DE2253031C2

DE2253031C2 - Antibiotikum Salinomycin, Verfahren zu dessen Herstellung und Anticoccidium-Mittel

Info

Publication number: DE2253031C2
Application number: DE2253031A
Authority: DE
Inventors: Yukio Ageo Saitama Miyazaki; Junsaku Nagatsu; Hideo Tokyo Saito; Mitsuo Tokyo Shibuya; Hideo Saitama Sugawara; Yoshiaki Tanaka
Original assignee: Kaken Chemical Co Ltd
Current assignee: Kaken Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1972-03-03
Filing date: 1972-10-28
Publication date: 1982-07-29
Also published as: GB1378413A; FR2173891A1; JPS4888215A; CA975316A; DE2253031A1; JPS4927328B2; FR2173891B1

Description

OH

CH

NaOOC

Infrarot-Absorptions-Spektrum: gemäß F i g. 2.

2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Salinomycin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces albus 80 614 (ATCC Nr. 21 838 und FERM-P Nr. 419) in einem für die Aktinomycetes-Kultur üblichen flüssigen Medium im Submers-Verfahren kultiviert und danach das

Salinomycin aus der Kulturbrühe mit Butylacetat oder Chloroform oder aus dem Myeelkuchen mit einem organischen Lösungsmittel bei pH 8 extrahiert und danach durch Chromatographie an Aluminiumoxid und Gelfiltration reinigt

3. Anticoccidium-Mittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an dem Antibiotikum Salinomycin gemäß Anspruch 1.

Die Erfindung betrifft das Antibiotikum Salinomycin sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung und ein Anticoccidium-Mittel.

Es sind bereits verschiedene Verbindungen bekannt (Clopidol; Robenidinhydrochlorid; Amprolium und Ethopabat), welche gegen Coccidien wirksam sind. Sie zeigen jedoch keine Breitbandwirksamkeit, und sie haben schädliche Nebenwirkungen auf den Darmtrakt.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Antibiotikum zu schaffen, welches gegen ein breites Spektrum von Coccidien wirksam ist und keine schädlichen Nebenwirkungen zeigt.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Antibiotikum Salinomycin in Form seines Natriumsalzes mit den folgenden Eigenschaften gelöst:

farbloses alkalisches Pulver mit dem Schmelzpunkt — 118° C,

optische Drehung [«] ? = -25°C(c= 1, Methanol),

löslich in Alkoholen, Estern, Chloroform, Athern, Tetrachlorkohlenstoff und Hexan, unlöslich in Wasser, stabil bei pH 7 - 9, leicht instabil bei pH unterhalb 5,
Farbreaktion negativ bei Lemieux-Reaktion,
Kaliumpermanganat-Reaktion, Ninhydrin-Reaktion,

Eisen(III)-chlorid-Reaktion und Fehling-Reaktion; positiv bei Jod-Reaktion (rötlich-braun),
Molekulargewicht: C₄₂H₆₉OnNa 772 (Na-Typ),
Strukturformel:

OH

NaOOC

CH₂ OH CH₃ CH₂

I I

CH₃ CH₃

Infrarot-Absorptions-Spektrum: gemäß F i g. 2.

,CH₂-CH₃

'CH₃

Die oben angegebene Struktur war am Anmeldelag noch nicht ermittelt worden, ist jedoch am ursprünglich erhaltenen und offenbarten Produkt feststellbar und steht im Einklang mit den übrigen in Anspruch 1 angegebenen Parametern.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung dieses Antibiotikums ist dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces albus 80 614 (ATCC Nr. 21 838 und FERM-P Nr. 419) in einem für die Aktionomycetes-Kultur üblichen flüssigen Medium im Submei 3-Verfahren kultiviert and danach das Salinomycin aus der Kulturbrühe mit Butylacetat oder Chloroform oder aus dem Mycelkuchen mit einem organischen Lösungsmittel bei pH 8 extrahiert und danach durch Chromatographie an Aluminiumoxid und Gelfiltration reinigt

Das erfindungsgemäße Anticoccidium-Mittel mit einem Gehalt an Salinomycin eignet sich insbesondere zur präventiven und therapeutischen Behandlung von Geflügel (Hühner).

Zur Kultivierung wendet man vorzugsweise die aerobe Rührkuitur an. Die Temperatur liegt vorzugsweise bei 25 bis 30⁰C. Es sind Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze, geringe Mengen organischer Komponenten und Antischaummittel erforderlich. Die größte Konzentration von Salinomycin wurde nach 72 bis 120 h nach Beginn der Kultivierung beobachtet.

Salinomycin ist in verschiedenen organischen Lösungsmitteln löslich. Daher wird es durch Lösungsmittelextraktion isoliert. Salinomycin findet sich sowohl im Mycel-Kuchen als auch im Filtrat. Es wird in Gegenwart eines Lösungsmittels, wie Butylacetat, Aceton odsr Chloroform, umgerührt, wobei der Mikroorganismus autolysiert wird. Dabei wird ein pH-Wert von 8 eingestellt. Das Salinomycin wird durch das organische Lösungsmittel extrahiert. Die Lösungsphase wird von der wäßrigen Phase und der festen Phase abgetrennt. Die Salinomycin-Lösung wird im Vakuum konzentriert und durch Säulenchromatographie an Aluminiumoxid gereinigt. Als Entwickler kommen Äthylacetat, Hexan oder eine Mischung derselben in Frage. Das Eluat wird fraktioniert, um die Fraktionen mit großer antibiotischer Aktivität abzutrennen. Diese Fraktionen werden im Vakuum eingeengt. Die Reinigung wird unter Anwendung der Säulenchromatographie mit Gel-Filtrationsmaterial Sephadex LH-20 wiederholt Als Entwickler wird vorzugsweise Aceton eingesetzt. Das Eluat wird fraktioniert, wobei die aktiven Fraktionen abgetrennt und im Vakuum eingeengt werden. Dabei erhält man pulverförmiges, gereinigtes Salinomycin.

Streptomyces albus 80,614 hat eine lange Hyphe, weiche nicht in Stäbchen oder Kugeln unterteilt ist Das Luftmycel des Streptomyces albus 80,614 ist im wesentlichen gerade und in einigen Fällen verästelt mit Sporophoren mit 2 bis 3 Spiralwindun^en. Die Oberfläche der Sporen ist glatt und ohne Wulst und die Sporengestalt ist lang ellipsoid oder zylindrisch mit den Abmessungen 0,5 bis 1,0 μίτι χ 1,0 bis 1,5 μπι.

Streptomyces albus 80,614 hat die folgenden charakteristischen Eigenschaften:

Ansprechen

Milchkoagulation

Milchpeptonisierung

Melaninbildung

negativ
negativ
negativ

65

Test	Ansprechen
Ty rosinase reakti on	negativ
Nitratreaktion	positiv
	(manchmal negativ)
Stärkehydrolyse	positiv
Gelatineverflüssigung	positiv
Cellulosezersetzung	negativ
Chromogenität	negativ
Sauerstoffbedarf	aerob

Optimale Wachstumsbedingungen

pH 5,5-8,2
Temperatur: 21-37 C

Verwertungsmuster von Kohlenstoffquellen durch Streptomycec albus 80,614 (Pridham & Gottlieb's Grundmedium):

++ Glucose, Fructose, Galactose, Mannit, Xylose,

Cellobiose, Melibiose, Inulin
+ Lactose, Trehalose, Stärke
± Maltose, Mannose, Saccharose, Salicin,

Arabinose

Melizitose, Inosit, Dulcit, Sorbit, Raffinose,
Adonit, Rhamnose

30 _ ++ stark positiv
+ positiv

± zweifelhaft positiv
- negativ

Das Ultraviolettspektrum des Salinomycins ist in F i g. 1 dargestellt Die ausgezogene Linie zeigt das Spektrum in 0,01 N Lösung von HCl in Methanol, und die gepunktete Linie zeigt das Spektrum in 0,01 N Lösung von NaOH in Methanol. Salinomycin zeigt die folgenden minimalen Hemmkonzentrationen (mcg/ml):

