DE2240672B1 - Verfahren und vorrichtung zum faerben von biologischem material - Google Patents

Description

Methylenblaufärbung der Retikulozyten, Leukozyten und Trombozyten;

Nilblausulfatfärbung der Heinzschen Innenkörper;

Sternheimer-Malbin-Färbung (Gentianaviolett und Safranin) des Harnsediments;
Seyderhelmsche Färbung (Trypanblau und Kongorot) zur Leukozytendifferenzierung im Harnsediment;

Blutbild nach Seemann mit Neutralrot und Janusgrün B;

Färbung der Stärke im Magensaft mit Lugolschem Reagenz (KJ-J₂);

Peroxidase-Färbung von Gonokokken mit p-Phenylendiamin; Fuchsin-Färbung von Bakterien im Harn;
NBT-(Nitroblautetrazolium)-Test auf phagozytierende Leukozyten.

Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen können auf so einfache Weise hergestellt werden, indem man die zur Färbung nötigen Farbstoffe bzw. Farbreagenzien gegebenenfalls zusammen mit Antikoagulantien, Puffern, Lösungsvermittlern, Konservierungsmitteln u. dgl. in leichtflüchtigen Lösungsmitteln, meist Wasser, niederen Alkoholen u. dgl., löst. Die Lösung wird durch dünne Röhrchen gezogen oder gedrückt, und danach wird trockene oder gegebenenfalls warme Luft bzw. ein inertes Gas so lange hindurchgezogen oder geblasen, bis alles Lösungsmittel verdampft ist und ein fester Rückstand des Färbereagenzes an der Innenwand haftenbleibt. Eine gleichmäßige Belegung der Innenwand ist nicht unbedingt erforderlich, bei der industriellen Fertigung der Röhrchen wird jedoch durch gleichmäßigen Auftrag eine bessere Reproduzierbarkeit der Herstellung erzielt.

Die Belegung der Röhrchen kann auf verschiedenste Weise vorgenommen werden, wobei naturgemäß Methoden, die eine industrielle Fertigung ermöglichen, im Vordergrund stehen. Man kann z. B. lange Kapillaren, wie sie beim Ziehen entstehen, zunächst belegen und dann in Stücke schneiden, oder man kann zunächst kurze Stücke herstellen und dann in geeigneten Vorrichtungen belegen.

Die Konzentration der Farbstoffe bzw. Färbereagenzien in der Belegungslösung ist naturgemäß abhängig vom Innendurchmesser der zu belegenden Kapillare und von der Menge biologischer Flüssigkeit, die gefärbt werden soll. Sie kann in Anlehnung an die Konzentration der bekannten Färbelösungen entweder rechnerisch oder durch einfache Versuche ermittelt werden. Man kann die einzelnen Bestandteile der Färbereagenzien zusammen oder auch nacheinander in die Kapillare einbringen, insbesondere dann, wenn sie nicht im gleichen Lösungsmittel löslich sind. Gegebenenfalls können dem Lösungsmittel Viskositätsregulierende Stoffe zugesetzt werden.

Die Röhrchen werden vorzugsweise aus Glas bestehen, jedoch können auch andere Materialien, wie z. B. Kunststoffe, eingesetzt werden, wenn diese die Farbreagenzien nicht verändern. So dürfen z. B. die Farbstoffe nicht irreversibel auf den Kunststoff aufziehen.

Normalerweise werden einfache, durchsichtige Röhrchen verwendet. In Spezialfällen können auch opake oder gefärbte Röhrchen verwendet werden, um beispielsweise einen Lichtschutz zu gewährleisten.

Die Erfindung besitzt gegenüber dem Verfahren der Färbung auf vorgefärbtem Objektträger noch folgende Vorteile:

1. Die Farbstoffe bzw. Farbreagenzien befinden sich praktisch im Innern von Gefäßen mit kleinen Öffnungen. Sie sind also geschützt gegen Berührung, Staubeinwirkung u. dgl. Man kann bei empfindlichen Reagenzien die Kapillare sogar zuschmelzen oder sonst geeignet verschließen, nötigenfalls sogar mit Schutzgasfüllung. Die verschlossenen Enden können vor dem Gebrauch einfach abgebrochen werden.

2. Die Dicke der Schichten auf den Kapillareninnenwänden ist erfahrungsgemäß sehr gleichmäßig, was auf die Adhäsion an der kleinen runden Oberfläche zurückzuführen ist und eine gute Reproduzierbarkeit gestattet. Gleichmäßige und damit reproduzierbare Aufträge von niederviskosen Lösungen auf plane Flächen, wie Objektträgern, sind erfahrungsgemäß sehr viel schwieriger zu realisieren.

3. Wenn man nach dem Einsaugen der Untersuchungsflüssigkeit die Röhrchen entweder provisorisch (z. B. mit Wachs) oder dauerhaft (z. B. mit Siegellack bzw. durch Zuschmelzen) verschließt, so kann man die Kapillare leicht transportieren, beispielsweise von der Entnahmestelle der Probe zum Labor. In dieser Zeit kann schon der Färbevorgang ablaufen, so daß im Labor unverzüglich mit dem Mikroskopieren begonnen werden kann. In besonderen Fällen wird man derart gefüllte und verschlossene Röhrchen auf dem Postwege versenden können.

4. Die mit der Untersuchungsflüssigkeit gefüllten Röhrchen können auch einseitig verschlossen und in geeigneten Zentrifugen (z. B. sogenannten Hämatokrit-Zentrifugen) zentrifugiert werden. Hierbei können noch besondere Effekte, wie etwa die weitere Aufkonzentrierung eines spärlichen Harnsediments, erzielt werden.

Obwohl das Hauptanwendungsgebiet der erfindungsgemäßen Vorrichtungen die Humanmedizin sein wird, kann man sich auch auf anderen Gebieten, wie z. B. der Tiermedizin, der Lebensmitteluntersuchung, der Zoologie, der Bakteriologie u. a., dieser Methode mit Vorteil bedienen.

In folgenden Beispielen soll die Methode näher erläutert werden:

Beispiel 1
Vitalfärbung von Retikulozyten

Durch eine an der Innenwand mit Heparin belegte Kapillare von 75 mm Länge und etwa 1 mm Durchmesser (z. B. handelsübliche Hämatokrit-Röhrchen) wird eine 2°/oige Lösung von Brillantkresylblau in Methanol und danach etwa 2 Minuten trockene Luft durchgesaugt. Die Röhrchen sind in diesem Zustand beliebig lagerfähig.

In dieses Röhrchen saugt man Blut (etwa 30 mm Länge) aus der Fingerbeere oder dem Ohrläppchen des Patienten. Danach neigt man das Röhrchen einige Male hin und her und läßt es 10 Minuten lang liegen. Danach gibt man einen Teil des so gefärbten Blutes auf einen Objektträger und mikroskopiert in der gewohnten Weise. Hierbei geben sich

die Retikulozyten als dunkelblaue Granula enthaltende Erythrozyten zu erkennen.

Gleiche Ergebnisse erhält man, wenn man statt Brillantkresylblau Neumethylenblau (P/oige Lösung in Methanol) verwendet.

Beispiel 2
Nilblau-Färbung von Heinzschen Körpern

Wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, die Kapillare mit einer !"/eigen Lösung von Nilblausulfat in Methanol beschickt, so erhält man Kapillare, in denen neben den Retikulozyten auch noch die sogenannten Heinzschen Innenkörper der Erythrozyten blau angefärbt werden können.

Beispiel 3

Hamsediment-Färbung nach Sternheimer
und Malbin

Durch eine Glaskapillare von etwa 70 mm Länge und etwa 1 mm Durchmesser (z. B. Schmelzpunktröhrchen) wird folgende Lösung gezogen und anschließend trocken gesaugt;

Kristallviolett O₃ImI

SafraninT 0,3 ml

Methanol ad 10O₃O ml

Saugt man in diese Kapillare etwas Harnzentrifugat, bewegt einige Male hin und her und gibt es auf einen Objektträger, so kann man unter dem Mikroskop das bekannte Bild der Sternheimer-Malbin-Sedimentfärbung betrachten.

!Man kann die Kapillare nach dem Einsaugen des "Härnsediments an einer Seite mit Wachs verschließeri'und in einer geeigneten Zentrifuge zentrifugieren. Entfernt man das Wachs und gibt das ίο Zentrifugat vorsichtig auf den Objektträger, so erhält man die Formkörper des Harns in besonders großer Anzahl.

Beispiel 4
Peroxidase-Färbung von Gonokokken

Durch eine Glaskapillare von etwa 70 mm Länge und etwa 1 mm Durchmesser wird eine 5«/oige Lösung von frisch destilliertem p-Phenylendiamin in Äthanol gedrückt und anschließend mit einem Stiekstoffstrom trockengeblasen. Danach wird die Kapillare an beiden Enden mit Siegellack verschlossen und ist so nahezu unbegrenzbar haltbar. Zum Gebrauch bricht man die Enden ab und läßt etwas mit Wasser verdünnten Eiter einsaugen. Man bewegt etwas hin und her und bewahrt etwa eine Stunde bei 37° C auf. Danach wird mikroskopiert, wonach sich die Gonokokken schwarz gefärbt darstellen.

Claims (1)

1 2 Wenn unter einem Deckglas angefärbt wird, dann ist Patentansprüche: eme Aufbewahrung des Präparates nicht möglich, da auch nach Abdecken mit einem Deckglas solche Blutpräparate austrocknen und dadurch unbrauchbar

1. Vorrichtung zum Färben von biologischen 5 werden. Eine spätere Begutachtung, die aus arbeits-Materialien, bestehend aus dünnen Röhrchen, die technischen Gründen vorteilhaft ist, oder gar Veran ihrer Innenwand mit einem festen Überzug von Sendung, die oft wünschenswert ist, ist deshalb nicht geeigneten Farbstoffen oder Reagenzien belegt möglich.

sind. Das für die Färbung bestimmte Blut wird meist

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch ge- ίο aus der Fingerbeere oder dem Ohrläppchen des Pakennzeichnet, daß die Innenwand zusätzlich mit tienten entnommen und auf den vorgefärbten Objektstabilisierenden und/oder puffernden Substanzen träger ausgestrichen. Mißlingt die Färbung oder ist belegt ist. sie aus einem anderen Grunde unbrauchbar oder

3. Verwendung, einer Vorrichtung nach An- wiederholungsbedürftig, so muß dem Patienten erspruch 1 oder 2, zum Färben von biologischen 15 neut Blut abgenommen werden. Dies bedeutet aber in Materialien, dadurch gekennzeichnet, daß man den meisten Fällen, daß er erneut in die Praxis bedas biologische Material, gegebenenfalls nach stellt werden muß, da er vierfach schon gegangen ist. Vermischen mit einem Lösungsmittel, in die Vor- Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, eine richtung einbringt,-in dem Röhrchen mit den einfache, von ungeschulten Kräften bedienbare, mög-Farbstoffen reagieren läßt und nach Überführung ao liehst universell anwendbare Vorrichtung zum Färben auf einen Objektträger in an sich bekannter Weise von biologischem Material zu schaffen, mit der eine untersucht. einwandfreie, gleichmäßige Färbung für die mikroskopische Untersuchung gewährleistet ist, die auf zusätzliche Hilfsapparaturen, wie z.B. Entwicklungs-

25 kammern, verzichtet, und die Aufbewahrung der

Probe für spätere Untersuchungen bzw. einen Versand gestattet. ^; ' ■ ■'■

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß sich all diese Vorteile auf einfache Weise durch dünne

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine 30 Röhrchen, die an ihrer Innenwand mit einem 'festen Vorrichtung zum Färben von biologischem Material Überzug von geeigneten Farbstoffen oder Reagenzien und deren Verwendung zum Färben von biologischem belegt sind, erzielen lassen.

. Material zur mikroskopischen Untersuchung. Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind dem-

^:i Die mikroskopische Beurteilung von biologischem nach eme Vorrichtung zum Färben von biologischen Material, wie Blut, Urin, Bakterienkulturen, Körper- 35 Materialien, bestehend aus dünnen Röhrchen, die an Sekreten u. a. m., gehört zur täglichen Routine eines ihrer Innenwand mit einem festen Überzug von geärztlichen oder Mimischen Laboratoriums. Diese Be- eigneten Farbstoffen der Reagenzien belegt sind, wourteilung wird erleichtert und in vielen Fällen sogar bei vorzugsweise die Innenwand zusätzlich mit stabierst ermöglicht durch eine gezielte Anfärbung einzel- lisierenden und/oder puffernden Substanzen belegt ner Bestandteile. Solche Färbemethoden sind seit 40 ist und die Verwendung einer · solchen Vorrichtung längerer Zeit in großer Zahl bekannt. Die meisten zum Färben von biologischen Materialien, wobei man von ihnen sind relativ kompliziert, da sie mehrere das biologische Material, gegebenenfalls nach VerVorgänge wie Fixieren, Färben und Waschen der mischen mit einem Lösungsmittel, in die Vorrichtung Materialien auf dem Objektträger umfassen. Sie wer- einbringt, in dem Röhrchen mit den Farbstoffen readen deshalb meist in gut ausgerüsteten Laboratorien 45 gieren läßt und nach Überführung auf einem Objektvon geschulten Kräften ausgeführt. träger in an sich bekannter Weise untersucht.

Es hat nicht an Versuchen gefehlt, die komplizier- Die Verwendung von innenbelegten Röhrchen

ten Färbevorgänge zu vereinfachen, um sie auch in kann prinzipiell auf jedes bekannte Färbeverfahren kleineren Labors und in Arztpraxen von ungeschul- angewendet werden, wenn einige Voraussetzungen ten Kräften durchführen zu lassen. Ein bekanntes 50 erfüllt sind:

Beispiel dafür ist die sogenannte Vitalfärbung von _{χ Dag Untersuchungsma}terial muß 'hinreichend Retikulozyten mit vorgefaßten Objektträgern (vgl. _{flüsgi sdn um} £ _{das Röhichen eillzu}dringen

?ΐ98^ΓνΓ ' ^{KhmScbeS Worterbuch}> Berlin 1972, (gegebenenfalls kann kompakteres Material mit

ir /". j -.,.,„.. - · · τ·. etwas Lösungsmittel angeschlämmt werden [z.B.

Hierbei werden Objektträger mit einer Losung yon 55 Stuhl mit Wasser!)

1 g Brillantkresylblau in 100 ml Alkohol bestrichen ₂_ _{Die Farbstoffe} J^ Färbereagenzien müssen und getrocknet. Auf diesem Objektträger wird em . _{wenigstens etwas m der} ^ untersuchenden Flüs-

Tropfen Blut ausgestochen oder durch Bedecken mit _{ά k}^. _{(z R dem Blut oder dem Urin) löslidl}

einem Deckglas vertedt Nach etwa 10 Minuten ist _gJ_{n damit die Färb sdmdl vonstatten gehen}

die Färbung beendet und das Präparat kann mikro- 60 _{kanQ (gegebenenMls} %_{hd man} lösungsvermitskopiert werden. So einfach dieses Verfahren er- telnde Substanzen, wie Polyglykole od. dgl., zu-

schemt hat es doch fur die Praxis einige schwerwie- _{geben; bei der Färbung von} ⁵ _B ^J _{lut wird man den}

gende Nachteile: Färbereagenzien gerinnungshemmende Mittel

^Dum^ Schichten trocknen außerordentlich schnell ^ _R ^ _ED^_{A ode}^ _{Natriumcitrat zu}_

aus, so daß die Objektträger wahrend der Farbezeit 65 setzen")

in einer feuchten Kammer aufbewahrt werden ''

müssen, die nicht überall zur Verfügung steht und So sind z. B. folgende bekantte Färbeverfahren mit

was einen lästigen zusätzlichen Aufwand erfordert. den erfindungsgemäßen Vorrichtungen durchführbar: