DE2312696A1 - Thermozymocidin, verfahren zu seiner herstellung und diese verbindungenthaltende arzneimittel - Google Patents

Description

SOGIETA¹ ITALIANA RESINE S. I.E. S.p.A. Mailand, Italien

"Thermozymocidin, Verfahren zu seiner Herstellung und diese Verbindung enthaltende Arzneimittel"

Priorität: I5. März 1972, V.St.A., Nr. 234

Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum, nachstehend mit Thermozymocidin bezeichnet, der Formel

OH OH NH

CH₃ (CH₂) ₅C- (CH₂) ₆-CH=CH-CH₂-CH~CII-C-COOII

CH₂OH

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Thermozymocidin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus der Gattung Myriococcum und der Art Albomyces ATCC 20 34-9 unter submers-aeroben Bedingungen in einem üblichen wäßrigen Nährmedium mit Kohlenstoff- und Stickstoffquellen bei Temperaturen von etwa 26 bis 55°C und in einem pH-Bereich von

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etwa 5v5 bis 8,0 züchtet und aus der G-ärmaische das Thermoz7/mocidin in an sich bekannter Weise isoliert.

Der Thermozymocidin erzeugende Stamm wurde aus einer Bodenprobe eines Maisfeldes in der Provinz Mailand, Italien, isoliert und in der EuItürSammlung des Istituto di Patologia Yegetali della Uhiversita degli Studi di Milano unter der Nr. I.P.V. F-4-33 und in der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Nr. 20 3^9 hinterlegt. Dieser Stamm gehört zur Familie der thermophilen Eumyceten. ■

Zur Isolierung des thermophilen Stammes wurde eine Suspension der Bodenprobe vor dem Beimpfen eines Kartoffel-Agar-G-lucose-Hefeextrakt-Nährbodens bei 4-5, bis 50°C inkubiert. Der Nährboden enthält pro Liter Kartoffelinfusion 20 g Agar, 20 g Glucose und 2 g Hefeextrakt. Die Kartoffelinfusion wurde aus 200 g Kartoffelmasse in destilliertem Wasser hergestellt. Das Nährmedium wird auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt und .20 Minuten bei 121°C sterilisiert.

Nach 2- bis 4-tägiger Inkubation bei 4-5 bis 50⁰C werden,Kolonien des thermophilen Stammes aus der Familie der Eumyceten, I.P.V. F-4-33 (ATCC Nr. 20 34-9) isoliert und auf einen Kartoffel-Agar-Glucose-Hefeextrakt-Nährboden überimpft. Auf diesem Nährboden zeigt der Stamm nach A bis 6 Tagen ein Temperaturminimum der Bebrütungstemperatur von etwa 26°G, ein Temperaturmaximum von etwa 50 bis 55°C und ein Temperaturoptimum bei etwa 4-3⁰C.

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~" "5 "■

Der Mikroorganismenstamm "bildet im allgemeinen auf den in Tabelle I angegebenen festen Nährböden Kolonien mit samtartigem, baumwollähnlichem Aussehen. Diese Kolonien bestehen aus einem anfänglich durchscheinenden Substratmycel, das eine gelb-cremefarbene Färbung annimmt,und einem weißlichen Luftmycel. Es kann auch ein schwach gelb gefärbtes Exopigment vorliegen, das nicht leicht in das Medium diffundiert»

Tabelle I

Wachstum auf verschiedenen Agar-Nährböden nach 6tägiger Bebrütung bei

Nährboden	Wachstum
Malz	gut
Milch	mäßig
Kartoffel-Glucose-Hefeextrakt	gut
Glucose-Hefeextrakt	mäßig
Stärke-Hefeextrakt	gut
Nähragar	schlecht
Nähragar-Hefeextrakt	schlecht
Nähragar mit Glucose	mäßig
Soja	mäßig
Hafermehl	schlecht
Reisinfusion	gut
Stabile Mistinfusion	mäßig
Asparagin-Glycerin	mäßig
Czapek	sehr schlecht

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Das Mycel des Mikroorganismenstammes besteht aus verzweigten septierten (d.h. zellig gegliederten) Hyphen mit einem Durchmesser von 2 bis 12 Mikron, Ihre Anordnung .kann zu daktyloiden Formungen, spiralförmigen Windungen und Aggregation von Hyphen führen, die eine besondere Neigung zur Bildung von Sklerotium besitzen. Typische asexuelle oder sexuelle Fortpflanzungsphasen wurden bis jetzt nicht beobachtet. Die Fortpflanzung erfolgt gewöhnlich durch Bruchstücke oder Konglomerate von Hyphen.

