DE2240672C2 - Verfahren und Vorrichtung zum Färben von biologischem Material - Google Patents
Verfahren und Vorrichtung zum Färben von biologischem MaterialInfo
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Description
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung .ium Färben von biologischem Material
und deren Verwendung zum Färben von biologischem Material zur mikroskopischen Untersuchung.
Die mikroskopische Beurteilung von biologischem Material, wie Blut, Urin, Bakterienkulturen, Körpersekreten
u. a. m., gehört zur täglichen Routine eines ärztlichen oder klinischen Laboratoriums. Diese Beurteilung
wird erleichtert und in vielen Fällen sogar erst ermöglicht durch eine gezielte Anfärbung einzelner
Bestandteile. Solche Färbemethoden sind seit längerer Zeit in großer Zahl bekannt. Die meisten
von ihnen sind relativ kompliziert, da üie mehrere Vorgänge wie Fixieren, Färben und Waschen der
Materialien auf dem Objektträger umfassen. Sie werden deshalb meist in gut ausgerüsteten Laboratorien
von geschulten Kräften ausgeführt.
Es hat nicht an Versuchen gefehlt, die komplizierten Färbevorgänge zu vereinfachen, um :sie auch in
kleineren Labors und in Arztpraxen von ungeschulten Kräften durchführen zu lassen. Ein bekanntes
Beispiel dafür ist die sogenannte Vitalfärbung von Retikulozyten mit vorgefärbten Objektträgern (vgl.
Pschyrembel, Klinisches Wörterbuch, Berlin 3972. S. 1287).
Hierbei werden Objektträger mit einer Lösung von Ig Brillantkresylblau in 100 ml Alkohol bestrichen
und getrocknet. Auf diesem Objektträger wird ein Tropfen Blut ausgestrichen oder durch Bedecken mit
einem Deckglas verteilt. Nach etwa 10 Minuten ist die Färbung beendet und das Präparat kann mikro-
skopiert werden. So einfach dieses Verfahren erscheint, hat es doch für die Praxis einige schwerwiegende
Nachteile:
Dünne Schichten trocknen außerordentlich schnell aus, so daß die Objektträger während der Färbezeit
in einer feuchten Kammer aufbewahrt werden müssen, die nicht überall zur Verfügung steht und
was einen lästigen zusätzlichen Aufwand erfordert.
Wenn unter einem Deckglas angefärbt wird, dann ist
eine Aufbewahrung des Präparates nicht möglich, da auch nach Abdecken mit einem Deckglas solche Blutpräparate austrocknen und dadurch unbrauchbar
werden. Eine spätere Begutachtung, die aus arbeitstechnischen Gründen vorteilhaft ist, oder gar Versendung, die oft wünschenswert ist, ist deshalb nicht
möglich. .
Das für die Färbung bestimmte Blut wird meist aus der Fingerbeere oder dem Ohrläppchen des Patienten entnommen und auf den vorgefärbten Objektträger ausgestrichen!. Mißlingt die Färbung oder ist
sie aus einem anderen Grunde unbrauchbar oder wiederholungsbedürftig, so muß dem Patienten erneut Blut abgenommen werden. Dies bedeutet aber in
den meisten Fällen, daß er erneut in die Pra$»s bestellt werden muß, da er vielfach schon gegangen ist.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, eine einfache, von ungeschulten Kräften bedienbare, möglichst
universell anwendbare Vorrichtung zum Färben von biologischem Material zu schaffen, mit der eine
einwandfreie, gleichmäßige Färbung für die mikroskopische Untersuchung gewährleistet ist, die auf zusätzliche
Hilfsapparaturen, wie z. B. Entwicklungskammern, verzichtet, und die Aufbewahrung der
Probe für spätere Untersuchungen bzw. einen Versand gestattet.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß sich all diese Vorteile auf einfache Weise durch dünne
Röhrchen, die an ihrer Innenwand mit einem festen Überzug von geeigneten Farbstoffen oder Reagenzien
belegt sind, erzielen lassen.
Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind demnach eine Vorrichtung zum Färben von biologischen
Materialien, bestehend aus dünnen Röhrchen, die an ihrer Innenwand mit einem festen Überzug von geeigneten
Farbstoffen der Reagenzien belegt sind, wobei vorzugsweise die Innenwand zusätzlich mit stabilisierenden
und/oder puffernden Substanzen belegt ist und die Verwendung einer solchen Vorrichtung
zum Färben von biologischen Materialien, wobei man das biologische Material, gegebenenfalls nach Vermischen
mit einem Lösungsmittel, in die Vorrichtung einbringt, in dem Röhrchen mit den Farbstoffen reagieren
läßt und nach Überführung auf einem Objektträger in an sich bekannter Weise untersucht.
Die Verwendung von innenbelegtet: Röhrchen kann pnnzipiell auf jedes bekannte Färbeverfahren
angewendet werden, wenn einige Voraussetzungen erfüllt sind:
1. Das Untersuchungsmaterial muß hinreichend flüssig sein, um in das Röhrchen einzudringen
(gegebenenfalls kann kompakteres Material mit etwas Lösungsmittel angeschlämmt werden [z. B.
Stuhl mit Wasser]).
2, Die Farbstoffe bzw. Färbereagenzien müssen wenigstens etwas in der zu untersuchenden Flüssigkeit (z. B. dem Blut oder dem Urin) löslich
sein, damit die Färbung schnell vonstatten gehen kann (gegebenenfalls wird man lösungsvcrmittelnde Substanzen, wie Polyglykole od. dgl., zugeben; bei d<!r Färbung von Blut wird man den
Färbereagenzien gerinnungshemmende Mittel wie Heparin, EDTA oder Natriumeitrat zusetzen).
So sind z. B. folgende bekannte Färbeverfahren mit den erfindungsgemäßen Vorrichtungen durchführbar:
2 240
Meüjylenblaufärbung der Reükulozyten, Leukozyten undTromboicyten;
Nilblausulfetfärbung der Heinzschen Innenkörper;
Stenmcüner-Malbiiii-Farbung (Gentianaviolett
und Safranin) des Harnsediments;
Seyderhelmsche Färbung (Trypanblau und Kongorot) zur Leukozytendifferenzjerung im Hamsediment;
Blutbild nach Seemann mit Neutralrot und
J anusgrün B;
Färbung der Stärke ün Magensaft mit Lugolscbem Reagenz (KJ-J2);
Peroxidase-Färbung " von Gonokokken mit
p-Phenylendiamin; Fuchsin-Färbung von Bakterien im Harn;
NBT-{Nitroblautetrazoüum)-Test auf phagozytierende
Leukozyten.
Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen können auf ao
einfache Weise hergestellt werden, indem man die zur Färbung nötigen Farbstoffe bzw. Farbreageiuien
gegebenenfalls zusammen mit Antikoagulantien, Puffern, Lösungsvermittlern, Konservierungsmitteln
u. dgl. in leichtflüchtigen Lösungsmitteln, meist Wasser,
niederen Alkoholen u. dgl., löst. Die Lösung wird durch dünne Röhrchen gezogen oder gedrückt, und
danach wird trockene oder gegebenenfalls warme Luft bzw. ein inertrs Gas so lange hindurchgezogen oder
geblasen, bis alles Lösungsmittel verdampft ist und ein fester Rückstand de* Färb°reagenzes an der Innenwand
haftenbleibt. Eine gleichmäßige Belegung der Innenwand ist nicht unbed.igt erforderlich, bei
der industriellen Fertigung der Röhrchen wird jedoch durch gleichmäßigen Auftrag eine bessere Reproduzierbarkeit
der Herstellung erzielt.
Die Belegung der Röhrchen kann auf verschiedenste Weise vorgenommen werden, wobei naturgemäß
Methoden, die eine industrielle Fertigung ermöglichen, im Vordergrund stehen. Man kann z. B. lange
Kapillaren, wie sie beim Ziehen entstehen, zunächst belegen und dann in Stücke schneiden, oder man
kann zunächst kurze Stücke herstellen und dann in geeigneten Vorrichtungen belegen.
Die Konzentration der Farbstoffe bzw. Färbereagenzien
in der Belegungslösung ist naturgemäß abhängig vom Innendurchmesser der zu belegenden
Kapillare und von der Menge biologischer Flüssigkeit, die gefärbt werden soll. Sie kann in Anlehnung
an die Konzentration der bekannten Färbelösungen entweder rechnerisch oder durch einfache Versuche
ermittelt werden. Man kann die einzelnen Bestandteile der Färbereagenzien zusammen oder auch
nacheinander in die Kapillare einbringen, insbesondere dann, wenn sie nicht im gleichen Lösungsmittel
löslich sind. Gegebenenfalls können dem Lösungsmittel Viskositätsregulierende Stoffe zugesetzt werden.
Die Röhrchen werden vorzugsweise aus Glas bestehen, jedoch können auch andere Materialien, wie
z. B. Kunststoffe, eingesetzt werden, wenn diese die Farbreagenzien nicht verändern. So dürfen z. B. die
Farbstoffe nicht irreversibel auf den Kunststoff aufziehen.
Normialerweise werden einfache, durchsichtige Röhrchen verwendet. In Spezialfällen können auch
opake oder gefärbte Röhrchen verwendet werden, um beispielsweise einen Lichtschutz zu gewährleisten.
Die Erfindung besitzt gegenüber dem Verfahren der Färbung auf vorgefärbtem Objektträger noch
folgende Vorteile:
L Die Farbstoffe bzw. Farbreagenzien befinden sich praktisch im Innern von Gefäßen mit kleinen Öffnungen. Sie sind also geschützt gegen
Berührung, Staubeinwirkung u. dgl. Man kann bei empfindlichen Reagenzien die Kapillare
sogar zuschroelzen oder sonst geeignet verschließen, nötigenfalls sogar mit Schutzgasfüllung. Die verschlossenen Enden können vor
dem Gebrauch einfach abgebrochen werden.
2. Die Dicke der Schichten auf dec Kapillareninnenwänden ist erfahrungsgemäß sehr gleichmäßig, was auf die Adhäsion an der kleinen
runden Oberfläche zurückzuführen ist und eine gute Reproduzierbarkeit gestattet Gleichmäßige
und damit reproduzierbare Aufträge von niederviskosen Lösungen auf plane Flächen, wie
Objektträgern, sind erfahrungsgemäß sehr viel schwieriger zu realisieren.
3. Wenn man nach dem Einsaugen der Untersuchungsflüssigkeit
die Röhrchen entweder provisorisch (z. B. mit Wachs) oder dauerhaft (z. B. mit Siegellack bzw. durch Zuschmelzen)
verschließt, so kann man die Kapillare leicht transportieren, beispielsweise von der Entnahmestelle
der Probe zum Labor. In dieser Zeit kann schon der Färbevorgang ablaufen, so daß im Labor unverzüglich mit dem Mikroskopieren
begonnen werden kann. In besonderen Fällen wird man derart gefüllte und verschlossene
Röhrchen auf dem Postwege versenden können.
4. Die mit der Untersuchungsflüssigkeit gefüllten Röhrchen können auch einseitig verschlossen
und in geeigneten Zentrifugen (z. B. sogenannten Hämatokrit-Zentrifugen) zentrifugiert werden.
Hierbei können ncch besondere Effekte, wie etwa die weitere Aufkonzentrierung eines
spärlichen Harnsediments, erzielt werden.
Obwohl das Hauptanwendungsgebiet der erfindungsgemäßen Vorrichtungen die Humanmedizin
sein wird, kann man sich auch auf anderen Gebieten, wie z. B. der Tiermedizin, der Lebensmitteluntersuchung,
der Zoologie, der Bakteriologie u. a., dieser Methode mit Vorteil bedienen.
In folgenden Beispielen soll die Methode näher erläutert werden:
Beispiel 1
Vitalfärbung von Retikulozyten
Vitalfärbung von Retikulozyten
Durch eine an der Innenwand mit Heparin belegte Kapillare von 75 mm Länge und etwa I mm
Durchmesser (z. B handelsübliche Hämatokrit-Röhrchen) wird eine 2»/»ige Lösung von Brillant-
kresylblau in Methanol und danach etwa 2 Minuten trockene Luft durchgesaugt. Die Röhrchen sind in
diesem Zustand beliebig lagerfähig.
In dieses Röhrchen saugt man Blut (etwa 30 mm Länge) aus der Fingerbeere oder dem Ohrläppchen
des Patienten. Danach neigt man das Röhrchen einige Male hin und her und läßt es 10 Minuten
lang liegen. Danach gibt man einen Teil des so gefärbten Blutes auf einen Objektträger und mikroskopiert in der gewohnten Weise. Hierbei geben sich
die Retikulozyten als dunkelblaue Granula enthal- Saugt man in diese Kapillare etwas Harnzentri-
tende Erythrozyten zu erkennen. fugat, bewegt einige Male hin und her und gibt es
Gleiche Ergebnisse erhalt man, wenn man statt aui einen Objektträger, so kann man unter dem
Brillantkresylblau Neumethylenblau (Woige Lösung Mikroskop das bekannte Bild der Steraheimer-
ΐη Methanol) verwendet. 5 Malbin-Sedlmentfärbung betrachten.
Man kann die Kapillare nach dem Einsaugen
Beispiel 2 des Harnsediments an einer Seite mit Wachs ver-V,.,L,
^ , . _,_ schließen und in einer geeigneten Zentrifuge zentri-Nüblau-Farbuog
von Heinzschen Körpern fugieren. Entfernt man das Wachs und gibt das
Wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, die Kapil- io Zentrifugat vorsichtig auf den Objektträger, so erlare
mit einer l'/oigen Lösung von Nilblausulfat in hält man die Formkörper des Harns in besonders
Methanol beschickt, so erhält man Kapillare, in großer Anzahl,
denen neben den Retikulozyten auch noch die sogenannten Heinzseben Innenkörper der Erythrozyten Beispiel 4
blau angefärbt werden können. 15 Peroxidase-Färbung von Gonokokken
denen neben den Retikulozyten auch noch die sogenannten Heinzseben Innenkörper der Erythrozyten Beispiel 4
blau angefärbt werden können. 15 Peroxidase-Färbung von Gonokokken
Beispiel 3 Durch eine GlaskapiUare von etwa 70mm Länge
und etwa 1 mm Durchmesser wird eine 5fl/»ige Lo-Harnsediment-Färbung
nach Sternheimer sung von frisch destilliertem p-Phenylendiamin in
und Mal bin - ao Äthanol gedrückt und anschließend mit einem Stick-
Durch eine Glaskapillare von etwa 70 mm Länge sioffstrom trockengebläse. Danach wird die Kapil-
■nd etwa 1 mm Durchmesser (z. B. Sclimdzpünkt- !are an beiden Enden -v/it Siegellack verschlossen
löhrchen) wird folgende Lösung gezogen und an- und ist so nahezu unbegrer^bar haltbar. Z'.m Ge-
ichließend trocken gesaugt: brauch bricht man die Enden ab und läßt etwas
15 mit Wasser verdünnten Eiter einsaugen. Man bewegt
Kristallviolett O1I ml etwas hin und her und bewahrt etwa eine Stunde
Safranin T 0.3 ml bei 37° C auf. Danach wird mikroskopiert, wonach
Methanol ad 100,0 rn! sich die Gonokokken schwarz gefärbt darsteilen.
Claims (3)
1. Vorrichtung zum Färben von biologischen Materialien, bestehend aus dünnen Röhrchen, die
an ihrer Innenwand mit einem festen Überzug von geeigneten Farbstoffen oder Reagenzien belegt
sind.
2. Vorrichtung nach Anspruch I1 dadurch ge- ίο
kennzeichnet, daß die Innenwand zusätzlich mit stabilisierenden und/oder puffernden Substanzen
belegt ist
3. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, zum Färben von biologischen is
Materialien, dadurch gekennzeichnet, daß man das biologische Material, gegebenenfalls nach
Vermischen mit einem Lösungsmittel, in die Vorrichtung einbringt, in dem Röhrchen mit den
Farbstoffen reagieren läßt und nach Überführung ao auf einen Objektträger 'n an sich bekannter Weise
untersucht.
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