DE2253482A1

DE2253482A1 - Reagenz zur bestimmung von glucose

Info

Publication number: DE2253482A1
Application number: DE2253482A
Authority: DE
Inventors: William Spyros Stavropoulos; Bernard James Thiegs
Original assignee: Dow Chemical Co
Current assignee: Dow Chemical Co
Priority date: 1971-11-01
Filing date: 1972-10-31
Publication date: 1973-05-03
Also published as: CA961746A; US3711250A; NL7214723A; BE790826A; GB1400729A; FR2159921A5; JPS4853796A; IT976407B

Description

Die Erfindung betrifft eine Verbesserung von o-Toluidin-Reagenzien sowie ein Verfahren zur Bestimmung der Glucose-Konzentration in biologischen Flüssigkeiten. Durch die Erfindung wird eine gleichförmige Farbintensität bei- der. Umsetzung mit Glucose unabhängig von Verunreinigungen mit geringen Eisenmengen erzielt.

Die Bestimmung von Glucose in biologischen Flüssigkeiten unter Verwendung eines o-Toluidin-Reagenzes ist in vielen Krankenhaus-, industriellen- und Handelslaboratorien eine eingeführte Methode. Diese Methode baut sich auf der Färbung auf, welche bei der Umsetzung von Glucose mit o-Toluidin in Eisessig bei kurzem Erhitzen gebildet wird. Die Intensität der resultierenden

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blau-grünen Färbung wird photometrisch gemessen. Vergleiche Dubowski, Clin.Chem. 8j 215 (I962) und Hyvarinen et al., Clin.Chim.Acta 7; 3Ao (1962).

Die herkömmlichen o-Toluidin-Reagenzien enthalten im allgemeinen 5 bis Io g o-Toluidin in Eisessig je loo ml. Sie enthalten oftmals eine geringe Menge von Thioharnstoff, gewöhnlich in einer Konzentration von o,l bis 1 g je loo ml, um eine nachfolgende Verfärbung des Reagenzes zu vermeiden. Die Reagenzien können auch geringe Mengen von Hydrazin, gewöhnlich 60 bis 2oo Mikromol enthalten, um bei verschiedenen Ansätzen der Reagenzmischung eine gleichförmige Farbbildung zu ergeben.

Die Glucose-Bestimmung wird gewöhnlich mit biologischen Flüssigkeiten wie Serum, Plasma oder Urin durchgeführt. Es kommt aber auch vor, daß Gesamtblut, Liquor Cerebrospinalis, Milch und andere biologische Flüssigkeiten analysiert werden müssen. Ein vorgewähltes Volumen der Probeflüssigkeit, im allgemeinen o,loo ml wird mit einem vorgewählten Volumen der Ortho-toluidin-Reagenzmischung im allgemeinen JJ bis 5 ml in einem geeigneten Behälter, beispielsweise einer Kolorimeter-Cuvette oder einem Reagenzglas vermischt. Das Gemisch wird sodann zur Ausbildung der Farbe typischerweiöe in einem Heizblock oder in einem siedenden Wasserbad über eine vorgewählte Zeitspanne, gewöhnlich 7 bis Io Minuten auf loo°C erhitzt. Sodann wird die Intensität der erhaltenen blau-grünen Färbung photometrisch in einem Spektrophotometer oder einem Kolorimeter bei einer Wellenlänge von 59o bis 625 m/U oder Nanometer gemessen und mit einer Standard-Glucoselösung oder einer Eichkurve verglichen.

Die Farbintensität, die bei der o-ToluUin-Farbreaktion gebildet wird, wird durch die Anwesenheit von geringen Eisenmengen drastisch vermindert. Eisen kann aber in variierenden Mengen als Verunreinigung in Ampullen, Cuvetten, Pipetten oder anderen

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Glasgegenständen,.welche zur Herstellung des Reagenzes oder ■ der Probe "benutzt werden, vorhanden sein. Dieses Element kann auch als Verunreinigung mit einem der Bestandteile des Reagenzes eingeschleppt werden. Weiterhin kann es in variierenden Mengen von dem Wasser eingeführt werden, welches zum Waschen oder Spülen der Labor-Glasgegenstände verwendet wird* Variierungen des Grades der Eisenverunreinigung können unerwünschte Variierungen der Farbintensität von Ansatz zu Ansatz derReagenzmisehung oder von Test zu Test bewirken* Es stören die Farbreaktion sowohl die Eisen (H)- als auch die Eisen(Hi)-ionen. Aufgrund der sauren Natur der Reagenzmisehung führt auch die Berührung mit metallischem Eisen zu Störungen. Die Störungen, die von den Eisenverunreihigungen herrühren, manifestieren sich durch- eine verminderte End-Absorption. Es ist beobachtet worden, daß bereits Eisenmengen in der Gegend von 1 bis 2 ppm die End-Absorption um J5o bis 5o$ vermindern, so daß die Analysenergebnisse entsprechend niedriger ausfallen« Diese Störungen können, wenn sie unentdeekt und nicht korrigiert bleiben, zu einem signifikanten Risiko von Fehldiagnosen aufgrund der fälschlich zu niedrigen Ergebnisse führen*

Es besteht daher ein Bedarf nach einer einfachen Verbesserung, wobei o-Toluidin-Reagenzien, welche die Regulierung der mit Glucose ausgebildeten Färbung unter Erhalt einer gleichförmigen Absorption von Ansatz zu Ansatz, von Probe zu Probe und von Test zu Test,, unabhängig von der Eisenverunreinigung, ermöglicht. . ' ■ ' ■ - . .

Es wurde nun gefunden, daß die Farbintensität, die sich bei Glueose-Bestimmungen mit der herkömmlichen o-Toluidin-Reagenzmischung entwickelt, in Gegenwart von Eisen in den üblicherweise vorkommenden Konzentrationen (z.B. bis zu etwa Io Gew.-Teilen Eisen Je Million Gew.-Teile der Reagenzmisehung) gleichförmig gemacht werden kann. Diese Gleichförmigkeit kann durch

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Zugabe einer geringeren Menge von Oxalsäure, Polyphosphor-.säure oder einem Gemisch davon zu der Reagenzmischung vor der Entwicklung der Farbe, vorzugsweise vor dem Vermischen der Reagenzmischung mit der Glucose erreicht werden.

Die Zugabe von Oxalsäure oder Polyphosphorsäure zu der Reagenzmischung in einer genügenden Menge, daß Störungen durch Spurenmengen von Eisen vermieden werden, ergibt eine Reagenzmischung, welche eine konsistenz gleichförmige Absorption und Farbintensität unabhängig von der Anwesenheit oder dem Fehlen von Spurenmengen von Eisen in dem End-Farbreaktionsgemisch ergibt. Dabei werden die Störungen unabhängig vom Wertigkeitszustand (ob Eisen(Il)-oder Eisen(III)-ionen) der Eisenverunreinigungen verhindert.

Bei der Formulierung und bei der Verwendung von o-Toluidin-Reagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Reagenzmischung mit dem gleichen o-Toluidin und dem Eisessig und mit Thioharnstoff und Hydrazin und (gewünschtenfalls) anderen Bestandteilen in den gle-ichen Mengen hergestellt werden, in welchen die Reagenzien typischerweise verwendet werden. Die Glucose-BeStimmung kann in identischer Weise bei Verwendung der gleichen Mengen der Reagenzmischung und des Glucose-Standards oder der Probe wie bislang durchgeführt werden, wobei die einzige Modifizierung dahin geht, daß der Reagenzmischung eine genügende Menge Oxalsäure, Polyphosphorsäure oder eines Gemisches davon zugesetzt wird, daß nach einer maximalen Farbentwicklung über einen Bereich von Eisenkonzentrationen von 0 bis Io Teilen Eisen je Million Teile der Reagenzmischung eine im wesentlichen gleichförmige End-Absorption erzielt wird. Die Oxalsäure oder die Polyphosphorsäure kann zu jedem beliebigen Zeitpunkt vor der Farbentwicklung bei der Formulierung des Reagenzes zu der Reagenzmischung zugesetzt werden. So kann man beispielsweise die Zugabe unmittelbar vor der Zugabe einer* Probe oder einer Glucose-Standardlösung oder nach einer solchen

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Zugabe, aber vor dem Erhitzen, um die Farbe auszubilden, vornehmen. Diese Säure-Komponente wird vorzugsweise zu den "anderen Bestandteilen gegeben, indem die erforderliche Menge der Säure mit dem o-Toluidin und den anderen Bestandteilen während der Formulierung des Reagenzgemisches vermischt wird, so daß die zu verwendende fertige Mischung eine genügende Menge der Säure-Komponente enthält, daß sie von Störungen durch Eisen geschützt ist. Es sollte eine genügende Menge der Säure-Komponente verwendet werden, daß die mit einer gegebenen GIucosemenge erhaltene End-Absorption (innerhalb der Fehlergrenze) in Gegenwart von Eisenkonzentrationen von 0 ppm bis zu dem erwarteten maximalen Eisengehalt von im allgemeinen etwa Io ppm im wesentlichen gleich ist. Im allgemeinen sollte die End-Absorption unabhängig von der Gegenwart oder Abwesenheit von Eisen bei einer Verläßlichkeit von 95$ statistisch gleichförmig erscheinen. Die resultierende Mischung ist von Störungen durc-h Eisenverunreinigungen gut geschützt.

Die Oxalsäure- oder Polyphosphorsäure-Komponente wird gewöhnlich in einer Menge von o,ol g Säure je loo ml der Reagenzmischung bis zur Sättigung der Mischung mit der Säure verwendet. Es ist im allgemeinen unnötig, die Säure-Komponente in einer größeren Menge als etwa 1 g je loo ml zu verwenden. Bevorzugt werden Mengen von o,o5 bis o,5 g je loo ml der fertigen Reagenzmischung. Andere Säuren wie Äthylendinitrilo-tetraessigsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Adipinsäure, Maleinsäure, Phthalsäure, Zitronensäure oder Phosphorsäure sind unwirksam, um die Störungen, die durch Eisenverunreinigungen verursacht werden, zu verhindern.

In der Praxis geht man so vor, daß man die relativen Verhältnismengen der anderen Komponenten in dem Reagenzgemisch sowie die Parameter des Analysenverfahrens, beispielsweise die .Verhältnismengen des Reagenzgemisches, und des Standards oder der^ Probe, die Erhitzungszeit und die Temperatur für die Farbent-*

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wicklung oder die Wellenlänge des Lichts, bei welcher die Parbintensität gemessen wird, gemäß den bekannten Methoden festlegt. Die o-Toluidin-Reagenzmischung und die Methode der Glucose-Bestimmung sind für die Bestimmung von Glucose durc-h Umsetzung mit o-Toluidin als wesentliches farbbildendes Reagenz herkömmlicher Natur. Vorzugsweise enthält die Reagenzmischung 5 bis Io g o-Toluidin je loo ml der Endmischung und etwa o,l bis etwa 1 g Thioharnstoff je loo ml, wobei der Rest der Mischung aus Eisessig mit der erforderlichen Menge von Oxalsäure oder Polyphosphorsäure und gegebenenfalls einer geringen Hydrazinmenge, welche zur Kontrolle der gewünschten End-Absorption zugegeben wird, besteht. Eine bevorzugte Mischung enthält etwa 9 g o-Toluidin, o,5 g Thioharnstoff, 6o bis 2oo mMol Hydrazin und etwa o,ol bis o,5 g Oxalsäure oder Polyphosphorsäure in einer solchen Eisessigmenge, daß ein Endvolumen von loo ml erhalten wird.

Eine solche Reagenzmischung wird vorzugsweise bei der Glucose-Bestimmung in der Weise verwendet, daß 1 Volumenteil einer biologischen FlUssigkeitsprobe oder einer Glucose-Standardlösung mit 3o bis 5o Volumenteilen der Reagenzmischung vermischt wird, daß das Gemisch in einem Reagenzglas,in einem Heizblock oder einem Wasserbad etwa 7 Minuten auf eine Temperatur von etwa loo°C erhitzt wird und daß hierauf in einem kalten Wasserbad (Temperatur des Wasserbads unterhalb 25°C) etwa 3 Minuten lang abgekühlt wird, bevor die Parbintensität mit Licht einerWellenlänge von 59° bis 625 mM (Nanometer) bestimmt wird. Bei Verwendung einer solchen Reagenzmischung und unter Anwendung dieser Methode wird unabhängig von Eisenverunreinigungen eine ausgezeichnete Gleichförmigkeit der End-Absorption erhalten.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.

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Beispiel 1:

Es wurde eine Reihe von o-Toluidin-Reagenzmischungen durch Zusammenmischen der folgenden Bestandteile in folgenden Verhältnismengerj. hergestellt}

Reagenz A	9,o	•	9,o	ε	ml
o-Toluidin *	0,5	0,5	ε
Thioharnstoff	auf	l,o	loo
Eisessig		o,l
Reagenz B	9,o	auf	ε
o-Toluidin ⁵^	ö,5		ε	ml
Thioharnstoff	l,o	9,o	ε
2oo ppm Fe⁺⁺-L8sung **	auf	o,5	loo
Eisessig	0,1
Reagenz C	1,0	ε
o-Toluidin *	, auf	ε
Thioharnstoff		ml	ml
2oo ppm Pe -Lösung**	ε
Oxalsäure	loo
Eisessig
Reagenz D	ε
o-Toluidin *	ε
Thioharnstoff	ε	ml
Oxalsäure	ml
destilliertes Wasser	loo
Eisessig

* rait einer geringen Menge Hydrazin (weniger als o,

** Lösung von l4o mg Fe(NH₁^)₂(SO^)₂*6H₂O in loo ml ο,Ι η Schwefelsäure

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Jedes Reagenz würde im Doppelversucht mit ο,ΐοο ml einer wässrigen Glucose-Standardlösung mit loo mg Glucose je loo ml untersucht. In 3 Ampullen wurden jeweils 5 ml der Reagenzmischung gegeben, wobei eine Ampulle als Leerprobe verwendet wurde. Zu den zwei restlichen Ampullen wurden Jeweils loo Mikroliter Glucose-Standard gegeben. Diese beiden Ampullen wurden verschlossen, und die Bestandteile wurden durch etwa 5-sekUndiges Schütteln gut durchgemischt. DieAmpullen wurden sodann 7 Minuten in einen Heizblock von loo°C gebracht. Hierauf wurden sie entnommen und 3 Minuten in einem kalten Wasserbad abgekühlt. Die Intensität der durch den Glucose-Standard erhaltenen blau-grünen Färbung wurde sodann bei 595 Nanometer unter Verwendung eines photoelektrischen Kolorimeters bestimmt (das Instrument war zuvor unter Verwendung der Ampulle mit der nicht behandelten Reagenzmischung auf eine Absorption von 0 eingestellt). Die erhaltenen Ergebnisse sind unten angegeben.

Reagenzmischung	A	(Kontrolle)	Absorption χ loo	mittlere Absorption χ loo
Reagenz	B	(auf 2 ppm Fe⁺⁺)	VjJVjJ ro ι- O OO	31,9
Reagenz	C	(o,l# Oxalsäure + 2 ppm Fe++)	16,9 17,6	17,3
Reagenz	D	(o,l# Oxalsäure)	32,ο 31,5	31,8
Reagenz	KNKN CVJCU KNKN	32,3

Diese Werte zeigen die erhebliche Verminderung der Absorption, die bereits bei relativ geringen Graden einer Eisenverunreinigung bewirkt wird. Die Ergebnisse zeigen weiterhin die sehr guten Korrektionen, welche durch die Zugabe von Oxalsäure erzielt werden.

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Beispiel 2: . .

In ähnlicher Weise wurden H- Reagenzraischungen E, P, G und ■ H hergestellt und untersucht. Die Zusammensetzungen der Reagenzien und die erhaltenen mittleren Absorptionen sind unten angegeben.

mittlere Absorption Reagenz E . χ loo

o-Toluidin 9>ofo (Gew.-/Vol.) Thioharnstoff o,5# (Gew.-/Vol.) Eisessig auf loo Vol.-Ji - . 33,9

Reagenz F

o-Toluidin 9,o# (Gew.-/Vol.) Thioharnstoff o,5# (Gew.-/Vol.) 2ooo ppm Pe

Lösung^ o,l# (Vol.-AoI».}

Eisessig auf loo Vol.-# 15,6

Reagenz G

o-Toluidin¹ .. 9,oji (Gew.-AoI.)

Thioharnstoff o,5# (Gew.-AoI.)

Polyphosphorsäuren ο, 1% (Gew. - A⁰^ ·)

2ooo ppm Pe⁺⁺⁺-

Lösung² o,l# (Vol.-AoI.)

Eisessig auf loo Vol.-Ji 33,5

Reagenz H »· ■

o-Toluidin 9»o% (Gew.-Aol.) Thioharnstoff o,5# (Gew.-AoI.) Polyphosphorsäuren o,l^ (Gew.-AoI.) Eisessig auf loo Vol.-Ji 33,9

"^(Gew.-/Vol.)" entspricht g je loo ml o-Tolu:
0,1 %)

o-Toluidin mit einer geringen Hydrazinmenge (weniger als

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- Io -

- Io -

Lösung von ο,97 g PeCl₅ · 6H₃O in loo ml Eisessig. Die

Endkonzentration von Eisen in dem Reagenz entspricht 2 ppm. ^ Polyphosphorsäure (ungefähr HgPhO,^) mit etwa 82 bis 84$

P₂O₅.

Beispiel 3;

Weiterhin wurde eine Reagenzmischung ähnlich wie Reagenz A des Beispiels 1 hergestellt. Aliquote Teile dieser Mischung wurden mit einer Eisen(III)-Chloridlösung und verschiedenen Mengen von Oxalsäure vermischt, um eine Eisenverunreinigung von 2 ppm Eisen zu erhalten. Die Mischungen wurden mit identischen Qlucose-Standardlösungen wie oben beschrieben untersucht. Nachstehend sind die Mengen von Eisen und Oxalsäure und die erhaltenen Ergebnisse, ausgedruckt als Absorption χ loo zusammengestellt.

Elsen (ppm) Oxalsäure {% Gew.-/Vol.) mittlere Absorption

0 0 32,1

0 0,1 33.2

2 ο 16,2

2 0,05 3I.I

2 o,l 32,8

2 o,2 33.*

2 0,3 - 32,9

2 * o,4 32,5

2 o,5 32,2

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Claims

Patentansprüche

1.) Reagenz zur Bestimmung von Glucose durch Messung

aer Farbintensität, welche durch Umsetzung der Glucose mit o-Toluidin gebildet wird, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Lösung von o-Toluidin und von o,ol g je loo ml bis zur Sättigung von Oxalsäure oder/und Polyphosphorsäure als Säure-Komponente in Eisessig darstellt,

2. Reagenz nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß es o,o5 bis o,5 g der Säure-Komponente je loo ml der Mischung enthält.

3· Reagenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß das o-Toluidin in Mengen von 5 bis Io g je loo ml der Mischung vorhanden ist.

4. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3* dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich o,l bis 1 g Thioharnstoff je loo ml der Mischung enthält.

$.· Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis H-, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich 6o bis 2oo mMol Hydrazin enthält. -

6. Verwendung des Reagenzes nach einem der Ansprüche

1 bis 5 zur Bestimmung von Glucose durch Messung der Farbihtensität, welche durch Umsetzung von Glucose mit o-Toluidin gebildet wird.

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