Der Thermozymocidin bildende Stamm hat folgende physiologische Eigenschaften; .. . ·

Sauerstoffbedarf: aerob

pH-Wert des Nährbodens: gutes Wachstum bei einem pH-Wert von

5,5 bis 8

Proteolytische Aktivität: positiv
Rennet-Aktivität: positiv
Amylolytische Aktivität: positiv
Lipolytische Aktivität: positiv
Cellulosolytische Aktivität: schwach positiv Ribonuclease-Aktivität: positiv

Verwertung von Kohlenstoffquellen: positiv für Glucose, Fructose, Galactose, Xylose, Maltose, Lactose, Rohrzucker, Dextrin, Stärke, Inulin, Glycerin und Mannit.

Verwertung von Stickstoffquellen: gut für Peptone, Asparagin, Harnstoff und Kaliumnitrat, schlecht für Ammoniumsulfat.

Thermozymocidin hat ein ausgeprägtes antimykotisches Aktivitätsspektrum. In Konzentrationen von 0,1 bis 10 Ύ /ml (reine Verdünnungsmethode in Agar-Malz-Nährböden bei 28°G) werden folgende

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Hefearten in ihrem Wachstum gehemmt: Sac char omy ce s, Pichia, Hansenula, Bebaryomyoes, Endomycopsis, Schizosaccharomyces, Kloeckera, Rhodotorula, Torulopsis, Candida, Trichosporon und Cryptococcus. Von besonderem Interesse ist die Wachstumshemmung von Cryptococcus neoformans, dan Erreger einiger Mycosen. Dieser Pilz ist empfindlich in Konzentrationen von 0,05 bis 0,1 T/ml.

Bei Konzentrationen von 5 bis 50 'T/ml werden verschiedene Arten γόη fadenförmigen Eumyceten folgender Typen in ihrem Wachstum gehemmt: Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Alternaria, Botrytis, Cercospora, Helminthosporlum, Oidium, Mucor, Neurospora, Trichophyton und Microsporum.

Konzentrationen von 50 T/ml Thermozymoeidin haben bei folgenden grampositiven Bakterien keine Wachstumshemmung zur Folge : Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus thuringlensis, Bacillus anthracis, Micrococcus flavus, Micrococcus lysodeikticus, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Sarcina lutea, Diplococcus pneumoniae, Lactobacillus casei, Corynebacterium aqui und Corynebacterium diphtheriae. Ferner werden bei Konzentrationen bis zu 50 Ύ/ml Thermozymocidin folgende gramnegative Bakterien in ihrem Wachstum nicht gehemmt: Salmonella typhimurium, Salmonella paratyphi, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Aerobacter aerogenes, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Alealigenes faecalis, Shigella dysenteriae und Brucella abortus* Ferner erfolgt keine Wachstumshemmung bei folgenden säureresistenten Bakterien: Mycobacterium butyricum, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium

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.tuberculosis und Mycobacterium. phlei. Ferner werden folgende Actinomyceten nicht gehemmt: Nocardia blackwellii, Nocardia opaca, Streptomyces griseus, Streptοsporangium album und Walksmania rosea.

Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Thermozymocidin wird der Stamm in einem üblichen wäßrigen Nährmedium unter submers-aeroben Bedingungen und vorzugsweise unter Rühren bei Temperaturen von etwa 26 bis55°C, vorzugsweise bei 4-0 bis 45°C und bei einem pH-Wert von 5,5 bis 8, vorzugsweise .6,5 bis 7,5 gezüchtet. Das Nährmedium enthält üblicherweise Kohlenstoffquellen, wie Stärke, Dextrin, Maltose, Glucose, Lactose oder Glycerin, und organische oder anorganische Stickstoffquellen _} wie Proteine oder ihre Hydrolysate oder Ammoniak bzw. Ammoniumverbindungen. Dem Nährmedium können ferner Mineralsalze, wie Kaliumphosphat und Magnesiumsulfat, sowie Schaumunterdrücker, z.'B. ein Silikon,einverleibt werden. Die Züchtung wird im allgemeinen etwa 3 Tage durchgeführt, danach wird das Thermozymocidin aus der Gärmaische in an sich bekannter Weise isoliert. Zu diesem Zweck wird die Gärmaische entweder zentrifugiert oder filtriert. Das Myeel wird mit Methanol oder Aceton oder einem Gemisch aus. diesen Lösungsmitteln extrahiert. Der Extrakt wird zu dem beim Zentrifugieren erhaltenen Überstand bzw. dem beim Filtrieren erhaltenen Filtrat gegeben.. Die gebildete Fällung wird durch Biatomesnerde filtriert und das Filtrat mit einem schwach-soiren oder schwadi-basisehen Ionenaustauscher behandelt.

wird Das am Ionenaustauscher adsorbierte Antibiotikum'fraktionierend

eluiert* Bie aktiven Fraktionen werden vereinigt, unter vermin-

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dertem Druck eingedampft und durch Chromatographie an Kieselgel weiter gereinigt. Das Eluat wird eingedampft und der Rückstand zur weiteren Reinigung umkristallisiert. Thermozymocidin ist ein weißes Pulver, das bei 168 bis 17O⁰C unter- Zersetzung

schmilzt, ßj * = + 40 - S (c = 0,12 in Pyridin). Im UV-Absorp-

D
tionsspektrum zeigt sich ein Maximum bei 206 nin (in Methanol).

