt gehalten sind. Die Kultur flüssigkeit, die zellfreie Lymphe, wird dann über die Obersei te des Agars fließen gelassen.

Weiterhin ist es möglich, die zu züchtenden Zellen an kleinen Glas- oder Kunststoffkugeln als inerten Träger-Teilchen haftend in der Kammer zu halten, zum Beispiel einer Perfusionskammer, durch die die zellenfreie Lymphe als Kulturmedium zum Durch fließen gebracht wird.

Darüber hinaus kann man das erfindungsgemäße Verfahren für be stimmte Anwendungszwecke dadurch variieren, daß die Kulturflüs sigkeit, die extrazellulare Flüssigkeit, mit verschieden hoher Geschwindigkeit durch die Kulturkammer geleitet wird, so daß jeweils nur die Oberfläche der zu züchtenden Zellen damit in Be rührung kommt. Dies kann bedeutsam sein, wenn es sich um leicht denaturierbare Substanzen, wie Proteine und andere Ma kromoleküle handelt. Um die Sterilität des Systems zu sichern, können in die Kulturkammer CO₂- und/oder O₂-Gas eindiffundiert werden, wobei je nach Verwendungszweck die CO₂-Tension und/oder O₂-Tension des Kulturmediums geregelt und dessen pH-Wert ge wünschtenfalls überwacht und angepaßt wird.

Es konnten mit dem erfindungsgemäßen Verfahren beispielsweise die nachstehend aufgeführten Gewebe-Zellen unter normalen Gewe bekulturbedingungen mit frischer fließender zellfreier Lymphe als Kulturmedium gezüchtet werden:

A: Hornhaut des Auges
Die Hornhaut ist als ein Modellorgan für die Kultur ausge wählt worden, weil sie in vivo in wäßriger Flüssigkeit schwimmt, keine Blutzuführung aufweist, ihre Nahrung durch Diffusion ableitet, für die Kultur mit minimaler Verletzung entfernt werden kann und ohne ihren Gewebeaufbau zu stören, sowie weil der funktionelle Zustand und die Lebensfähigkeit ihres Epithels durch die Durchsichtigkeit der Hornhaut be stimmt werden kann und durch detaillierte morphologische Eigenschaften ihres leicht angeordneten Epithels. Eine sol che Hornhaut ist durch das Verfahren gemäß der Erfindung erfolgreich kultiviert worden.
B: Knochenmark
Die Wirksamkeit dieses Organs für die Kultur wird bestimmt durch Koloniebildung, Morphologie, die Fähigkeit, Fe⁵⁹ auf zunehmen, die Reaktion auf Erythropoetin, sowie die Fähig keit solcher kultivierter Zellen, den Tod von Tieren zu verhindern, welche eine bestimmte kritische Strahlungsdo sis empfangen haben.
C: Lymphozyten und Lymphoidgewebe
Lymphozyten werden mit und ohne kontinuierlichen oder dis kontinuierlichen Kontakt mit Phagozyten kultiviert und werden bestimmt durch Morphologie, Reaktion auf Antigen und Phytohaemoglutinin sowie die Fähigkeit, eine primäre Immun reaktion einzuleiten. Die Immunreaktion wird gemessen durch den Jerne Plattenversuch für RBC-Antigen oder durch eine Modifikation des Jerne Plattenversuchs für lösliches Anti gen.
D: Thyroid Transplantate
Die Wirksamkeit dieses Organs für die Kultur wird bestimmt durch Morphologie, die Aufnahme von I¹³¹ (durch Scintilla tionszählung der in Kultur befindlichen Gewebe und nach der Herstellung und nach Radioautogrammen), durch die Fähig keit, bezeichnetes Thyrozin und tri-Jodthyronin zu synthe tisieren (Chromatographie), und durch die Fähigkeit, auf Thy roid anregendes Hormon zu reagieren.
E: Zellenbakterien von einem 16-18 Tage alten Ratten- oder Mausembryo
Die Wirksamkeit dieses Organs für die Kultur wird bestimmt durch die Fähigkeit, Zahnbakterien zu entwickeln, die histo logisch zu unterscheiden sind.
F: Enzymstudien
Hier wird versucht, Säugetierdrüsengewebe oder Herzmuskel zu kultivieren und die progressive Veränderung in der Akti vität verschiedener Enzyme zu verhindern, die gleichmäßig auftritt, wenn diese Gewebe in üblichem Gewebe-Kulturmedium kultiviert werden. Das hauptsächlich verwendete Verfahren ist die Zonen-Elektrophorese, wobei hydrolysiertes Stärke gel als elektrophoretisches Medium verwendet wird.
Spezifische Enzymaktivitäten werden in dem Gel durch Verwen dung histochemischer Farbstoffe angezeigt. Diese Verfahren sind hauptsächlich für die Anzeige des Vorhandenseins oder Fehlens von Enzymaktivitäten anwendbar und sind keine quan titativen Verfahren. Sie weisen den großen Vorteil auf, daß sie verhältnismäßig kleine Materialmengen für die Anzeige einer großen Zahl von Enzymen erfordern.
Die Enzymstudien an Gewebeextrakten und kultivierten Zellen sind beispielsweise: Aldehyddehydrogenase, Octanolalkohol dehydrogenase, a-Glycerophosphatdehydrogenase, Catalase, Acetyl- und Butyrylesterase. Glucose-6-phosphatdehydro genase, Glutamatdehydrogenase, Glutamatoxaloacetattrans aminase, Hexokinase, Isocitratdehydrogenase, Lactatdehydro genase, Leucinaminopeptidase, Peroxida se, Säurephophatase, Phosphoglucomutase, 6-Phosphogluconat dehydrogenase, Succinatdehydrogenase und Tetraxoliumoxidase.
In Fällen, bei welchen nennenswerte quantitative Verände rungen vorgeschlagen werden, wie durch die visuelle Inspek tion der elektrophoretischen Daten beurteilt wird, werden quantitative Bestimmungen durch normale analytische Verfah ren ausgeführt.
G: Krebsbiologie
Im einleitenden Kommentar fehlen kritische "Anzeiger" für die Identifizierung von neoplastischen Zellen in vitro. Die Gründe für diese Schwierigkeit sind:
- a) bösartige Zellen aus Tumoren in vivo haben Schwierigkeit beim Wachsen. Wenn sie aber wachsen, verändern sie sich in der Kultur;
- b) die in der Kultur sich entwickelnde Bösartigkeit ist ei ne bösartige Veränderung in den Zellen, die bereits durch die Kultur verändert sind;
- c) die Veränderung normaler Zellen in der Gewebekultur und einige dieser Veränderungen sind Eigenschaften der Bös artigkeit ähnlich;
- d) derzeit kann die Bösartigkeit mit Sicherheit nur durch die Fähigkeit der bösartigen Zellen definiert werden, den normalen zellularen Regelmechanismen (einschließlich der Immunität) zu widerstehen, sowie durch die Annahme von Eigenschaften, welche denselben ermöglicht, normale zellulare und interzellulare Strukturen zu überschwem men und zu vernichten. Das neuartige Verfahren wird ver wendet, um zu bestimmen, ob bösartige Zellen, die in un veränderter frischer fließender zellenfreier Lymphe kul tiviert werden, durch ihren Mangel an Differenzierung identifiziert werden können, sowie durch ihre Fähigkeit, normales Gewebe, wie zum Beispiel Omentum, oder dünnwan dige Lymphgefäße anzugreifen. Diese letzteren Gewebe sind gewählt worden, weil sie so dünn sind, daß Phasenkon trastmikroskopie und Zeitrafferaufnahmeverfahren verwen det werden können, um die Wechselwirkung zwischen bösar tigen Zellen und dem Omentum oder endothelialen Zellen des Lymphgefäßes zu beobachten.
Dann kann eine Prüfung des Verhaltens der Krebszellen er folgen, einschließlich der direkten Wirkung von Arzneimit teln oder Antikörpern oder beider auf bösartige Gewebe, welche in einer durch das Verfahren vorgesehenen Umgebung wachsen. Dies ermöglicht die Untersuchung der Wirkung von Krebschemotherapiearzneimitteln und der Immunität gegen das Krebsantigen.
In dieser Hinsicht liefern die folgenden Verfahren wertvol le Daten:
- 1. Bösartige Zellen von einem Patienten werden in seiner eigenen frischen fließenden zellenfreien Lymphe kulti viert. Krebsarzneimittel werden in die Lymphe eingeführt, welche zu jeder Kulturkammer gelangt. Die Lymphe wird nicht zu dem Patienten zurückgeführt. Dies unterstützt die Vorhersage, welches Arzneimittel für den Patienten von größtem Wert sein wird.
- 2. Zusätzlich wird das Arzneimittel dem Patienten verab reicht. Die Lymphe enthält das Arzneimittel in der glei chen fluktuierenden Konzentration, die in der extrazel lularen Flüssigkeit des Patienten auftritt. Dieser Test bestimmt die Arzneimittelreaktion des Tumors in dem Pa tienten und die Tumorzellen wachsen in seiner eigenen Lymphe.
- 3. Der cytotoxische Effekt von autologen Lymphozyten allein oder zusammen mit Krebsarzneimitteln auf dem eigenen Tu mor des Patienten liefern Daten über die synergistische Wirkung von Arzneimitteln und die Immunität.
Ferner können von menschlichem Krebs isolierte Viren, bei spielsweise Burkitt lymphoma, hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet werden, bösartige Veränderungen in normalem Gewebe herbeizuführen. In dem Fall von Burkitt lymphoma sind die Zielzellen für den Virus Lymphozyten, und ihre Veränderung zur Bösartigkeit, das heißt, daß sie Burkitt Zielzellen wer den, wird getestet durch Morphologie, durch immunofluores zenten Farbstoff und die Fähigkeit, als eine kontinuierli che Reihe in der Gewebekultur zu wachsen. Es ist unwahr scheinlich, daß übliche Gewebekulturverfahren zum Testen von Viren geeignet sind, welche Burkitt lymphoma verursa chen können, weil Lymphozyten in dem normalen Kulturmedium nicht lange genug überleben. Die Veränderung von Lymphozy ten in die erkrankte Art im normalen Kulturmedium ist ähn lich der Veränderung, die erfolgt, wenn eine Lymphozyte ei ne Burkitt Zielzelle wird. Das Vorhandensein von heterolo gen Proteinen beeinflußt die Zellenmorphologie und kann die immunofluoreszente Prüfung dieser Zellen stören. Diese Mängel der üblichen Verfahren werden vermieden durch Gewebe kultur gemäß der Erfindung, indem unveränderte frische flie ßende zellenfreie Lymphe verwendet wird, die nicht zu dem Spender zurückgeführt wird, wenn sie durch einen Virus ver unreinigt ist.
Überdies werden Tumorzellen aus dem Patienten entfernt und durch das Massensuspensionsverfahren kultiviert. Die resul tierende Kultur wird unter Kühlung gelagert, um dieselbe lebensfähig zu halten.
Dann kann der radioaktive Antikörper mit den kultivierten Krebszellen zur Reaktion gebracht werden, um ihre Wechsel reaktionen festzustellen. Sobald diese Wechselreaktionen be kannt sind, können ein nicht reagierter radioaktiver Anti körper, unerreichte kultivierte Krebszellen und Serum von einem auf Krebs zu testenden Objekt gemischt werden. Die resultierenden Wechselreaktionen zeigen an, ob das Objekt den gleichen Krebs hat oder nicht, weil die einzigen Kom ponenten des Serums des Objekts, welche die normale erwar tete Wechselwirkung zwischen dem radioaktiven Antikörper und den kultivierten Krebszellen verändern könnten, der gleiche für den Krebs spezifische Antikörper oder das glei che Tumorantigen sind, welche Komponenten in dem Serum des Objekts nur vorhanden sind, wenn das Objekt mit dem glei chen Krebs behaftet ist.
1H: Umkehrung von Veränderungen in Zellen, die in normalem Me dium kultiviert sind
Einige der frühen Veränderungen in Geweben, die daher her rühren, daß dieselben in normalen Medien kultivert sind, können teilweise oder vollständig umgekehrt werden, wenn das Gewebe in vio transplantiert wird. Gemäß der Erfindung kön nen die Ausführbarkeit, die Art und die Biokinetik dieser Umkehrung studiert werden, indem das Gewebe abwechselnd im Gewebekulturmedium und in frischer fließender zellenfreier Lymphe incubiert wird. Wenn die Redifferenzierung und die Reparatur der Enzymveränderung in Lymphe erzielt ist, lie fern Erweiterungen solcher Experimente Daten über Mechanis men, die mit der veränderten genetischen Darstellung von Ge weben befaßt sind. Herzmuskel und Säugetierdrüsen sind idea le Gewebe für diese Studien.
I: Immunbiologie
Bis zur jetzigen Zeit ist die Einleitung einer primären Im munreaktion in vitro nicht vollständig erfolgreich gewesen. Gemäß einem anderen Merkmal der Erfindung wird die primäre Antikörperbildung in Lymphoidgewebe und in Lymphozyten ein geleitet, während dieselben nach dem oben beschriebenen neuen Verfahren kultiviert werden. Die Immunreaktion wird dann gemessen, wie vorstehend im Beispiel C beschrieben wurde.
Wenn eine primäre Immunreaktion in Lymphozyten eingeleitet wird, können nennenswerte Daten erhalten werden hinsicht lich:
- a) der clonalen Selektionstherorie,
- b) der Rolle von Makrophagen bei der Immunreaktion,
- c) der morphologischen und anderen Veränderungen, zum Bei spiel der Einverleibung von tritiated Thymade, in kultivier ten Zellen, um festzustellen, ob sich dieselben mit oder oh ne Mitose differenziert haben, um Antikörper erzeugende Zel len zu werden,
- d) der Art der Wirkung einer Überdosis des Antigens oder An tikörpers bei der Behinderung der Antikörperproduktion.
Wenn Lymphozyten in zellenfreier Lymphe gehalten werden kön nen und wenn sie Immunoglobine synthetisieren als Reaktion auf die antigenische Anregung, wird ferner im Hinblick auf die angewendete Immunologie das folgende wichtige Experi ment ausgeführt: Die Kultur von Lymphozyten aus einem vor aussichtlichen Empfänger eines Transplantats und der Ver such, daß dieselben ein spezifisches Immunoglobin syntheti sieren gegen Gewebe, die dem voraussichtlichen Spender ent nommen werden. Solche löslichen Antikörper, die als verstär kende Antikörper bezeichnet werden, können gesammelt, kon zentriert und dem Empfänger bei wiederholten Gelegenheiten injiziert werden. Ein solches Verfahren ist eine große Hil fe bei der Verhinderung der Rückbildung dieses Transplan tats durch die eigenen zellengebundenen Antikörper des Emp fängers. Dieses Verfahren der Veränderung der Rückbildung von Transplantaten ist für den Empfänger nicht toxisch und ist überlegen der Verwendung von immunen unterdrückenden Arzneimitteln, der Entleerung des Brustlymphganges oder der Bestrahlung von Blut außerhalb des Körpers.
J: Populationsabhängigkeit und clonale Experimente
Gemäß einem einleitenden Kommentar gibt es eine Populations abhängigkeit für das Wachstum und die Funktion in der Gewe bekultur. Der Bedarf für eine kritische Zellenpopulation kann teilweise oder vollständig überwunden werden durch die Verwendung von Futterzellenschichten oder ein konditionier tes Medium. Es wurde gefunden, daß eine solche Populations abhängigkeit nicht vorhanden zu sein scheint, wenn Zellen in frischer fließender zellenfreier Lymphe kultiviert wer den, die in Wirklichkeit eine Flüssigkeit ist, welche durch die Beiträge der heterogenen Zellen des Körpers konditio niert wird. Als Ergebnis dieser Entdeckung können clonale Experimente ausgeführt werden. Beispielsweise kann eine kri tische Prüfung der clonalen Selektionstherorie der Immunität vorgenommen werden. Es werden Versuche angestellt, eine pri märe Immunreaktion in 1-1000 Lymphozyten und Phagozyten in jeder der einzelnen Kulturkammern einzuleiten, die gemäß der Erfindung ausgebildet sind. Wenn jede Lymphozyten-Phagozy tenpopulation in einer identischen Weise reagiert, würde dies nahelegen, daß alle immun reagierenden Zellen im Hin blick auf die spezifische Antikörperproduktion gleichwertig sind, und die clonale Selektionstherorie würde wieder aufge wertet.

Claims

1. Verfahren zur in vitro-Züchtung von Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in einer Zentrifuge durchgeführt wird, die gekennzeichnet ist durch einen als zylindrisch geformter Hohlraum ausgebildeten, um die Hohl raumachse (43) drehbaren, mit Einlaßrohr (56 a) und Auslaß rohr (56 b) bestückten Zentrifugenmantel (45) sowie einen in dem Hohlraum angeordneten, im wesentlichen zylindrisch geformten Teil (44), der an dem Mantel (45) befestigt ist und dessen Außenfläche der Innenwand (41) des Mantels (45) so dicht angepaßt ist, daß eine schmale zylindrische Kam mer (40 a) zwischen der Innenwand (41) des Mantels (45) und der Außenfläche des Teils (44) vorhanden ist, wobei als Kulturmedium eine kontinuierliche Strömung zellenfreier Lymphe eingesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
daß eine Mischung von zu kultivierenden Zellen und von Lymphzellen freier Lymphflüssigkeit hergestellt wird, daß die Mischung zum Trennen der Zellen von der Lymph flüssigkeit und zum Bilden einer dünnen Zellenschicht ge schleudert wird,
daß die abgetrennte Lymphflüssigkeit durch frische zellen freie Lymphflüssigkeit ersetzt wird, während die Zellen in der dünnen Schicht gehalten werden,
daß die dünne Schicht der Zellen zu ihrer Dispersion in der frischen Lymphflüssigkeit umgerührt wird,
daß die Dispersion während einer vorhergewählten Zeitpe riode aufrechterhalten wird,
daß die Dispersion zum Trennen der Zellen von der frischen Lymphflüssigkeit und zum Bilden einer dünnen Zellenschicht geschleudert wird,
daß die unmittelbar vorhergehenden fünf Schritte in der an gegebenen Reihenfolge eine vorher gewählte Anzahl von Malen wiederholt werden und
daß ein Teil der kultivierten Zellen periodisch gesammelt wird, während sich die Zellen in der Dispersion befinden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle der Zentrifuge eine Perfusionskammer eingesetzt wird, wobei die Zellen auf kollageniertem Glas liegen und mit einem Nylonnetz oder Linsenpapier bedeckt sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle der Zentrifuge eine Perfusionskammer eingesetzt wird, wobei die Zellen einer dünnen Schicht aus 0,8% Agar einverleibt sind.

5. Zentrifuge zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch eine als zylindrisch geform ter Hohlraum ausgebildeten, um die Hohlraumachse (43) dreh baren, mit Einlaßrohr (56 a) und Auslaßrohr (56 b) bestück ten Zentrifugenmantel (45) sowie einen in dem Hohlraum an geordneten, im wesentlichen zylindrisch geformten Teil (44), der an dem Mantel (45) befestigt ist und dessen Außenfläche der Innenwand (41) des Mantels (45) so dicht angepaßt ist, daß eine schmale zylindrische Kammer (40 a) zwischen der Innenwand (41) des Mantels (45) und der Außenfläche des Teils (44) vorhanden ist.

6. Zentrifuge nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch einen eine Bohrung (412) aufweisenden und um die Achse (405) drehbaren Kern (401) mit einer daran befestigten, eine Bohrung (411) aufweisenden Stirnplatte (406), die eine Nut (408) zur Aufnahme eines die Flüssigkeit führenden, durch die Bohrungen (411 und 412) hindurchgehenden Rohres (409) aufweist.