DE2256910C3 - Metallionenbindendes 93 S-A1 -Glykoprotein und seine Verwendung - Google Patents
Metallionenbindendes 93 S-A1 -Glykoprotein und seine VerwendungInfo
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Description
Gegenstand der Anmeldung ist das mctalliohcnbindencJe
9,5-S*Alphat-Glykoproteiri und seine Verwendung
als Antigen gemäß den Ansprüchen I -3.
Das metallionenbindende 9(5-S-AlphafGlykoprotcin
ist bisher nicht bekannt gewesen.
Es besitzt
a) einen Kohlenhydratanteil von 10 bis 16%, vorzugsweise
13%,
b) einen isoelektrischen Punkt im schwachsauren Bereich, vorzugsweise zwischen pH 4,8 und 5,2,
c) eine elektrophoretische Wandung mit den Alphap Glykoprotetnen des Serums,
d) eine Sedimentationskante in der Ultrazentrifuge von
9,5 ±0,5 S,
e) ein Molekulargewicht von 300 000 ±30 000 und
Q die Fähigkeit Calcium-, Barium- und Nickelionen zu binden.
Es besitzt außerdem die Fähigkeit, mit einem
ι ί spezifischen Antiserum zu präzipitieren.
Zur Gewinnung des metallionenbindenden 9,5-S-Alphai-Glykoproteins
kann man Blutserum, vorzugsweise humanen Ursprungs, bei einem pH-Wert von etwa 6 mit
einem Adsorbens behandeln, das gewaschene Adsor-
.·» bens mit einem Salzgradienten oder stufenweise mit
einer Salzlösung eluieren, die Eluate isolieren, diese bei einer geeigneten Proteinkonzentration einer präparativen
Zonenelektrophorese im schwachalkalischen Medium unterwerfen, die Alphai-Globulinzone gewinnen
_'■. und anschließend gegebenenfalls in an sich bekannter
Weise konzentrieren und weiterreinigen.
Das metallionenbindende 9,5-S-Alphai-Glykoprotein
ist herstellbar dadurch, daß man Blutserum, gegebenenfalls mit destilliertem Wasser verdünnt, bei einem
tu pH-Wert von etwa 6 mit einem Adsorbens behandelt, das gewaschene Adsorbens mit einem Salzgradienten
oder stufenweise mit einer Salzlösung eluiert, die das metallionenbindende 9.5-S-Alphai-Glykoprotein enthaltenden
Fluate isoliert und entweder diese zunächst
r> bei einer geeigneten Proteinkon/entration einer präparalivcn
Zonenclektrophoresc im schwach alkalischen Medium unterwirft, die Alphai-Globulinzone gewinnt,
konzentriert und schließlich durch eine Gelfiltration mit einem Molekularsieb diejenige Fraktion gewinnt, die
κι einem Molekulargewicht von 300 000 entspricht, oder
aus dem Fluat zunächst durch Gelfiltration mit einem Molekularsieb diejenige Fraktion gewinnt, die einem
Molekulargewicht von etwa 300 000 entspricht und danach diese Fraktion der präparativen /.onenclektro
η phorcse im schwach alkalischen Medium unterwirft und
die Alpha'-Globulin/one gewinnt.
Besonders gute Frgebnisse werden bei dem An
reichcrungsverfahren er/idt. wenn das Blutserum nut
destilliertem Wasser verdünnt wird, wobei insbesondere
.ei cmc Verdünnung von I Volumen Blutserum mit 1
Volunen Wasser vorteilhaft ist. wenn der pH-Wert bei
der Behandlung mit dem Adsorbens bei etwa b licgl.
wenn das Adsorbens funklioncllc C ,irboxvmethylgnip
pen. vorzugsweise iiuf Cellulosebasis cnihdlt oder wenn
·,, als Adsorbens ( alcmmphosphat oder Bariumsulfat
verwendet wird, wenn zur t.liition des Glykoprolcins
vom Carboxylniclhylioncnauslausthcr das Adsorbens in
cmc Chromalographicsäulc angeschlämmt wird und
ein Salzgradicnt ;ius 1\mmoniun'lhvdrogcni.arbonat
mi Verwendet wird, die tlulion vom üalcitimphosphal oder
Bariumsulfat mil Natriumhydrogcnphösphatlösüng
durchgeführt wird, wenn der pH-Wert bei der
präparalivcn Zöncnelcklrophorcsc cUva 8,6 beträgt,
wenn als Trägcrindditim für die Zönenelcktrophörcsc
μ Polyvinylchlorid, zweckmäßig in Form eines feinkörnigen
Granulats Verwendet wird, wenn die Konzentrierung zwischen den einzelnen Verfahrcnsscliritten mit
Hilfe des Ultrafilters erfolgt und wenn die Wciterreini-
gung des Produkts durch eine Gelfiltration mit einem Molekularsieb dessen Ausschlußgrenze bei einem
Molekulargewicht von etwa 150 000 liegt, erfolgt
Das erfindungsgemäße Verfahren ist einfach im Vergleich zu denen für andere Spurenproteine des
Serums. Die Ausbeute ist mit etwa 60% als gut zu bezeichnen. Das Verfahren beruht im wesentlichen auf
der Bindung des 9,5-S-AIphai-Glykoproteins an das
Adsorbens. Die Bindung an dem Adsorbens mit Kationenaustauschereigenschaften ist ganz ungewöhnlich
und war wegen des sauren isoelektrischen Punktes des Produktes nicht zu erwarten und auch nicht
vorauszusehen. Man erhält erfindungsgemäß ein Produkt, das nach allen Kriterien der Proteinchemie
einschließlich immunologischer Verfahren rein ist Das auf diese Weise aus Humanserum gewonnene Protein
ist ein Glykoprotein mit einer Sedimentationskonstante von etwa 9,5 S, mit einem Molekulargewicht von ca.
300 000 und hat die elektrophoretisch^ Beweglichkeit
eines AlpharProtems. Das so charakterisierte Protein
ist mit keinem bisher beschriebenen identisch. Es zeichnet sich u. a. durch die Fähigkeit aus, pro Mol 5
Atome Nickel unter Ladungsveränderung zu binden und mit 10 Atomen Nickel zu kristallisieren. Das metallionenbindende
9,5-S-AIphai-Glykoprotein ist ein Antigen,
das beispielsweise nach parenteraler Verabreichung bei Kaninchen spezifische Antikörper zu
induzieren vermag. Die quantitative Aminosäureanalyse zeigt für das erfindungsgemäße 9,5-S-Glykoprotein
folgende Werte:
| \ | Baustein | Grenzwerte % | Mittelwerte % |
| Ϊ | Lysin | 5.0- 6.2 | 5,6 |
| Ϊ | Histidin | 1,8- 2,2 | 2,0 |
| Arginin | 4,5-- 5,5 | 5,0 | |
| Aspariginsiiurc | 6.6- 8.0 | 7.3 | |
| i | Threonin | 2.7- 3,3 | 3,0 |
| [ | Serin | 5,0- 6.0 | 5,5 |
| ; | Glutaminsäure | 11,5-14.1 | 12.8 |
| J: | Prolin | 3.7- 5.6 | 4,1 |
| :'' | Glycin | 3.0- 3.6 | i.i |
| Γ | Alanin | 2.1 2.5 | 2.3 |
| '/.' Cystein | 0,4- 0.6 | 0.5 | |
| ι | Valin | 6.0- 7.4 | 6.7 |
| I | Methionin | 0.3 0.5 | 0.4 |
| Isoleucin | 5.3 d.5 | 5,l> | |
| Leucin | 7." 9.5 | 8.7 | |
| Tyrosin | 7.1 8.7 | 7.') | |
| Phenyl,ihnin | 5.0 6.2 | 5.6 | |
| tryptophan | 3.3 4.1 | 3,7 |
Der Kohlcnhydratantcil des vorliegenden Glykoproteins
von insgesamt I3± 3% ist gekennzeichnet durch einen Gehalt an I lcxoscn, Acclylhcxosamin, Acclylncurnniinsäurc
und Fucosc,
31 Hiimanseruni werden I : I mit destilliertem
Wasser verdünnt und mit I molarer Essigsäure auf pH 6,0 eingestellt. 120 g Carboxymethylcellulose werdeil als
feuchter Filterkuchen dem Serum zugefügt und die Suspension eine Stunde bei 2O0C gerührt, Anschließend
wird das Adsorbens auf einem Büchner-Filter zurückgewonnen, der Filterkuchen mit Wasser gewaschen und
als wäßrige Suspension in eine Chromaiographiesäule von 1 χ 20 cm überführt Für die Gradienten-Elution der
Säule werden zwei miteinander verbundene Flaschen angeschlossen, von denen die eine 300 ml Wasser und
die andere 300 ml 0,5 M Ammoniumhydrogencarbonat-Lösung
enthält Das Eluat wird kontinuierlich im Durchflußphotometer gemessen und in 3,5-mI-Mengen
gesammelt. Die Eluatkurve zeigt 3 Gipfel, von denen der dritte das erfindungsgemäße Protein enthält Die
Fraktionen, die zu dem Eluatgipfel gehören, werden zusammengegossen, auf dem Ultrafilter auf etwa 3%
Eiweiß konzentriert und gegen eine 0,075 M Ammoniumhydrogencarbonatlösung dialysiert. Die Lösung wird
anschließend in einer präparativen Zonenelektrophorese mit Polyvinylchlorid (Geon X 427 von Serva,
Heidelberg) als Träger bei 4 V/cm in 15 Stunden aufgetrennt. Die Alphai-GIobulinzone wird mit Ammoniumhydrogencnrbonat-Lösung
vom Träger eluiert und auf dem Ultrafilter konzentriert.
Die elektrophoretische Beweglichkeit des erfindungsgemäßen
Glykoproteins ist durch Kationen, wie Calcium, Barium und Nickel zu verringern; diese
J-. Beeinflussung ist durch Komplexbildner, wie Äthylendiamintetraessigsäure
wirder aufzuheben.
Gewünschtenfalls läßt sich das erfindungsgemäße Glykoprotein in Verbindung mit Kationen insbesondere
in Gegenwart von Calcium-, Barium- und Nickelionen »ι kristallisieren.
Zu einem Liter Serum werden 10 g Calciumphosphat gegeben, eine Stunde gerührt und danach abgcschleu-
i> den. Das Sediment wird mit dem gleichen Volumen
0.9%iger Kochsalzlösung gewaschen, erneut abgeschleudert und das Sediment mit 0.33 M Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung
desorbiert. D, 5 Eluat wird durch Ultrafiltration konzentriert und über eine
i" Sephadex/G-150-Säulc gegeben. Die mittlere Fraktion,
die das Glykoprotein enthält, wird gewonnen. Es schließt sich wieder eine Konzentrierung durch
Ultrafiltration an, anschließend wird gegen Barbitalpuffer pH 8,6 dialysieri und im gleichen Milieu einer
r. Zonenelektrophorese in Polyvinylchlorid unterworfen.
Es wird die Alphai-Fraktion gewonnen, die Salze durch Dialyse entfernt und die Lösung (lurch Ultrafiltration
ankondensiert.
In einem entsprechenden Versuch, der mit einem
>ii Liter Serum und 50 g Bariumsulfat ausgeführt worden
ist. wurde ebenfalls reines metallionenbindcndcs 9.5-S-Alphai-Cilykoprotcin
mit einer Ausbeute von etwa 60% erhallen.
■, B c i s ρ i e I 3
Herstellung von Antiserum
Kaninchen wird an 5 aufeinanderfolgenden Tagen jeweils 10 ng des Antigens in ca. 3 ml 0.05%iger
wf Acrosil-Suspcnsion i.V. appliziert und nach 10tägii?cr
Pause die sogenannte Boostcrung mit den gleichen Anligenmchgen über den gleichen Zeitraum durchgeführt.
5 Tage später werden die Tiere entblutet, das Plasma gewonnen und der Anlikörpertiter bestimmt.
Fürdic Immunelektrophorese wird eine Plasmaprobe in einem A ga rf ihn elektrophoretisch aufgetrennt.
I 5 6
|· Anschließend wird von einer in den Film gestanzten dabei entstehenden ringförmigen Präzipitatzonen kor-
6 Rille das Antiserum zur Diffusion gegen die zuvor relieren in ihrem Durchmesser mit der Konzerns ation
<e aufgetrennten Proteine eingefüllt. Dort, wo der des Antigens in der Probe.
: Antikörper auf das korrespondierende Antigen stößt. Die Eiektroimmundiffusion erfolgt nach dem gleichen
ν kommt es zu einer Immunpräzipitation, die spezifisch "■ Prinzip in antikörperhaltigem Agar mit dem Unterfür
das Protein ist. schied, daß die Diffusion durch ein elektrisches
; Für die radiale Immundiffusion verwendet man ein Spannungsfeld beschleunigt wird. Demzufolge entstell
antikörperhaltiges Agar, in das man die Probe von hen dabei Präzipitatlonsgipfel,deren höhein Beziehung
i einem v&rgestanzten Loch eindiffundieren läßt. Die zur Konzentration steht.
Claims (3)
1. Metallionenbindendes 9,5 S-AlphapGlykoprotein
mit
A einemKohlenhydratanteilvon 13±3%,
B einem isoelektrischen Punkt bei ρH 5,0 ± 0,2,
C einer elektrophoretischen Wanderung mit den
Alphai-GIykoproteinen des Serums,
D einer Sedimentationskonstanten in der Ultrazentrifuge von 9,5 ± 0,5 S,
E einem Molekulargewicht von 300 000±30 000 und
D einer Sedimentationskonstanten in der Ultrazentrifuge von 9,5 ± 0,5 S,
E einem Molekulargewicht von 300 000±30 000 und
F der Fähigkeit, Calcium-, Barium- oder Nickelionen
zu binden, herstellbar dadurch, daß
a) man Blutserum gegebenenfalls mit destilliertem Wasser verdünnt,
b) bei einem pH-Wert von etwa 6 mit einem Adsorbens behandelt,
c) das gewaschene Adsorbens mit einem Salzgradienten oder stufenweise mit einer Salzlösung
eluiert. die das metallionenbindende 9,5-S-Alphai-Glykoprolein enthaltende Eluate
isoliert,
d) diese zunächst bei einer geeigneten Proteinkonzentration einer präparativen Zonenelektrophorese
im schwachalkalischen Medium unterwirft.
e) die Alphai-Globulinzone gewinnt, konzentriert
und schließlich durch eine Gelfiltration mit einem Molekularsieb diejenige Fraktion
gewinnt, die einem Molekulargewicht von etwa 300 000 entspricht
2 Verfahi cn /um Herstellen des metallionenbindcnden
9.5-S-Alpha.Glykoprotcins, dadurch gekennzeichnet,
daß man
a) Blutserum gegebenenfalls mit destilliertem Wasser verdünnt.
b) bei einem piI-Wert von etwa 6 mit einem
Adsorbens behandelt.
c) das gewaschene Adsorbens mit einem Sal/gradientcn
oder stufenweise mit einer Salzlösung eluiert. die das metallionenbindende 9.5-S- Alpha ι ·
Glyk'iprotein enthaltende Elualc isoliert.
d) aus diesen zunächst durch Gelfiltration mit einem
Molekularsieb diejenige Fraktion gewinnt, die einem Molekulargewicht von ca 300 000 ent
spricht, und danach diese Fraktion der praparativcn Zonenelcklrophorcsc im schwach alkalischen
Medium unterwirft und die Alpha -Globulinzone gewinnt
3. Verwendung des metallionenbindendcn 9,5 S-Alphai-Glykoproteins
nach Ansprüchen I und 2 als Antigen zum Induzieren spezifischer Antikörper
oder zum Präzipiticren des spezifischen Antiserums.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2256910A DE2256910C3 (de) | 1972-11-20 | 1972-11-20 | Metallionenbindendes 93 S-A1 -Glykoprotein und seine Verwendung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2256910A DE2256910C3 (de) | 1972-11-20 | 1972-11-20 | Metallionenbindendes 93 S-A1 -Glykoprotein und seine Verwendung |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2256910A1 DE2256910A1 (de) | 1974-06-12 |
| DE2256910B2 DE2256910B2 (de) | 1979-10-31 |
| DE2256910C3 true DE2256910C3 (de) | 1980-07-10 |
Family
ID=5862264
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE2256910A Expired DE2256910C3 (de) | 1972-11-20 | 1972-11-20 | Metallionenbindendes 93 S-A1 -Glykoprotein und seine Verwendung |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE2256910C3 (de) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2949407A1 (de) * | 1979-12-07 | 1981-06-11 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur gewinnung von (alpha) -2-sb-glykoprotein |
-
1972
- 1972-11-20 DE DE2256910A patent/DE2256910C3/de not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE2256910B2 (de) | 1979-10-31 |
| DE2256910A1 (de) | 1974-06-12 |
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