IR-Absorptionsspektrum v_max: 3375, 3180, I710, 1665, 1605 und 1570 cm (Paraffinöl).

C₂₁H₃₉NO₆; ber.: C 62,81 ,H 9,79, N 3,39

gef. : C 62,64 , H 10,38, N 3,48.

Positive Reaktionen: Ninhydrin (negativ nach Acetylierung), Dinitrophenylhydrazin, Perjodat.

Negative Reaktionen: Polin, Biuret, Sakaguchi, Anthron, Naphthoresorein, Triphenyltetrazol und Silbernitrat.

Das kernmagnetische Resonanzspektrum in Deuterochloroform eines durch Umsetzen mit Essigsäureanhydrid in Pyridin erhaltenen Polyacetyl-Derivats zeigt folgende Signale: 2,02 (S, 3)} 2,05 (S, 3); 2,1 (S, 3); ^,53 (S₁ 2); 4,75 (m, 1); 5,05 (m, 3)i 5,8 (d, 2); 6,12 (m, 1) ppm. Außerdem treten komplexe Signale auf, die 24 Protonen entsprechen, die von 0,8 bis 2,6 ppm reichen.

Löslichkeitsverhalten: Thermozymoeidin ist in Petroläther, Diäthylather und Benzol unlöslich, in Äthylacetat, Isoamylacetat, Aceton und Wasser sehr schwer löslich, in Dimethylformamid, Chloroform, Pyridin, Methanol und n-Butanol nur bis zu einer

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-S-

Konzentration von 0,05 "bis 0,2 Prozent löslich, in Dimethy1-sulfoxid bis zu einer Konzentration von etwa 0,4- Prozent löslich, in 0,1n Natronlauge bis zu einer Konzentration von etwa 1 Prozent löslich. Ferner ist die Verbindung in Essigsäure so- ~ wie in heißer 2n Salzsäure löslich.

In Fig. 1 ist das IR-Absorptionsspektrum von Thermozymoeidin wiedergegeben.

Thermozymocidin ist eine sehr beständige Verbindung. Die anti-

i_auf . 5Q.°C.' biotische Aktivität bleibt selbst nach 2tägigem Erwärmen /in wäßrig-alkoholischer Lösung bei einem pH-V/ert von 2 bis 10 erhalten. Lösungen von Thermozymoeidin in Alkohol sind bei 1monatiger Lagerung bei 4°C stabil. Das Antibiotikum wird durch Einderserum nicht inaktiviert. Die akute Toxizität wäßriger Präparate von Thermozymocidin bei intraperitonealer Injektion an Albino-Mäusen beträgt 5 mg/kg. Die LDc₀ beträgt etwa 8 mg/kg.

Das Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel

Aus zwei Schrägagarröhrchen einer 2 bis 3 Tage alten, mit 5 bis 10 ml physiologischer Kochsalzlösung gewaschenen Kultur des Mikroorganismus Albomyces ATCC 20 349 auf einen Kartoffel-Agar-Glucose-Hefeextrakt-Nährboden, wird eine Suspension hergestellt. Diese

Suspension wird in einen 750 ml fassenden Erlenmayer-Kolben überimpft, der 100 ml eines Nährmediums folgender Zusammensetzung enthält:

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Maismehl 30 g

3 g

^ TH₂ ⁰ °'^{5 S}

Leitungswasser bis 1000 - ml.

Dieses Nährmedium wird auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und 30 Minuten bei 121°C sterilisiert. Nach dem Abkühlen auf 40⁰G und Beimpfen wird der Erlenmayer-Kolben auf einer Drehschüttelmaschine 36 bis 48 Stunden bei 120 U/min und einem Hub von 8 cm geschüttelt. Die Temperatur wird durch einen Thermostaten auf 40 bis 43^OC eingestellt. Die aus 3 bis 5 Erlenmayer-Kolben erhaltene Kulturbrühe wird zum Beimpfen eines 10 Liter fassenden Fermenters verwendet, der 5 Liter des vorgenannten Nährmediums enthält. Hierauf wird die Flüssigkeit 48 Stunden bei 40⁰G auf der Drehschüttelmaschine mit 400 U/min inkubiert. Es werden 0,5 Liter Luft pro Liter pro Minute eingeleitet. Die aus diesem Fermenter erhaltene Kulturbrühe wird in einer Menge von 5 Prozent zum Beimpfen von 20 Liter fassenden Fermentern verwendet, die 12 Liter des vorgenannten Nährmediums enthalten. Es werden folgende Fermentierbedingungen eingehalten: Temperatur 40⁰G, Schütteln auf der Drehschütte!maschine mit 500 U/min, Belüftung 0,6 bis 0,8 Liter pro Liter pro Minute. Zur Unterdrückung des Schäumens wird eine Silikonemulsion (Antifoam FG-10) zugesetzt. Nach etwa 80stündiger Fermentation hat das Antibiotikum seine höchste Konzentration, nämlich etwa 80 mg/Liter Gärmaische, erreicht. Die Fermentation wird abgebrochen. Während der Fermentation treten keine nennenswerten Änderungen des pH-Wertes auf. Der End-pH-Wert beträgt 6,8 bis 7,2.