Bacillus subtilis PCI 219 2,0

Bacillus cercus IFO 3466 2,0

Bacillus circulans IFO 3329 4,0

Bacillus megaterium IFO 3003 > 100

Staphylococcus aureus FDA 209 P 2,0

Staphylococcus epidermidis IFO 3762 4,0

SarcinaluteaNIHJ 8,0

Micrococcus flavus IFO 3242 8,0

Microcossus luteus IFO 2763 4,0

Mycobacterium smegmatis ATCC 607 8,0

Mycobacterium phlei IPCR 4,0

Mycobacterium avium IFO 3153 8,0

EscherichiacoliNIHJ.P-n - >100

Klebsieila pneumoniae PCI 602 > 100

Proteus vulgaris OX-19 > 100

Xanthomonas eryzae 64

Pseudomonas aeruginosa IFO 3445 > 100

Piricularia eryzae 16

Alternaria Kikuchiana NIAS₁A-14 32

Duamycin K-178, K-358, X-206, Nigericin, Monensin A. B. C und Dianemycin haben ähnliche Eigenschaften wie Salinomycin. Diese Antibiotika haben jedoch einen

anderen Schmelzpunkt sowie ein anderes Infrarotspektrum und andere Analysenwerte.

Herstellung des Salinomycins

Streptomyces albus 80,614 (FERM-P Nr. 419) wurde zur Impfung von 100 1 eines flüssigen Mediums mit 2% Glucose, 1% Stärke, 2,5% Sojabohnenmehl, 0,2°/b Bierhefe, 0,2% Fleischextrakt und 0,2% Natriumchlorid in einem 200-1-Edelstahltank bei pH 7,0 verwendet, und die Kultivierung wurde 84 h bei 27° C unter aeroben 1» Bedingungen durchgeführt. Die Luft wurde in einer Geschwindigkeit von 100 l/min und bei einer Rührgeschwindigkeit von 250 U/min eingeleitet. Nach der Kultivierung wurde das erhaltene Produkt auf pH 8 eingestellt, indem NaOH zugegeben wurde, worauf ferner 2% Diatomeenerde hinzugegeben wurde. Danach wurde der Ansatz abfiltriert. 831 des Filtrats wurden mit 501 Butylacetat vermischt und danach zweimal extrahiert.

Andererseits wurde der Pilzkörper mit 30 1 70%igem Aceton extrahiert und die Lösung wurde im Vakuum eingeengt und mit 10 1 Butylacetat extrahiert, nachdem das Aceton abgezogen wurde. Die Lösung wurde zu dem Filtrat gegeben, und die Mischung wurde mit Wasser gewaschen und im Vakuum auf 0,4 1 eingeengt. Die konzentrierte Lösung wurde durch eine mit 3 1 aktiviertem Aluminiumoxid gepackte Säule geschickt, um die Komponenten zu adsorbieren. Die Mischung von Äthylacetat und n-Hexan (4 :1) wurde zur Entwicklung und zur Abtrennung der Fraktionen mit aktiven Komponenten hindurchgeleitet, und die Fraktionen wurden im Vakuum eingeengt. Die konzentrierten Lösungen wurden durch Säulenchromatographie an Sephadex LH-20 unter Verwendung von Aceton als Entwicklerlösungsmittel gereinigt Die chromatographische Behandlung wurde zweimal wiederholt, wobei 8,5 g eines weißen, pulverigen, reinen Salinomycins erhalten wurden.

Das Anticoccidium-Mittel wird vorzugsweise durch Vermischen von Salinomycin mit einem physiologisch nicht toxischen Festkörper oder einem Flüssigkeitsträger unter Ausbildung eines konzentrierten Gemisches hergestellt, welches der Nahrung oder der Tränkflüssigkeit für Geflügel (Hühner) beigemischt wird. Als feste Träger kommen Weizenmehl, Sojabohnenmehl, entölte Reiskleie, Talkum, Kaolin, Kreide und Diatomeenerde in Frage. Als flüssige Träger kommen physiologische Salzlösung, destilliertes Wasser und physiologisch nicht giftige organische Lösungsmittel oder dergL in Frage. Es ist auch möglich, geeignete Zusatzstoffe, wie Emulgatoren, Dispersionsmittel, Suspensionsmittel, Benetzungsmittel. Konzentrationsmittel, Geliermittel und dem aktiven Bestandteil anhaftende Beschleuniger, wie Sojabohnenöl, zuzusetzen.

Das gegen Coccidien wirksame Mittel liegt Vorzugsweise in fester Form vor. Als Träger kommen organische und anorganische Futterstoffe in Frage. Der aktive Bestandteil wird wachstumsfördernden Futterstoffen oder Futterstoffen für Legehühner oder Grillhühner durch Rühren, Schütteln oder Mahlen zugemischt Der aktive Bestandteil kann den Futterstoffen in Form eines pulverigen Konzentrats mit einem physiologisch ungiftigen Träger zugemischt werden. Wenn das Mittel in flüssiger Form für die orale Verabreichung bestimmt ist, so ist es bevorzugt, das Salinomycin in einem physiologisch nicht giftigen Träger, wie Wasser, zu dispergieren. Es ist möglich, andere Anticoccidium-Mittel beizumengen sowie wachstumsfördernde Mittel für Vögel und für Legehühner. Es ist bevorzugt, mehr als 0,0001 Gew.-% Salinomycin vorzusehen.

Die Menge an Salinomycin, welche zur vorbeugenden oder therapeutischen Bekämpfung von Coccidien bei Geflügel (Hühnern) erforderlich ist, liegt im Bereich von 0,001 bis 0,05 Gew.-%, bezogen auf das Futter.

Testl

Hähnchen (Highline) werden mit Oozysten von Eimeria tenella, welche resistent gegen 40TpM Methylbenzoat sind, in einer Menge von 7,2x10* Oozysten pro Hähnchen infiziert. Die Hähnchen (14 Tage nach Geburt) werden in zwei Gruppen unterteilt. Das in Tabelle 1 angegebene Futter wird mit 0,01% Salinomycin, welches mit Sojabohnenmehl verdünnt war, vermischt und in bestimmten Dosen der ersten Gruppe verabreicht. Der zweiten Hähnchen-Gruppe wurde kein Salinomycin gegeben.

Tabelle 1	(%)
Zusammensetzung des Futters	41,81
Maismehl
TC-Futter	25
(Weizenmehl 85%, Talg 15%)	20
Soyabohnenmehl	8
Fischmehl mit Löslichem	3
Alfalfamehl	1
Tricalciumphosphat	0,3
Caiciumcarbonat	0,45
Salz	0,05
Vitamin ADE	0,1
Vitamin B-Gruppe	0,1
Anorganische Komponenten	0,05
Methionin
Soyabohnenmehl mit Antibiotikum	0,14
vorgemischt

100

Das Salinomycin wurde kontinuierlich in bestimmten Dosen vom Tag vor der Infektion mit den Oozysten an bis zum Ende des Tests der ersten Gruppe verabreicht Die Hähnchen wurden 15 Tage nach der Geburt mit den Oozysten infiziert Alle Hähnchen wurden nach 9 Tagen nach der Infektion seziert Die Testergebnisse sind in den Tabellen 2 und 3 zusammengestellt

(a) Gewichtszunahme und Sterblichkeit

Das Gewicht der Hähnchen wurde zur Zeh der Impfung und am Ende des Tests gemessen und die Gewichtszunahme wurde berechnet, wobei das erste Gewicht als 100 angenommen wurde.

(b) O. P. G. (Oozysten pro Gramm Kot)

Der O. P. G.-Wert wurde mit der Plankton Zähltafel durch Beobachtung des Faeces nach 7 Tagen nach Impfung festgestellt

(c) Faeces-Zustand

Der Faeces-Zustand wurde morgens und abends beobachtet

(d) Sektion

Die Erkrankung des Darms wurde festgestellt, und die + + + Anzahl der Oozysten im Duodenum, im Jejunum, im Dünndarm und im Blinddarm wurde festgestellt. Die Zahlen in Tabelle 3 geben die Anzahl der untersuchten

Hähnchen an. Die + und — Zeichen ( bis + + + +)

beziehen sich auf die folgenden Zustände:

— Caecum normal

+ Gestalt des Caecum normal,

leicht flüssiger und gelblicher Inhalt,

die Schleimhaut des Blinddarms ist teilweise + + + + leicht erweitert und weißlich.

+ + Die Gestalt des Blinddarms ist im wesentlichen normal,

die Schleimhaut des Blinddarms ist über die gesamte Oberfläche erweitert,
im Inhalt des Blinddarms findet sich kein Blut, die Schleimhaut ist gelblich.

Auf der Schleimhaut des Caecums finden sich

Tabelle 2

eine kleine Zahl weißer toter Stellen und blutiger Stellen.

Eine Atrophie und Deformation des Caecums ist deutlich erkennbar, das Caecum ist etwas länger als das Rectum.

Es wird kein normaler Inhalt gefunden. Der Inhalt umfaßt Blutgerinsel oder graues käseartiges Zerfallsmaterial.
Das Caecum ist bemerkenswert verdickt und brüchig. Es finden sich blutende Flecken.
Die Krankheit erreicht die Basis des Blinddarms, jedoch nichts das Rectum.
Eine Atrophie und Deformation des Caecums ist klar erkennbar.

Das Caecum hat eine wurstförmige Gestalt, und die Länge des Caecums ist gleich oder geringer als die des Rectums.
Die Krankheit erreicht '/3 — 'Ades Rectums.
Die anderen Beobachtungen stimmen mit denen unter + + + überein.

Gruppe

Zahl

Gewichtszunahme

Todesfälle
(%) Sterblichkeit

O. P. G. (X 10")

7 Tage Abend 8 Tage
Abend

9 Tage
Morgen

Faeces-Zustand

1. Gruppe
(Salinomycin)

2. Gruppe
(ohne Salinomycin)

11

106,4

0,32

10

91,2

70

18,24 14,88 0,32

Tabelle 3

Sektion der Hähnchen (außer toten Hähnchen)

Faeces normal
(in einem Fall
Faeces blutig
jedoch Erholung eintretend)

Faeces in
allen Fällen
nach 7 Tagen
weich und zu
etwa 80% unblutig

Gruppe

Zahl Erkrankung des Caecums

Zahl der Oozysten

Erkrankung
des Darms,
außer Caecum

1. Gruppe (Salinomycin)

2. Gruppe (kein Salinomycin)

10

9
0

Es zeigt sich somit der ausgezeichnete therapeutische Effekt des Salinomycins am Faeces-Zustand, am O. P. G, an der Gewichtszunahme, an der Sterblichkeit und an den Sektionsbefunden bei der Gruppe mit Salinomycin-Verabreichung.

Test 2

Neugeborene Küken (weißes Leghorn) wurden mit Oozysten von Eimeria tenella in einer Menge von 5 χ 10* Oozysten pro Küken infiziert Die Küken (21 Tage nach Gebart) worden in vier Gruppen unterteilt

60

£5

Q 0 2
0

keine

Das Futter gemäß Tabelle 1 wurde mit Salinomycin vermischt und 0,001% des Salinomycins wurde der ersten Gruppe ständig von 5 Tagen vor der Impfung mit den Oozysten an verabreicht 0,01% des Salinomycins wurden kontinuierlich der zweiten Gruppe vom Impf tag an verabreicht 0,01% eines handelsüblichen Anti-Thiamins (Amprolium) (l-[(4-Ammo-2-propyl-5-pyriimdinyl)-methyI]-2-picolinium-chIorid) wurden der 3. Gruppe vom 5. Tag Vor der Impfung mit Oozysten an ständig verabreicht Der 4. Gruppe wurde als Kontroügruppe kein Arzneimittel gegeben.

10

Jede Gruppe wurde 21 Tage nach Geburt mit Oozysten infiziert. Alle Küken wurden 7 Tage nach Impfung seziert. Die Testergebnisse sind in Tabellen 4

Tabelle 4

und 5 zusammengestellt. Die Tests sind die gleichen wie bei Tabelle 1, und die Zahlen und Ausdrücke sind die gleichen wie bei Versuch 1.

Gruppe	Zahl	Menge des	Gewichts	Sterblich	+-Ι	Ο. P. G.	2,1 X 10³	Faeces-Zustand
		aktiven Be	zunahme	keit
		standteils				11,8 X 10"
		(%)	(%)	(%)	(7 Tage)
1. Gruppe	10	0,001	144,8	0	0		Faeces normal
(Salinomycin vor							(in einem Fall
der Impfung							Faeces fleischig)
2. Gruppe	10	0,01	144,4	0	0	+++ ++-	Faeces normal
(Salinomycin von der
Impfung an)
3. Gruppe	10	0,01	137,7	20	in zwei Fällen
(Vergleichs-G ruppe)					Faeces blutig
4. Gruppe	10	-	135,2	60	in allen Fällen
(Blind-G ruppe)					Faeces blutig
Tabelle 5					und fleischig
Gruppe	Zahl	Erkrankung	des Caecums		Erkrankung
					des Darms,
		—	⁺	π+ außer Caecum