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50 Liter der erhaltenen Gärmaische werden zentrifugiert. Das Mycel wird zweimal mit jeweils 2 Liter Aceton durch 4-stündiges Rühren "bei Raumtemperatur extrahiert. Die vereinigten Acetonextrakte werden in den wäßrigen Überstand eingegossen. Die gebildete hellgefärbte Fällung wird über Diatomeenerde filtriert. Das Filtrat wird auf eine Kolonne gegeben, die mit 5 kg eines schwach-sauren Kationenaustauschers in der Säureform gefüllt ist. Es werden 4 Liter pro Stunde des Filtrats auf die Kolonne gegeben. Das Antibiotikum wird in einer Menge von mindestens 90 Prozent am Kationenaustauscher adsorbiert. Danach wird die Kolonne mit 6 Liter destilliertem Wasser ausgewaschen. Hierauf wird die Kolonne zunächst mit 10 Liter 1n wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Die ersten 5 bis 6 Liter werden abgetrennt. Danach wird die Kolonne mit 5 Liter eines Gemisches gleicher Volumteile 1n wäßriger Ammoniaklösung und Methanol eluiert. Die vereinigten aktiven Fraktionen werden unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur von etwa 8O⁰C auf ein Volumen von 3 Litern eingedampft. Die konzentrierte Fraktion wird danach zweimal mit 1 Liter n-Butanol extrahiert. Die vereinigten Butano!extrakte werden unter vermindertem Druck und bei einer Temperatur von etwa 80⁰G zur Trockene eingedampft. Es hinterbleiben 15 bis 16 g rohes Antibiotikum, das hierauf dreimal mit 150 ml Äthyläcetat behandelt wird. Die inaktive lösliche Fraktion wird abgetrennt. Es hinterbleiben etwa 2,2 g eines gelbstichigweißen Produkts, das an Kieselgel mit einem Gemisch aus Isoamylacetat, Methanol, Ameisensäure und Wasser im Volumverhältnis 65:25:5:5 chromatographiert wird. Das Eluat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird aus einer Mischung von

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Chloroform und Äthanol umkristallisiert. Ausbeute 1,5 g analysenreines Thermozymocidin vom F. 168 bis 17O⁰C (Zersetzung).

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Claims (6)

— Ί 2 — λ 2312698 Patentansprüche

1. Thermozymoeidin der FormeI

OH OH

I I I

CH₃ (CH₂) ₅C- (CII₂) ₆-CH=CH-CH₂-CH-CH-C-COOH O CH₂OII

2. Verfahren zur Herstellung von Thermozymoeidin, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Gattung Myriococcum und der Art Albomyces ATCC 20 34-9 unter submersaeroben Bedingungen in einem üblichen wäßrigen Mhrmedium mit Kohlenstoff- und Stickstoffquellen bei Temperaturen von etwa 26 bis 55°C und in einem pH-Bereich von etwa 5>5 "bis 8;0züchtet und aus der Gärmaische das Thermozymocidin in an sich bekannter Weise isoliert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Stickstoffquellen Proteine oder ihre löslichen Peptone verwendet.

4·. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenstoffquellen Stärke, Dextrin, Maltose, Glucose, Lactose oder Glycerin verwendet.

5· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man

\-Oder_f i 1 tr i.er t J

die Gärmaische zentrifugiert^, das Mycel mit einem Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch extrahiert, den Extrakt eindampft, den Rückstand mit einem schwacfr-sauren oder schwach-.

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basischen Ionenaustauscher behandelt, die aktiven Fraktionen an Kieselgel chromatographisch reinigt, das Eluat eindampft und den Rückstand aus einem organischen Lösungsmittel umkristallisiert.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel Aceton und bzw, oder Methanol verwendet.

7, Arzneimittel, enthaltend Thermozymoeidin sowie übliche- Trägerstoffe und bzw. oder Verdünnungsmittel und bzw. oder Hilfsstoffe.

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