1. Gruppe	10	9	1	0	0	keine
2. Gruppe	10	8	2	0	0	keine
3. Gruppe	8	3	3	2	0	keine
4. Gruppe	4	0	0	1	3	keine

Test 3

Gemäß Test 1 wurde jede Gruppe mit Oozysten geimpft und es wurde die jeweilige Konzentration an Salinomycin verabreicht Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengestellt, zusammen mit Vergleichstests. Das Alter der Vögel betrug 4 Wochen.

Tabelle 6

Wirkung verschiedener Konzentrationen von Salinomycin bei Infektion mit E. tenella

Gruppe Mittel	Konzentra	Nr. infi	Dauer d.	Nr. d.	Nr. d. OPG*)	Schädigung des Caecums
Nr.	tion des	zierte	Behandl.	toten	toten
	Mittels im	Oozysten		Vögel	Vögel
	Futter
	(ppm)		(Tage)			+ ++ +++ +-;·++

Salinomycin desgl.

desgl.

desgL Clopidol VergL- Versuch geimpft VergL- Versucfa ungeimpft

10

50

75

100

125

5 X 10⁴ 8

3,3 X 10⁶

5 x 10⁴ 5 X ΙΟ⁴ 5XlO⁴ 5 X ΙΟ⁴ 5 X 10⁴ 5X10* 5XlO⁴

10	5	7,8 x	10⁶	5	1	3	2	5
10	4	7,3 X	ΙΟ⁵	6		2	4	4
10	0	5,8 x	10⁵	8	3	2
10	0	1,0X	10⁵	6	4
10	0	8,7 X	10³		2
10	0	5,8 X	1O³	4
10	7	7,9 X	ΙΟ⁶		1	2	7

5XlO⁴ 8

10 0

*) Die tägliche Oozysten-Zählnng erfolgte nach 8 Tagen nach Impfung. Die Zahl bezieht sich auf die Anzahl von Oozysten pro Gramm Faeces. Die angegebene Zahl ist die tägliche maximale Oozysten-AnzahL

Faeces-Zustand, O. P. G., Gewichtszunahme, Sterblichkeit und Sektionsbefund zeigen, daß das Salinomycin einen ausgezeichneten therapeutischen Effekt gegenüber Coccidium im Vergleich zu herkömmlichen Mitteln aufweist.

Test 4

Untersuchungen des Hemmeffekts von Salinomycin

gegen das Eindringen von Sporozoiten in die

Zellen einer Zellkultur

Salinomycin wird im Kulturmedium in Konzentrationen von 10 bis 100 TpM suspendiert, und diese Suspensionen werden mit den Sporozoiten vermischt. Die Sporozoiten wurden auf eine Zahl von etwa 300 000/ml eingestellt. 1 ml jeder dieser Mischungen wird in ein Röhrchen gegossen, in dem die Zellen kultiviert wurden, und danach wird 60 min bei 4O⁰C weiterkultiviert. Die Zellkultur wird sodann mit Methanol versetzt und mit Giemsa's Lösung angefärbt. Sodann werden die intrazellulären Sporozoiten in vier im gleichen Abstand voneinander vorgesehenen Reihen über die Länge eines jeden Deckglases mikroskopisch bei 500facher Vergrößerung gezählt. Das Verhältnis des Eindringens wird dadurch festgestellt, daß man die gezählten, eingedrungenen Sporozoiten mit einer Zählung von intrazellulären Sporozoiten einer nichtbehandelten Kontrollkultur vergleicht.

Es wird untersucht, ob die Anwesenheit von Salinomycin das Eindringen der Sporozoiten von E. tenella, E. acervulina und E. brunetti in die Kulturzellen beeinflußt. Die kultivierten Zellen werden mit einer Mischung der Sporozoiten und des Antibiotikums

Tabelle 8

geimpft. 1 h nach dem Impfen werden die Deckgläschen herausgenommen und untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefaßt. In der Tabelle ist das Verhältnis der Hemmung des Eindringens von Sporozoiten in die kultivierten Zellen bei Anwesenheit von Salinomycin zu den eingedrungenen Sporozoiten in die kultivierten Zellen bei Abwesenheit des Antibiotikums angegeben.

Tabelle 7

Gehalt an Salinomycin Blindprobe
100 TpM 10 TpM

E. tenella	0	10,0	100
E. acervulina	0,7	2,3	100
E. brunetti	2,5	6,4	100

Test 5

Es werden männliche Küken im Alter von 5 Tagen verwendet (Weißes Leghorn) und in Gruppen von jeweils fünf Küken behandelt. Experimentell werden multiple Infektionen von E. tenella (53,5%); E. acervulina (44,0%); E. necatrix (1,0%); und E. mitis (1,5%) verursacht (BR-Typ). Die Verabreichung erfolgt durch orale Intubation in den Kropf. Es kommen 10⁴ Oozysten auf einen Vogel. Sodann werden gegen Coccidien wirksame Antibiotika verabreicht. Ihre Wirkung wird 8 Tage beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengestellt.

Mittel

Konz.
(TpM)

Zahl der Oozysten arn x-ten Tag nach der Infektion (x 10⁴)
4. Tag 5. Tag 6 Tag 7 Tag

Salinomycin	75	0	0	0	0
	100	0	0	0	0
Clopidol	125	0	0	0	0
Robenidinhydrochlorid	33	1,6	7,2	22	17
Amprolium + Ethopabat	125	35	110	310	530
Kontrolle (infiziert)	-	24	60	560	420
Blindprobe	—	0	0	0	0
(nicht infiziert)

Tabelle 8 (Fortsetzung)

Mittel	Blinddarm	+	⁺⁺	+++	Dünndarm	+	++	+++	mittlerer Abschnitt	+	⁺⁺	+++	unterer Abschnitt	+	++	+++
		0 0	0 0	0 0		1 0	0 0	0 0	-	0 0	0 0	0 0	-	0 0	0 0	0 0
	-	1	0	0	oberer Abschnitt	1	0	0	Ui Ui	0	0	0	5 5	1	0	0
Salinomycin	Ux Ui	3	0	0	-	2	0	0	5	0	1	0	4	2	0	0
Clopidol	4	1	2	2	4 5	2	3	0	4	1	0	0	3	2	0	0
Robenidin- hydrochlorid	2			4		4		3
Amprolium + Ethopabat	0		3
	0

	13	+	⁺⁺	1 0	22	53	⁺⁺	031	⁺	Abschnitt	++	14	unterer	4	Abschnitt	+++
Fortsetzung		1 1	3 0				0 0		1 0	+ +	0 0			1 0	⁺⁺	0 0
Mittel	Blindf^irm				Dünndarm				0 0		4 5		0 0
			oberer	Abschnitt
	-		- -t	⁺⁺
Kontrolle (infiziert) Blindprobe (nicht infiziert)	0 4		0 3 5 0	2 0
			mittlerer
	+ -
	4 5

Clopidol: S

Robenidinhydrochlorid: l,3-Bis-[(p-chlorbenzyiiden)amino]-guanidinhydrochlorid.

Amprolium + Ethopabat: l-(4-Amino-2-propyl-5-pyrimidinylmethyl)-2-methylpyridiniumch!orid + 4-Acetamido-2-Äthoxybenzoesäuremethylester.

Hierzu 1 BJatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Antibiotikum Salinomycin in Form des Natriumsalzes mit den folgenden Eigenschaften:

farbloses alkalisches Pulver mit dem Schmelzpunkt 117-118°C,

optische Drehung [«] ·? ■■ 25° C (c = 1, Methanol),

löslich in Alkanolen, Estern, Chloroform, Äthem, Wasser, stabil bei pH 7—9, leicht instabil bei pH Tetrachlorkohlenstoff und Hexan, unlöslich in unterhalb 5,

Farbreaktion negativ bei Lemieux-Reaktion,
Kaliumpermanganat-Reaktion.Ninhydrin-Reaktion, Eisen-III-Chlorid-Reaktion und Fehling-Reaktion; positiv bei Jod-Reaktion (rötlichbraun),
Molekulargewicht: C₄₂H₆₉OnNa 772 (Na-Typ),
Strukturformel: