DE2238536A1 - Zubereitungen zur behandlung von mikrobieninfektionen und ihre herstellung - Google Patents

Description

DR. BERG DIPL.-ING. STAPF

PATENTANWÄLTE β MÜNCHEN ΘΟ, MAUERKIRCHERSTR. 45

Dr. Berg Dipl.-Ing. Stapf, 8 München 80, MauerkircherstroB» 45 · Ihr Zeichen Ihr Schreiben Unser Zeichen

Anwaltsakte 22 678
Be/fcSch

Datum

The Wellcome Foundation London / England

"Zubereitungen zur Behandlung von Mikrobieninfektionen und ihre Herstellung"

Diese Erfindung betrifft Zubereitungen, die zur Behänd lung von durch hikrobien verursachte Infektionen bei . Säugern und Geflügel geeignet sind.

j-'etrahydrofolatkofaktoren sind essentielle Metabolite in allen Zellen für die Biosynthese von J^urinen, '

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säure, tierin und verschiedene andere biologisch wichtige Verbindungen. Die meisten dieser Kofaktoren sind Addukte der Tetrahydrofölsäure. Höhere Tiere und Menschen finden diese in der Nahrung, die gewöhnlich vorgebildete Eolate in Form von Vitaminen enthält.

Bei den Mikroorganismen werden die Kofektoren aus einfacheren Grundstoffen gebildet. Im allgemeinen wird bei dem biosynthetischen Verfahren zuerst 'Dihydropteridin' (Pt), d.h. 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7.8-dihydropteridin (HMPt)-pyrophosphatester aus seinem Zwischenproduktprekursor HMPt in Gegenwart des Enzyms Hydroxymethyldihydropteridinpyrophosphokinaee (HMPPS) gebildet. Pt wird dann mit p-Aminobenzoesäure (pAß) in Gegenwart der Enzym-Dihydropteroatsynthetase unter Bildung von Dihydropteroinsäure (DPtS) kondensiert. Dieses Zwischenprodukt wird weiter mit einem Glutamat unter Bildung von Dihydrofoleäure (DFS oder "Folat") kondensiert, die dann enzymatisch unter Bildung des essentiellen Tetrahydrofolats, beispielsweise in Bakterien oder anderen Mikroorganismen reduziert wird.

Es ist boicannt, daß die ulidung des "Foists" aus den Bausteinen, d.h. Pfceridin, pAü und Glutamat und die weitere Umwandlung von diesem in das i'etrahydrof^ldt auf zweierlei, unterschiedliche Weise inhibiert werden ίβηη. Beispielsweise verdrängen die !Sulfonamide ρ AB in lern oben angegebenen Keaküionsiablauf. wogen ihrer nahen ötrukturähnlichkeit

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zu pAB treten die Sulfonamide oder ähnliehe andere 'Kompetitoren¹ in die Biosynthese ein und Verhindern die Bildung von DPtS und von DES und wirken daher als Antimetaboliten für den Metabolit pAB.

Eb ist weiterhin bekannt;, daß Verbindungen., die 'Inhibitoren' der Enzym-Dinyäröfolsäure-Reduktase sind, die zu dem Tetrahydrofolat führende Bildungsstufe blockieren. Eine beträchtliche Anzahl von Pyrimidinderivaten zeigen auf der Basis dieser Blockierung wesentliche anti-mikrobielle Eigenschaften.

Es wurde weiterhin später festgestellt, daß solche Inhibitoren synergistisch mit Sulfonamiden zusammenwirken können, d.h. daß eine nachfolgende Doppelblockierung und eine starke wechselseitige Efcenzierung der antibakteriellen Wirkungen der beiden Materialien auftreten kann. Der Bereich der durch solche Kombinationen ausgeübten antimikrobiellen Wirkung ist beträchtlich weiter als er aus der Wirksamkeit von einem der Arzneimittel erwartet werden könnte und Organismen, die nur schwach au* die einzelnen Mittel ansprechen, sind gegenüber den Kombinationen sehr empfindlich.

Es wurde weiterhin hypothetisch angenommen, daß Antimetar bolite zu Pt die Biosynthese von DPtS (und Di¹S) inhibieren könnten (siehe Hitchings und Burchall Advances in Enzymology, ,27, 417-468 (1965)), aber Verbindungen, soweit sie

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in dieser Hinsicht geprüft wurden, entsprachen nicht diesen Erwartungen und waren entweder unwirksam oder zu toxisch oder mitunter beides (siehe die Verbindungen, die in den Britischen Patentschriften981 506 und 987 916 beschrieben sind). Es darf festgestellt werden, daß es zur Hemmung des MikrobienwachstuiDs bzw φ für antimikrobielle Zwecke eine Voraussetzung für den wirksamen Antagonismus von Pt ist, daß die Verbindung nur als Inhibitor von HMPPS dienen sollte, ohne auch als Antimetabolit zu dem Dihydropteridin aufzutreten, das als ein Kofaktor für die Hydroxylierung von Phenylalanin und Tyrosin dient, die Prekursoren der Catecholamine, wie Norepinephrin sind und bedeutende Wirkungen als Regulatoren von cardiovaekulären Systemen haben. Eine solche antimetabolische Wirkung könnte zu einer prohibitiven Toxizität bei Vögeln oder Säugern führen, die normalerweise die mit den Mikroben infizierten Wirte sind.

Es wurde weiterhin nunmehr gefunden, daß Substanzen, die diesen Erfordernissen entsprechen, d.h. HMPPS kombiniert mit niederer Toxizität gegenüber der Wirtart inhibieren, wie dies beispielsweise bei Kücken und Ratten nachzuweisen ist, nicht nur das Wachstum von Mikroorganismen in gewissem Ausmaß inhibieren, sondern auch unerwartet in einer in hohem Maße synergistischen Wirkung ansprechen, wenn sie mit einem Kompetitor von pAB, d.h. Sulfonamiden und ähnlichen Verbindungen, oder mit selektiven Inhibitoren der Dihydrofolatreduktase oder mit einer Kombination dieser beiden Ar-

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ten von anti.mikrobiellen, d.h. gegen Bakterien gerichteter Mittel kombiniert verwendet werden.

Die Erfindung schafft daher in einer Hinsicht eine Zubereitung zur Prüfung und Behandlung von Mikrobiensysteraen oder -Infektionen, wozu man eine wirksame potenzierende Menge eines Mikrobien-dihydropteridin-antagonisten, hier nachfolgend als 'Potentiator¹ bezeichnet, der selbst HMPPS inhibiert und ausreichend niedere Toxizität aufweist, zusammen mit einer wirksamen Menge eines Kompetitors oder Inhibitors oder beiden, wie vorausgehend definiert, verwendet.

Die Mikrobieninfektionen, gegen die die Kombinationen dieser Erfindung v/irksam sind, sind Protozoen- oder Bakterieninfektionen, die durch solche Mikroorganismen verursacht werden, die wenigstens einen wesentlichen Teil ihres Bedarfs an dem Tetrahydrofolatkofaktor bilden. Im besonderen sind es solche infizierende Mikroorganismen, die ausreichend die hier beschriebenen pharmazeutischen Kombinationen absorbieren und bei denen weiterhin diese Kombinationen eine synergistische Wirkung dahingehend haben, daß sie die de novo-Öynthese der erforderlichen Tetrahydrofolatkofaktoren beeinträchtigen bzw. unterbinden.

Es wimle als kennzeichnend gel*lindan, daß wenn Potontiutoren ■ kombiniert worden mit einer Hange des Kompetitors und/oder

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des Inhibitors, wobei diese Menge normalerweise nicht ausreichend ist, um von sich aus, d.h. aus eigener Kraft, als antimikrobielles Mittel wirksam zu sein, die Kombination eines Potentiators mit dieser normalerweise unwirksamen Menge des Kompetitors und/oder des Inhibitors eine Zubereitung bildet, die als Ganzes als ein wirksames antimikrobielles Mittel wirkt. Es ist besonders bemerkenswert, wenn die Potentiatormenge so nieder ist, daß sie im wesentlichen keine mikrobielle Wirkung bei der gegebenen Menge bat, jedoch in der Kombination eine beträchtliche, in manchen Fällen sehr beträchtliche Potenzierung bewirkt.

In den vorausgehenden Ausführungen bedeutet die Bezeichnung

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"eine wirksame Menge", die zusammen mit den Bezeichnungen "Dihydrofolsäure-Reduktase-' Inhibitor¹¹¹ und "para-Aminobenzoesäure-'Korapetitor'" verwendet wird, entweder (a) eine Menge des Inhibitors oder Kompetitors, die als solche in einem Grad als antimikrobielles Mittel wirksam ist, jedoch durch die Verwendung eines 3?otentiators potenziert wird oder (b) eine Menge des ^Inhibitors' oder 'Competitors¹, die als Mittel gegen Mikroben unwirksam ist, die aber, wenn sie mit einem Potentiator kombiniert wird, eine Zubereitung bildet, die ein wirksames antimikrobielles Mit- \ tel ist. Eine "wirksame potenzierende Menge" bedeutet eine Menge des Potentiatore, die die Wirksamkeit eines Inhibitors und/oder Kompetitors so erhöht, daß eine verbesserte oder ausreichende Wirksamkeit für die gesarate Kombination erzielt wird« j

Es muß darauf hingewiesen werden, daß*die Inhibierung der biosynthetischen Prozesse durch derartige Verfahren in allen drei Fällen als kompetiver Antagonismus bezeichnet werden kann und daß von einer Potenzierung bei allen drei Arten von Mittel gesprochen werden kann. Die Begriffe 'Inhibitor', 'Kompetitor' und 'Potentiator¹¹ werden willkürlich verwendet und sollten nur als zweckmäßige Bezeichnung für die geeignete Art der Komponenten in Kombinationsprodukten dienen, wie sie hier nach der vorliegenden Erfindung beschrieben und beansprucht werden.

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Die gegen IJMPPS gerichtete Inhibierungswirksamkeit eines ausgewählten Potentiators kann beispielsweise durch Fest-

32 stellen der übertragung des endständigen Phosphat ATP-r-P--Teils in Uihydropteridin durch Versuch nachgewiesen werden. Es wurde festgestellt, daß die Konzentrationen, die zur 50#igen Inhibierung der Bildung von Pt (ICVq) erforderlich sind, in solchen Untersuchungen in guter Wechselbeziehung stehen und im Bereich der Fehlergrenzen liegen, die man durch andere in dieser Hinsicht relevante Untersuchungen erhält, durch die man die Inhibierung von einem der beiden in Betracht korninenden Enzyme bei der Bildung von IMPt und Pt mißt. Eine solche Inhibierung kann beispielsweise leicht und einfach durch Bebrüten eines Extrakts von E. coü mit

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pAB-7-C , ATP, Hg und Dihydropteridin durchgeführt werden.

Die Bildung des Dihydropteroat-C kann durch Versuch quantitativ nach Abtrennen des nicht umgesetzten pA3-Substrats, beispielsweise durch Chromatographie, bestimmt werden. Ec wurde festgestellt, daß Verbindungen, die in solchen Versuchen einen ICt-Q-Wert von etwa 100 λιΜ oder weniger, gewöhnlich unter ^>0 λχ\Λ aufweisen, Verbindungen sind, die eine brauchbare potenzierende 'Wirkung aufweisen, vorausgesetzt daß ihre Toxizität bei den jeweiligen Vertebraten annehmbar ist. Vorzugsweise sollte der Viert 2ü>/uH oder geringer ε ο in, also im Bereich zwischen 2 und 12 aM liegen, wobei im allgemeinen ein Wert unter ?/UlI wünschenswert ist.-

WIe oben erläutert, ist es bei der vorliegenden Erfindung wesentlich, daß der Potentiator keine seine Verwendung verhindernde Toxizitiiü, worin die cnrdiovaskuläreii oystome

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der in Frage kommenden Wirte, nämlich Säuger oder Vögel_? hat. Während daher eine niedere Toxizität eine wesentliche Voraussetzung ist, kann ein therapeutischer Index, der sowohl die nach der vorliegenden Erfindung gewünschte Aktivität oder Toxizität angibt, aufgestellt und vorteilhaft zur Auswahl der Potentiatoren verwendet werden.

Der therapeutische Index wird als das Verhältnis der maximal tolerierten Dosis zur minimal wirksamen Dosis definiert und in den meisten Fällen ist dieses Verhältnis vorzugsweise grosser als 10, zweckmässigerweise wenigstens 5» in seltenen Fällen mindestens etwa 3 bei Menschen und kann bei Tieren einen Y/ert wie 2 haben.

Im besonderen können Verbindungen, die strukturelle Ähnlichkeit zu Pt, d.h. zu den verschiedenen Pteridine!! mit den gewünschten Inhibierungs- und Toxizitatseigenschaften aufweisen, nach Vorteil für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ausgewählt werden. Beispielsweise kommen 2-Amino- ^-hydroxy-V.S-dihydropteridine} die in 6-Stellung durch ein Kohlenstoffatom substituiert und in 7-Stellung bisubstituiert sind, besonders im Hinblick auf ihre potenzierenden Wirkungen in Betracht.

Es	wurde nunmehr im bee	onderen	H 33 3	gefunden,	daß Pteridine
der	allgemeinen Formel 0 Il	(D
	HIT	r	H	• (D
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oder ihre tautomere Formen, worin R eine Alkylgruppe ist, die gegebenenfalls mit einer Hydroxygruppe, mit einem oder mehreren Halogenatomen oder mit einer gegebenenfalls substituierten Phencxygruppe substituiert ist und die Reste

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R und R gleich oder verschieden sind und jeder eine Alkyl-

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gruppe ist oder R und R zusammen einen Spirocycloalkylring mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen außerhalb des Pteridinrings bilden, oder ihre pharmazeutisch verträglichen Salze (wobei alle nachfolgend als in den Bereich der Verbindungen der Formel (I) fallend, eingeschlossen sind) als Potentiatoren, wie vorausgehend definiert, wirksam sind.

In den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) haben die

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Alkylgruppen der Substituenten R, R und R 1 bis 4 Kohlenstoffatome. Die Phenoxygruppe kann mit einem oder mehreren Alkoxy-, Amino-, Alkyl- oder Hydroxygruppen oder mit Halogenatomen, im besonderen in para-Stellung, substituiert sein. Die Halogenatome können Fluor, Chlor, Brom oder Jod sein und erscheinen vorzugsweise als Mono- oder Disubstituent. Die Brornsubstituierung ist besonders zur Herstellung geeignet.

Zu einer besonderen Gruppe im Rahmen der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gehören Verbindungen, worin R auf eine 6-Alkyl- oder 6-Hydroxyalkylgruppe begrenzt ist. In

Λ ρ

diesen Verbindungen haben die Substituenten R und R die in der allgemeinen Formel (I) angegebene Bedeutung, wobei

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jedoch bevorzugt wird, daß sie entweder Methyl- oder Äthylgruppen sind. Beispielsxveise wurde festgestellt, daB die Verbindungen 2-Amino-^-hydroxy-6~hydroxymethyl-7·7~dimethyl-7.8-dihydropteridin, nachfolgend als DMHP bezeichnet, und 2-Amino~ⁱJ-~hydr oxy-6-hydroxymethyl~7 · 7~äiäthyl-7 · 8-dihydr 0-pteridin hervorragende potenzierende Eigenschaften aufweisen. Diese Verbindungen und ihre Analogen wurden in den Britischen Patentanmeldungen 330I/70 und 35814/72 beschrieben und weiterhin sind Verfahren zu ihrer Herstellung in einem Artikel von Pfleiderer und Zondler in Chem. Ber. 99, 3oo8 (1966) und in der Britischen Patentanmeldung 36289/70 und Belgische Patentschrift 77o 577 beschrieben.

Eine weitere Gruppe im Rahmen der allgemeinen Formel (I) bilden Verbindungen, worin R auf eine Phenoxyalkylgruppe, im besonderen eine Phenoxymethylgruppe_s beschränkt ist, wobei jedoch die Phenylgruppe auch, wie voraus erwähnt, sub-

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stituiert sein kann. Die E.- und R -Substituenten haben wieder die in der Formel (I) angegebene Bedeutung, wobei jedoch die Dimethyl- und Diäthy!Varianten bevorzugt werden. Zu dieser Gruppe von Verbindungen gehört beispielsweise das stark potenzierende 2-AiDino-^/t-hydroxy-6-phenoxymethyl~7·?" dimethyl-7.8-dihydropteridin. Seine Herstellung und die Herstellung seiner Analogen ist in der britischen Patentanmeldung 35 816/72 beschrieben.

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Eine dritte Gruppe im Rahmen der allgemeinen Formel (I) sind solche Verbindungen, worin R auf eine Halogen-substituierte Alkylgruppe beschränkt ist und die Reste R und

R die vorausgehend definierte Bedeutung haben. Die HaIogen-enthaltende Gruppe ist vorzugsweise mono- oder dihalogeneubßtituiert, am zweckmäßigsten mit Bromatomen. Besonders geeignete Verbindungen dieser Gruppe sind 2-Amino~4~ · hydroxy-6-brommethyl-7.7~diniethyl-7»e-<iihydropteridin und das G-Dibroramethylenelog, die zusammen mit ihren Analogen in der britischen Patentanmeldung 35 815/72 beschrieben Bind.

Verbindungen der Formel (I) und im besonderen DMHP mögen als solche nicht sehr wirksam sein gegen viele Bakterien wie Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenee, Streptococcus faecalis, Escherichia CoIi₁ Salmonella typhi, Proteus vulgaris, Pseudomonae aerugenosa, Pasteurella multocida unter anderem, können jedoch eine beträchtliche potenzierende Wirkung auf die WirksamkeitTVon Kompetitoren und/oder Inhibitoren ausüben. So ist es nunmehr möglich, durch Verwendung einer wirksamen potenzierenden Menge einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) zusammen mit dem !Competitor und/oder dem Inhibitor beträchtlich die Menge des !Competitors oder des Inhibitors, die zur Inhibierung des Wuchses dieser Bakterien erforderlich ist, zu senken.

Bei den oben erwähnten Verfahren zur Herstellung von Ver-

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bindungeii der allgemeinen !Formel (I) setzt man im wesentlichen eine Verbindung der !Formel (II) oder ein Salz derselben

R¹

E₀N — C G — R- (II),

² I₂ H

R^ X

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worin die Reste R, R und R die oben definierte Bedeutung haben und X ein ketonisches Sauerstoffatom oder eine hierfür geeignete Schutzgruppe, wie eine Oxim-, oder Thiosemicarbazongruppe ist, mit 2-Amino-4~ chlor-6-hydroxy-5~nitropyrimidin um, entfernt danach die Schutzgruppe, sofern vorhanden, und unterwirft das erhaltene Produkt der reduktiven Cyclisierung. Sofern erforderlich, können die Substituentengruppen in solche unterschiedliche Art mittels dem Fachmann bekannter Standardverfahren umgewandelt werden, beispielsweise durch Bromierung einer 6-Alkylgruppe unter Bildung des 6-Broraalkyl- oder 6-Dibromalkylderivats.

Andere Pteridinderivate können im breitesten Bereich der vorliegenden Erfindung nach analogen Verfahren, wie sie für verschiedene Pteridine in der Literatur angegehen sind, oder nach den vorausgehenden Verfahren oder mittels Zwischenumwandlung der Substituentengruppen nach bekannten und dem. Fachmann leichb zur Verfugung stehenden Verfahren, hergestellt werden.

Obgleich dem l/achutenm /ie I.ο Ϋ ich Ladungen bekannt sind, die

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Koinpetitoren von para-Aminobenzoesäure und Gegen Mikroben wirkende Mittel sind, seien hier die Sohwefelverbindungen erwähnt, die als antimikrobiell Mittel im Merok-Index (Θ. Ausgabe, 196Θ) auf üeite 992 oben bis Seite IOO7 nur als Beispiel angegeben sind.

Von den bekannten Verbindungen, die Kompetitoren sind, werden die folgenden SuIfonamidverbindungen (oder ihre phermaaeutiach verträglichen Salze) für die Zwecke dieser

Erfindung bevorzugt 1 Sulfanilamid, Sulfadiazin, ßulfa-

methisazol, Sulfapyridin, üulfethiazol, öulfamerazin, flulfa-

methazin, löulfisoxazol, ßulformethoxin, Sulfasomidin, üulfadifflidin, Sulfachlorpyridazin, öulfafurazol, 2-(p-ABinobenzol)-sulfonamid-3-niethoxypyrazin (Kelfizina), a-Aminop-toluoleulfonamid, 5-Sulfanilaniido-2.4-dimethylpyriinidin, 4-(N^l-Acetylaulfanilamido)-5»6-dimethoxypyriniidin, 3-ßulfanilamido-4.5-difflethylieoai:azol, 4—bulfanilamido~5~methoxy-6-decyloxypyriinidin, Sulfaraonomethoxyin, 4-p-(8-Hydroxyohinilinyl-4-a zo)-phenylsulfanilamido-5·6-dimethoxypyriraidin, SuIfadimethoxin, Sulfamethoxazol, Sulfachinoxalin und p-(2-M©thyl-8-hydroxy-chinolinyl-(5)-azo)-phenylsulfanilamido-5. e-diraethoxypyriinidin-p-aininoealicyleäure (PAü) und p.p'-Diaminodiphenylsulfon sind Beispiele für einen iCoüpetitor des Nicht-Sulfonamidtyps.

In ähnlicher Weise werden, obgleich viele Verbindungen be-

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kannt sind, die die Dihydrofolsäurereduktaee inhibieren und als antimikrobiell© Mittel wirken, die in den folgenden Patentschriften offenbarten Yerbindungea als Beispiele für Verbindungen angegeben, die in dieser Erfindung verwendet werden können: U₆ S.. -Patents ohr if ten 2 658 897» 2 76? 183, 3.021 332, 2 937 284, 3 322 765» 2 909 522, 2 624 732, 2 579 259, 2 945 859, 2 576 939, .2 926 166_e 2 697 710, 2 74-9 345 und 2 74-9 344.

Die nachfolgenden Inhibitoren (oder ihre pharmazeutisch verträglichen Salze) werden ^edooh für di© Zwecke dieser Erfindung besonders bevorzugt $ 2.4-Diamino°6-äthyl-5-pchlorphenylpyrimidin (Pyrimethamin), 2_o4-J}iaiaino'=5~'C3⁸ «^^a °™ 5'-trimethoxybenzyl)-pyrimidin (Trimethoprim) „ 2.4-Dianiino-5-(3^l.4^l~diraethoxybenEyl)-pyrira±din (Diaveridin), 2.4-Diamino-5-(2'-isopropyl-4¹-ohlorphenoxy)-pyrimidia, 2.4-Diaraino-5-methyl-6-ßek-butylpyrido-(2.3~ö.)--pyrimidia₉ 2«4-Diamino-5~niethyl-6-benzylpyrido(2.3-d)-pyrimidin, 2.4-Diatnino-6-benzylpyrido(2.3-d)-pyrimidin, 2.4~Dieioino-5~6-='tritDethy~ lenchinazolin, 2.4-Diatnino-5.6~tetraiaethylenohinaBolin, 2.4-Diaffiino-5~(2 *.4'τ5'-triraethoxybenzyl)-pyriraidin, 2.4-Diamino-5-(2'-äthyl-4'.5·-dimethoxyb enzyl)-pyrimidin, 2.4-Diamino-5-(2^I-methyl-4^l .5' -dimethoxybenzyl)-pyriinidin.

Es gehören jedoch zu den insbesondere bevorzugten Kombina- -8 ti on en solche, bei denen DMHP mit bulfadiazin, bulfameth-₁ oulfadoxin oder bulfachinoxalin als Kompetitoren

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oder mit Trimethoprim, Diaveridin oder Pyrimethamin als Inhibitoren kombiniert wird. Im Hinblick auf mögliche synergistische Vorteile bei kombinierter Verwendung bestimmter Kompetitoren und Inhibitoren gegen besondere Erkrankungen, und auf die potenzierende Wirkung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) auf diese beiden Arten von antibakteriellen Verbindungen wird es vorgezogen, Dreierkombinationen zu formulieren, die beispielsweise DMHP mit einem der oben erwähnten bevorzugten Kompetitoren und einem der erwähnten Inhibitoren beinhalten. Beispielsweise wurde festgestellt, daß bulfadiazin/Trimethoprim/DMHP oder bulfamethoxazol/'i'rimethoprim/DMKP oder ßulfadoxin/Trimethoprim/DMHP oder Sulfachinoxalin/Diaveridin/DMPH eine verbesserte Wirkung aufweisen im Vergleich zur alleinigen oder paarweisen Verwendung der Komponenten.

Die Verbindungen der Formel (I) zusammen mit dem Kompetitor und/oder Inhibitor können in Verbindung mit einem Träger dargeboten werden, der für pharmazeutische Formulierungen zur parenteralen, örtlichen, rektalen oder oralen Verabfolgung geeignet ißt. Die Formulierungen zur oralen oder rektalen Verabfolgung werden vorteilhafterweise in getrennten Einheiten, wie Tabletten, Kapseln, Kachetten, Ampullen oder Üuppositorien dargeboten, wobei jede dieser Einheiten eine vorbestimmte Menge von jeder der Verbindungen enthält, wobei sie jedoch ebenso als Pulver, Granulate, als Lösung oder Suspension in einer wäßrigen oder nicht-

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wäßrigen Flüssigkeit oder als Salbe oder Paste zur örtlichen Verabfolgung dargeboten werden können. Zur parenteralen Verwendung müssen die Formulierungen, die einen wäßrigen oder nicht-wäßrigen flüssigen !'rager beinhalten, steril sein und in einem verschlossenen Behälter dargeboten werden.

Die Formulierungen können nach irgendeinem der bekannten Verfahren hergestellt werden und sie können einen oder mehrere der nachfolgenden zusätzlichen Bestandteile enthal- · ten: Verdünnungsmittel, gelöste Stoffe, um die Lösung mit dem Blut isotonisch zu machen, Puffer, Geschmackstoffe, Binde-, Dispergier-, oberflächenaktive -, Eindick-, Gleit- · und Beschichtungsmaterialien, Konservierungsmittel, Bak~ teriostatika, Antioxidationsmittel, Suppositorien und SaI-bengrundmaterialien und irgendwelche weitere, geeignete Exzipienten.

Formulierungen, die den Potentiator zusammen mit einem Kompetitor und/oder einem Inhibitor aufweisen, können ebenso in Form von Packungen dargeboten werden, die getrennt verpackte Einheiten oder Dosierungen dieser Komponenten mit Anweisungen zur Verwendung in kombinierter Form enthalten. Diese Anweisungen können ebenso die Art der Verabfolgung und Indikationen, für die das Mittel geeignet ist, angeben.

Jede der voraus bezeichneten Verbindungen kann in Form ihrer

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pharmazeutisch verträglichen Salze einer Mineralsäure oder organischen Säure, beispielsweise von Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Maleinsäure oder Salicylsäure oder,besonders für den Sulfonamidkompetitor, einer Base wie Natrium- oder Kaliumhydroxid dargeboten werden.

Die Verhältnisse, in denen die therapeutisch wirksamen Verbindungen in den Zubereitungen nach der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können innerhalb weiter Grenzen variiert werden. Abhängig von der Art und den Umständen der Verwendung der Zubereitungen können sie den Potentiator mit dem !Competitor und/oder dem Inhibitor in geeigneten Anteilen und Dosierungen aufweisen. -Beispielsweise ist es im Falle von in vivo_Verwendungen häufig wünschenswert, einen bestimmten Anteil der Komponenten in dem Blut oder den Gewebeflüssigkeiten, vorzugsweise längere Zeit, beizubehalten. Abhängig von den verschiedenen Absorptions-, Abgabe— oder Zerfallgeschwindigkeiten der Komponenten, können die Anfangsmengen und Anteile der Bestandteile der Formulierung gegenüber solchen verschieden sein, die man bei Geweben in vivo bevorzugt. Die Formulierungen oder Dosierungen, die für die allgemeine Behandlung einer besonderen Krankheit bei Menschen oder Tieren empfohlen werden, müssen nach den jeweiligen Erfordernissen der Träger der Krankheit, den bekannten Aktivitäten der Kompetitor- oder Inhibitorkomponente gegen den verursachenden Organismus, die

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Halbwertszeit und die Toxizität der Komponenten in vivo und nach anderen praktischen Gesichtspunkten eingestellt werden,

Beispielsweise kann die Zurbereitung oder pharmazeutische Formulierung von etwa 1 bis 30 Teile, vorzugsweise 5' bis 15 Teile Potentiator, zum Beispiel eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) oder eine äquivalente Menge eines Salzes derselben und 1 bis 30 (Deile, vorzugsweise 5bis 15 Teile, einen !Competitor oder eine äquivalente .Menge eines Salzes desselben und/oder einen Teil eines Inhibitors oder eine äquivalente Menge eines Salzes desselben beinhalten.

Die Dosierung wird, abhängig von dem infizierenden Organismus, variieren. Jedoch können unter gewöhnlichen Umständen bis zu etwa 60 mg/kg von jedem der Potentiatoren und Kompetitoren und bis zu etwa 7»5 mg/kg Inhibitor in Kombination täglich in mehreren Dosen verabfolgt werden.

Die Zubereitung oder pharmazeutische Formulierung kann Menschen in Form von Dosierungseinheiten verabfolgt werden, die bis zu 750 mg an Potentiatorverbindung der allgemeinen Formel (I) und bis zu 750 mg Kompetitor und/oder bis zu 25 mg Inhibitor enthalten. Vorzugsweise sollten für Erwachsene Dosierungen verwendet werden, bei denen der Potentiator etwa 200 mg, der Kompetitor etwa 200 mg und/oder der Inhibitor etwa 25 mg beträgt. ■ -19-

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Die pharmazeutische Formulierung, die die Verbindung der allgemeinen l'Ormel (1) kombiniert mit dem Kompetitor und/ oder dem Inhibitor enthält, ist ebenso in Lösung anwendbar zum Spülen von Wunden,beispielsweise nach der Operation, um das Wachstum von Bakterien zu verhindern.. Beispielsweise kann eine antibakterielle Lösung mit der nachfolgenden bevorzugten Konzentration von Komponenten, nämlich 1 bis 50 mg/ml Verbindung der Formel (I), 1 bis 50 mg/ml Kompetitor und/oder 0,05 bis 1 mg/ml Inhibitor in einem pharmazeutisch verträglichen Lösungsmittel, das zur äußeren Anwendung geeignet ist, verwendet werden.

Die potenzierende Wirkung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) kann in vitro relativ leicht zur Untersuchung und für praktische Zwecke demonstriert werden. Zu solchen Möglichkeiten gehört die Diagnose und Identifizierung der Bakterienflora der Patienten und das danach auszuwählende klinische Behandlungsschema.

Die Zubereitungen dieser Erfindung sind zur Behandlung von Infektionen brauchbar, die durch Mikroorganismen, zum Beispiel Staphylococcus aureus, Pseudomonas aerugenosa und Pasteurella multocida verursacht werden.

Hierzu können die verschied.Kombinationen in poröse Scheiben (wie Pilterpapierscheiben) od.in Agar-Nähr- od.andere Medien für den bakteriellen Wuchs zur Bestimmung der Ansprechbarkeit eingebracht werden. Solche Gegenstände, in die die Potentiatorverbindung mit einer Kompetitor- und/oder einer Inhibitorverbindung eingebracht ist, können an Ärzte, Krankenhäuser

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und Kliniken für die obigen Zwecke abgegeben werden. Eine typische Testscheibe kann mit einer Lösung imprägniert werden, die einen Gehalt aufweisen von 5 bis 50/Ug/ml para-Aminobenzoesäure-Kompetitor, 0,5 bis 5/Ug/ml Dihydrofolsäure-ßeduktase-Inhibitor und etwa 10 bis 100/Ug/ml DMHE in einem Medium, das ein Gemisch aus einer wäßrigen Infusion und JPapaindigest von Pferdemuskelfleisch enthält.

Weiterhin können solche pharmakologische Untersuchungen mit den potenzierten Kompetitoren oder Inhibitoren zweckmäßig sein zur Charakterisierung der Bakterien entsprechend ihrer Sensibilität und ihrer jeweiligen Widerstandsfähig- · keit beispielsweise gegenüber einem !Competitor, wenn dieser allein verwendet wird, und solche Untersuchungen, die eine Vielzahl von Formulierungen nach der vorliegenden !Erfindung beinhalten, bilden ebenso die Basis zur Bestimmung der Zubereitungen von ausgewählten Formulierungen für die allgemeine Behandlung. Die Toxizität der Verbindungen der allgemeinen !formel (I) ist im allgemeinen beträchtlich geringer als die der bisher verwendeten Kompetitoren oder Inhibitoren, wodurch es dem Arzt möglich ist, den Wirkungsgrad der antibakteriellen Aktivität der Formulierung beizubehalten oder zu erhöhen mit einer gleichzeitigen Erhöhung des therapeutischen Verhältnisses oder Abnahme der toxischen oder Nebenwirkungen des Medikaments«

Neben der antibakteri®llen Wirksamkeit der voraus erwähnten

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Kompetitoren und Inhibitoren bei Menschen und in vitro können diese gegen Infektionen mit Mikroorganismen bei Haustieren, einschließlich Geflügel, beispielsweise gegen Pasteurelle multocida, aber besonders gegenüber die Protozonerkrankung durch Coccidiose verwendet werden. Coccidiose ist eine Erkrankung von beträchtlicher wirtschaftlicher Bedeutung bei Haustieren in der ganzen Welt, besonders bei allen Formen von Geflügel und sie wird durch Parasiten der Gattung Eimeria und Isopora der taxonomen Gruppe Coccidia bewirkt. Es sind zwei übliche Arten dieser Infektion bekannt: die akute oder 'caecale' Form, die durch das Cocci- dium Eimeria tenella verursacht wird und durch eine schwere Haemorrhagie an oder um den 5· Tag der Infektion gekennzeichnet ist und die kronische oder 'intestinale' Form, die durch verschiedene Arten der Gattung Eimeria, einschließlich E.acervulina, E. necatrix, E. maxima und E.brunetti veranlaßt wird.

Es ist beispielsweise bekannt, daß bestimmte Sulfonamide wie üulfamethazin, Üulfadiazin, Sulfadimethoxin und besonders öulfachinoxalin gegen Coccidiose bei Geflügel wirksam sind, obgleich die erforderlichen therapeutischen Dosen toxische Nebenwirkungen veranlassen können.E3 ist weiterhin bekannt, daß bestimmte 2.4— Diamino-5-benzyl- oder -5-pnenyl-pyrimidine, im besonderen die 5-^ubstituierten (3'-Niedrigalkoxy~ j benzyl)-pyrimidine und besonders 2.¹\— Diamino-5-(3* .4'-d.imethoxybenzyl)-pyrimidin, nachfolgend als 'Diaveridin¹ be-

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zeichnet, gegen diese Erkrankung wirksam sind. .Obgleich diese Pyriraidininhibitoren des bakteriellen Metabolismus im allgemeinen teurer herzustellen sind als die Sulfonamide und hinsichtlich des Gewichts weniger wirksam" sind, wirken sie synergistisch mit den SuIfonamidenj sodaß geringere Mengen des Gemischs gegen die Erkrankung wirksam sind, wobei die wirksame Dosis von Sulfonamid um einen Paktor bis zu 10 reduziert werden kann.

Die Potentiatoren der vorliegenden Erfindung und im besonderen die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) können vorteilhaft mit Kompetitoren und Inhibitoren, die gegen die Coccidiose wirksam sind,kombiniert werden, wodurch man eine wirksame Dreierkombination bildet und in manchen !fällen können die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) allein, beispielsweise gegen E. acervulina, wirksam sein.

Es wurde festgestellt, daß die Kombination von Sulfachinoxalin mit Diaveridin und DMHP besonders wirksam ist. gegen Ooccidiose bei Geflügel, im besonderen bei Kücken. Eine solche Dreierforraulierung ist in geringeren Konzentrationen als die ßuifonamid- oder Pyrimidinkoroponenten allein wirksam, ermöglicht eine bessere Kontrolle der Infektion und ermöglicht feine Aktivitätserhöhung um das Drei- bis Vierfache gegenüber den bisher bekannten Zubereitungen. Diese Formulierung hat weiterhin den Vorteil einer insge-

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2233536 ti

samt zufriedenstellenden Wirksamkeit gegen alle relevanten Eimeria-Spezies, die diese Erkrankung beim Geflügel verursachen.

Die Verbindungen der Formulierung gegen Ooccidiose können vorzugsweise allein oder kombiniert als Additiv zur Einmischung mit dem Geflügelfutter oder der Tränke dargeboten, werden. Dieses Additiv kann ein konzentriertes Futter-'Vorgemisch¹ oder ein Tränkadditiv sein, das die gewünschten Verbindungen in verdünnter Form im Vergleich zu den Verbindungen allein enthält, jedoch in konzentrierterer Form vorliegt, als sie dem Geflügel verabfolgt werden soll.

Als Futtermittel-'Vorgemisch' werden die Verbindungen zusammen mit irgendwelchen anderen verträglichen Wirkstoffen wie Antibiotika, Vitaminen oder Mineralien nach Wunsch mit Trägern oder Streckraitteln wie Kleie, gemahlenem Maie, Hafer oder anderen Getreidearten, Weizenvormehl, Hülsen oder bchnlen, verdaulichen Pflanzensubstanzen, Mehl, Sojabohnenmehl, Backabfällen und ähnlichen Futtermitteln und möglicherweise anderen Streckmitteln wie gekörntem Kalkstein und Grit gemischt, wobei die Komponenten gründlich durch herkömmliche Verfahren, wie Feinverteilen, Rühren, Mahlen oder Trommeln, gemischt werden. Das Gemisch wird dann als Pulver oder als Zubereitung in kleiner Partikelform dargeboten oder es kann weiter in Pellets oder ähnliche Futteradditive verarbeitet werden. Dieses Futtermittel-¹Vorge-

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misch¹ wird dann in anderen .Futtermitteln in einer Konzentration von beispielsweise 1 kg pro 100 kg Futtermittel, abhängig von der Konzentration der Wirkstoffkomponenten in dem Vorgemisch, zugegeben. Es können jedoch auch fertig gemischte Futtermittel, die die Verbindungen in geeigneter Form enthalten, zur unmittelbaren Verabfolgung an das Geflügel hergestellt werden.

Wenn die Verbindungen als Tränkadditive dargeboten werden, werden sie normalerweise in Form ihrer Säureadditionssalze verwendet. Diese können in feinverteilter fester Form, gegebenenfalls mit anderen löslichen Additiven, .oder sie können als 'Konzentrat', das die Verbindungen in Lösung in geeigneten Lösungsmitteln enthält, dargeboten werden. Dieses Pulver oder Konzentrat kann dann dem Trinkwasser zugegeben werden. Dieses Verfahren der Darbietung in Form eines Trinkadditivs ist nicht so geeignet wie ein Futtermitteladditiv, weil die TrInkaufnahme bei Geflügel variabler ist als die Futteraufnahme.

Konzentrationen von etwa 50 bis 100 ppm (d.h. 0,003 bis 0,01%) Potentiator im Geflügelfutter zusammen mit 10 bis 60 Teilen Diaveridin oder oulfachinoxalin liefern bereits eine verbesserte Wirkung^ wobei jedoch die besten Ergebnisse mit Dreierkombinationen dieser Komponenten erzielt werden. Obgleich ein veiter Bereich von Konzentrationen der Komponenten in solchen Dreierkombinationen geeignet sein

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kann, sind relative Konzentrationen von etwa 5 bis 250 ppm Potenbiator, vorzugsweise 10 bis 90 ppm und etwa 10 bis 100 ppm von jeweils Diaveridin und üulfachinoxalin, vorzugsweise 15 bis 60 ppm besonders wirksam. Während bei niederen Gesamtarzneimittelkonzentrationen ein 1:1 oder 2:1 Konzentrationsverhältnis von üulfachinoxalin zu Diaveridin besonders bevorzugt wird, kann dieses Verhältnis auf ein 4:1 Verhältnis bei höheren Konzentrationen des Gesamtarzneimittels erhöht werden.

Ersetzt man DMHP durch sein 6-Methylanalog, so erhält man eine zwar bemerkenswerte aber weniger ausgeprägte potenzierende Wirkung gegen Goccidiose.

Wach der vorliegenden Erfindung werden daher in weiterer und besonderer Hinsicht vorgesehen ,

(a) eine Zubereitung, wie vorausgehend definiert,, worin der Potentiator eine Pt eridinverbindung ist, wie 2-Amino-4-hydroxy-7«8-dihydropteridin, das in 6-bteilung durch ein Kohlenstoffatom substituiert und in 7-Stellung bisubstituiert ist. Im besonderen enthält die Zubereitung eine Verbindung der Formel (I), wie vorausgehend definiert, im besonderen eine solche mit einer Dimethyl- oder Diathylsubstituierung in 7-^tellung}

(b) eine Zubereitung, wie unter (a) angegeben, die die Verbindung der Formel (I) enthält, worin K eine 6-Alkyl- oder

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eine 6-Hydroxyalkylgruppe ist. Die Alkylgruppe ist vorzugsweise eine Methylgruppe;

(c) eine Zubereitung wie unter (a) angegeben, die eine Verbindung d®? Formel (I) enthält, worin R eine Phenoxyalkylgruppe, besonders eine Phenoxymethylgruppe ist;

(d) eine Zubereitung wie unter (a) angegeben, die eine Verbindung der !Formel (I) enthält, worin B eine Halogensubstituierte Alkylgruppe ist. Besonders bevorzugt werden mono- oder disubstituierte Verbindungen, besonders mit Bromsubstituenten;

(e) eine Zubereitung, wie vorausgehend definiert, die eine, wirksame potenzierende Menge eines Poteritiators in Kombination mit einer wirksamen Menge sowohl eines Kompetitors als auch eines Inhibitors enthält;

(f) eine pharmazeutische !Formulierung, die irgendeine der oben definierten Zubereitungen zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält;

(g) eine pharmazeutische !Formulierung wie unter (f ) in flüssiger Form, deren Verwendung zur Inhibierung der Bildung von Dihydrofölsäure durch Mikroorganismen unter in vitro- oder in vivo-Bedingungen vorgesehen ist;

(h) eine pharmazeutische Formulierung, wie vorausgehend definiert, die in Form einer Packung von getrennt verpacktem Potentiator, Inhibitor oder !Competitor mit Anweisungen

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-ac- 2230536 9.9

dargeboten wird, um ihre Verwendung in Kombination zum Zwecke der medizinischen oder Veterinärbehandlung zu ermöglichen;

(i) eine pharmazeutische Formulierung zur Prüfung oder Behandlung von Goccidiensystemen und Infektionen, wobei man eine wirksame potenzierende HengeVon I)MHP in Kombination mit wirksamen Mengen von Sulfachinoxalin und Diaveridin Verwendet;

(j) ein Verfahren zur Herstellung einer Zubereitung oder einer pharmazeutischen Formulierung, wie vorausgellend definiert, bei dem wirksame Mengen der geeigneten Komponenten gemischt und in kombinierter Form dargeboten werden;

(k) ein Verfahren zur Behandlung und Vermeidung von Mikrobeninfektionen, wozu man dem Wirt irgendeine der Zubereitungen oder pharmazeutischen Formulierungen, wie vorausgehend definiert, verabfolgt';

(1) ein Verfahren zur Inhibierung der Bildung von Dihydrofolsäure durch Mikroorganismen, wozu man die Mikroorganismen mit einer Zubereitung odor pharmazeutischen Formulierung, wie vorausgehend definiert, in Kontakt bringt.

Beispiel 1

Potentiell wirkende PteridimnrUi^oniriten können dadurch geprüft wcM-ei en, daß mau ihre Inhibi crungswirkung auf die

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Enzyme untersucht, die für die Biosynthese von Dihydropteroinsäure (DPtS), nämlich Hydroxymethyldihydropteridinpyrophosphokinase (HMPPS) und Dihydropteroatsynthetase, nachfolgend als 'Synthetase'bezeichnet, verantwortlich sind.

1) HFlPPS

2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7.8-dihydropteridin. (HMPt)+ATP Mg²* 2-Amino-4--hydroxy-6-pyrophosphoinethyl·-

7.8-dihydropteridin(Pt)+AMP.

2) Synthetase

Pt + p-Aminobenzoesäure(pAB) Mg * dihydropteroinsäure (DBtS)+ Pyrophosphat.

(a) Es wurde eine Untersuchung für HMPPS durchgeführt, bei der die Übertragung des endständigen Phosphatteils von ATP-Y"-p^y zu Pt festgestellt und mit dem Inhibierungsausmaß. von HMPPS durch die unter Versuch stehende Verbindung in Wechselbeziehung gestellt werden konnte.

Die unter Versuch stehende Verbindung wurde in verschiedene Formulierungen eingebracht, die Metabolite und Enzyme enthielten und in Reagenzgläsern, enthalten waren, wie dies in Tabelle 1 angegeben ist.

Die in der Tabelle -*- angegebenen Komponenten des Gemische haben die folgende Bedeutung:

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I. 2-Amino-4-hydroxy-6-hydrox,yniethyl-7.8-dihydropteridin (HMPt) in einer Konzentration von 800,uM, d.h. mikromolar

II. eine Quelle von HMMPö, erhalten aus einem Extrakt von E.coli und abgetrennt von der 'riynthetase¹ über Sephadex G-100 nach dem Verfahren von Richey und Brown in J.ßiol. Chem.244, 1582-1592 (1969)

III. 3 mM ATP -T-P⁵²

IV. 0,10 M ATP neutralisiert (nicht indiziert)

V. 0,02 H MgCl₂.6H₂O

VI. 0,1 M MgCl₂.6H₂O

VII. Qulle von I1MPPÜ und 'Synthetase¹

VIII.die Versuchsverbindung in einer Konzentration von

0,93 x 10~⁵ M

14 IX. 0,4- mM pAB-C¹^

Wie der Tabelle I zu entnehmen, enthalten alle Reagenzgläser 1 bis 9 eine Quelle von HI¹IPPS₁ indiziertes ATP und 0,02 M MgCl₂.6H₂O, die Reagenzgläser 2 bis 9 zusätzlich HMPt und die Reagenzgläser 4 bis 9 weiterhin die unter Versuch stehende Verbindung. Die Kontrollreagenzgläser 10 bis 12 enthalten sowohl eine Quelle von HMPPS als auch Synthetase, nicht indiziertes ATP, 0,1 M HgOIp.6H^O und indizierte pAB.

Die Reagenzgläser 1 bis 9» die die in der Tabelle I ange-

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gebene Menge an Komponenten aufweisen, wurde auf 200/ul. ■mit destilliertem Wasser aufgefüllt, 60 Minuten bei 37 G bebrütet und dann auf Eis abgeschreckt. Dextrose (20λι1 mit einem Gehalt von 72,1 mg/ml) und Hexokinase (5/ul mit einem Gehalt von 2000 Einheiten/ml) wurden zu der Lösung zugegeben, die man dann 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen ließ. Man gab dann 'Darco-G-GO¹ (Warenzeichen) (10 mg) zu jedem Reagenzglas und der Inhalt wurde periodisch alle 10 Minuten gemischt. Die Kohle wurde durch ein "Millipore AP 250 2200'-(Warenzeichen-Filter entfernt und das Filter mit drei 10. ml Portionen kaltem Wasser gewaschen, Die Kohle und das Filter wurden dann radioaktiv ausgezählt.

Die radioaktive Zählung aus dem Gehalt der Reagenzgläser 2 und 5 wurde dann als maximale Zählung angenommen, da diese Röhren keine Testyerbindung enthielten und daher eine O^ige Enzyminhibierung aufwiesen. Der gebildete Prozentsatz an Inhibierung des Gehalts der übrigen Reagenzgläser konnte dann dadurch errechnet werden, daß man ihre radioaktive Auszählung mit dem Maximum, das wie oben angegeben bestimmt wurde, in Relation setzt.

Der Inhalt der Reagenzgläser 10 bis 12 wurde chromatopjraphisch, wie unter Teil (b) beschrieben, analysiert und als Kontrolle verwendet, wobei die Reagenzgläser 10 und 11, die keine unter Versuch stehende Verbindung enthielten (und damit eine O^frige Iilhibierung aufwiesen, den Wert 100$

. · -51-

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223853ft

erhielten. Der durch den Inhalt der Reagenzgläser in Teil (b) ausgewiesene Prozentsatz der Inhibierung des Versuchs konnte dann hierzu im Verhältnis gesetzt werden, wozu man die entsprechenden Chromatοgramme vergleicht.

(b) Die Aktivität der unter Versuch stehenden Verbindung gegen 'Synthetase' wurde wie folgt durch Beobachtung der

14 Formulierung von Dihydropteroat-C festgestellt.

Ein Vorrat an Pt wurde aus neutralisiertem ATP (50 /Ul, 0,1 M), MgGl₂.6H₂O (50,ul, 0,1 M), Dithiothreit (100All, 0,1 M), tris-Puffer (100,ul, 0,4 M, p_fi 8,3), HMPt (25,ul, 876/uM) und170/Ul einer Lösung mit dem Gehalt von HMPPS hergestellt. Dieses Gemisch wurde 60 Minuten bei 37°C Gebrütet, kurz auf Eis abgeschreckt und dann wurden Dextrose (100/Ul, Gehalt 72,1 mg/ml) und Hexokinase (20,ul, Gehalt 2000 Einheiten/ml) bei Raumtemperatur zu der Lösung zugegeben, die man dann bei dieser Temperatur 15 Minuten stehen ließ.

Eine Lösung von MgOl₂.6H₂O (10,ul, 0,1 M), pAB-0 (10,ul, 0,4 BiM)₁ Dithiothreit (20,ul, 0,1 M) und tris-Puffer (20 ill, 0,4 M, pjj 8,3) wurde in jedem von fünf Keagenzgläesern hergestellt und dann wurden 80 AiI des Vorrats zu jedem Reagenzglas zusammen mit 8ynthetase und/oder der Versuchsverbindung, wie in Tabelle Il angegeben, zugegeben. Die Lösung wurde dann auf 200 ,ul mit destilliertem V/asser

aufgefüllt.

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ei jede Al¹P

2238

Es wurden zwei Kontrollen hergestellt, wobei jede

0,1 M), MgGl₂.6H₂O (1OyUl, 0,1 M), Dithiothreit 0,1 M), tris-Puffer (20^uI, 0,4 M, p_H 8,3), pAB-C (10,Ul, 0,4 τπΜ-) und 20yUl einer Lösung mit IMPPS und 'Synthetase¹ bekannter Aktivität enthielt. Die unter Versuch stehende Verbindung wurde dem zweiten diesel* beiden Reagenz gläser bis zu einer Endkonzentratian von 10"^ M zugegeben und dann wurden beide Gläser mit destilliertem Wasser auf 20OyUl aufgefüllt. . '

Alle sieben'Reagenzgläser wurden dann $0 Minuten bei 57°^ögebrütet, auf Eis abgeschreckt und dann diese zusammen mit den Kontrollgläsern 10 bis 13 vom Teil (a) wie folgt chromatographisch analysiert:

y des Inhalts von jedem der Reagenzgläser wurde zur Tüpfelanalyse auf Whatman Hr, 3MM Chromatographiepapier (2 χ 20 cm) bei dem 'Ausgangspunkt' aufgetragen, wobei der Ablauf durch Sinken in-einem Sjirenson-Puffer von Kalium- und Eatriumphosphaten (0,1 M, P_H 7»0) 10 bis 15 cm beobachtet wird. Aus den relativen Stellungen der Elecken, die man aus dem Inhalt der verschiedenen Reagenzgläser erhält, konn ten die verschiedenen Prozentsätze der Inhibierung von Synthetase in Bezug auf die Kontrollreagenzgläser 11 und 12 bewertet werden, die eine O^ige Inhibierung angaben.

Die Spalte (X) der Tabelle Γ und die vierte Spalte der Tabelle II geben den Prozentsatz der inhibierung an, den DMHP als Versuchsverbindung aufweist.

Verbindungen, die bei diesen Untersuchungen eine Inhibierung bei eiwr Konzentration von 1üÜyuM oder werii-.\.?.·

liefern, weisen eine brauchbare Potenzierungewirkung auf und können auf Grund ihrer günstigen Toxizität in den Zubereitungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Die Ergebnisse der Inhibierung _r die durch die bevorzugten Potentiatoren dieser Erfindung erreicht werden, sind in der Tabelle IXX angegeben.

Beispiel 2

"KlassifizierungBuntersuchungen¹¹ (Screening tests) wurden durchgeführt, um die Wirksamkeit der Verbindungen der formel (I) sowohl allein als auch in Kombination mit einem !Competitor und/oder einen Inhibitor nachzuweisen und die zweckmäßigsten Höhen der relativen Konsentrationen von jeder Komponente zur Bekämpfung oder Verhinderung von Coccidiose zu bestimmen.

Gruppen von ⁿRanger"-Hähnchen in kleinen erwärmten Käfigen mit Drahtboden, die in umgebungageateuerten Isolierräumen untergebracht waren, wurden oral mit sporentragenden Oozysten von Eimeria epp wie 2. tenella oder E.aoervulina infiziert. Die geeignete Versucheverbindung bzw. Versuchsverbindungen (DHHP₁ Sulfachinoxalin (8QX) oder Diaveridin (DT) oder irgendeine Kombination von diesen) wurden in einer geringen Menge einer spezifisch formulierten Laboratoriumsration mit Vitamin !-Mangel (¹L.D.4 mash¹) als 1/10 Vorgenisoh eingebraoht, daa dann In das futter mittels einer

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sr

horizontal arbeitenden Walzentrommel eingemischt und Gruppen von Kücken einen Tag vor der Infektion verabfolgt wurde, wobei einige Gruppen als Kontrolle nicht behandelt wurden» Die Verabfolgung wurde mehrere !Tage, beispielsweise ß oder 9 Tage fortgesetzt.

Das Ausmaß der Schädigung, erkenntlich durch Schäden in den coekalen Wandungen, wurde bei den Kücken, die während dem Ablauf des Versuche eingingen,und bei den anderen, die am Endtage der Verebfolgutig getötet wurden, untersucht und mit den nicht behandelten Kontrollen als Basis zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit verglichen. Zusätzlich wurde das Mortalitätsverhältnie und dae Gewiehtsverhältnis der Zunahme bei den verschiedenen Gruppen bestimmt. Eine merkliche oder begrenzte Wirkung des verabfolgten Areneimittels konnte sogar dann festgestellt werden, wenn die Mortalitätsverhältnisse ähnlich oder gleich waren, weil die Erhöhung der Gewichtszunahmen und die Verringerung des Ausmaßes der Schäden, wie sich dies aus der Schadensbewertung ergibt, für eine Verbesserung typisch ist.

Versuch 1 Gruppen von 5« Ί Wochen alten Kücken wurden oral mit

200 000 mit Sporen versehenen Qozysten des Weybridge-ßtammes von E.tenella infiziert. Einen Tag vor dieser Infektion wurde DMHP. in Konzentrationen von 10, 30, 90 oder 250 ppm Futtermittel allein oder zusammen mit einem Geraisch von

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Diaveridin (30 ppm) und Bulfachinoxalin (30 ppm) verabfolgt und dies 8 Tage fortgesetzt. Die Mortalität durch Goccidiose und die Schäden, die 6 Tage nach der Infektion gemessen wurden, sowie die Gewichtszunahme dieser Tiergruppe wurde von dem Tag der Infektion bis zum 6. Tag nach der Infektion bestimmt und mit unbehandelten Kontrollen verglichen.

Versuch 2

Gruppen von 10, 1 Wochen alten Kücken wurden mit 200 000 sporentragenden Oozysten des Weybridge-Stamme von E.tenel-Ia infiziert und nach dem Verfahren des Versuchs 1 wurden Diaveridin/üulfachinoxalin-Gemische in Höhen von 60/60, 30/30, 15/15 und 7,5/7,5 ppm allein und zusammen mit IMHP in einer Konzentration von 100 ppm den Tieren Eur Bestimmung der potenzierenden Wirkung von DMHP verabfolgt.

Versuch 3

Gruppen von 10, 1 Wochen alten Kücken wurden mit 100 000 sporentragenden Oozysten von E.tenelle infiziert und mit einer unter-eptimalen Kombination (15/15 ppm) Diaveridin/ Sulfachinoxalin allein und zusammen mit DMHP in Konzentrationen von 3» 10, 30 und 90 ppm behandelt.

Verbuch 4-

Gruppen von 10, 1 Wochen alten Kücken wurden mit 100 000

uo^/sten von jj_f trueIla infiziert und es

. ■■ -26- .■■■. 309808/1333

wurden ihnen verschiedene Kombinationen von Diaveridin (10, 20 ppm)·, Sulfachinoxalin (2O₁ 40 ppm) und DMHP (10, 20 ppm), jede komponente einzeln oder zusammen entwede:r?rait einer oder den beiden anderen Komponenten verabfolgt, um festzustellen, ob DMHP eine stärkere Potenzierung mit Pyrimidin oder dem öulfonamidkoraponenten bewirkt,

Versuch 3

Gruppen von 5» 1 Wochen alten Kücken wurden mit 100 000 sporentragenden Qozysten von E. tenella infiziert. Es wurden Gemische von 5 Verhältnissen Diaveridin/Sulfachinoxalin von 1:1 bis 5*1 bei unteroptimalen Konzentrationen (40 ppm · insgesamt) rait DMHP in vier Dogen von 5 bis 40 ppm verabfolgt ι um den optimalen Anteil der drei Komponenten und damit die geringsten Mengen an erforderlichem Arzneimittel zu bestimmen.

Versuch 6

Gruppen von 5» 3 Wochen alten Küoken wurden mit 500 000 sporentragenden Oozysten des Weybridge-Stamms von E. aeervulina infiziert, wobei das Verfahren von Versuch 1 durchgeführt wurde und die unter Versuch stehende Verbindung bzw. Verbindungen 9 Tage verabfolgt wurden. Die Mortalität; an Coccidiose und die Schäden, sowie die Gesatitoozystenabgabe pro Tier während dem 5·»6, und 7« Tag nach der Infektion, sowie die Gewichtszuenahrae vom Tag der Infekbion bis zum 7» Tag nach der Infektion wurden bestimmt,

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Versuch 7

Gruppen von 5i 3 Wochen alten Kücken wurden wie in Ver-Buch 6 infiziert und einen Tag vor der Infektion wurde DMHF in Konzentrationen von 5, 10, 30 oder 90 ppm Futter aliein und zusammen mit einem Gemisch von Diaveridin (10 ppm) und Sulfachinoxalin (10 ppm) verabfolgt und dies 9 Tage fortgesetzt.

Versuch 8

Gruppen von 5» 3 Wochen alten Kücken wurden mit 5 000 OQQ sporentragenden Oozysten des Weybridge-Stamma E.acervulina infiziert und das Verfahren von Versuch 7 verwendet, außer daß DMHE allein in Konzentrationen von 5» 10 und 30 ppm verabfolgt wurde.

Versuch °/

Gruppen von 51 1 Wochen alten Kücken wurden mit 100 000 sporentragenden Oozysten des Weybridge-Stamms E. tenella infiziert und nach dem Verfahren von Beispiel 1 behandelt. 4-i1 Sulfachinoxalin/Diaveridingemische in Höhen von 80/20, 60/15» 4-0/10 und 20/5 ppm wurden allein und zusammen mit einer großen Vielzahl an geringen Konzentrationen von DMHP den Tieren verabfolgt.

Die Ergebnisse dieser Klassifizierungsuntersuchungen sind in der nachfolgenden Tabelle IV angegeben, in der die Kon-

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zentration der verschiedenen Komponentenverbindungen in ppm Tiernahrung, die Mortalität durch Goccidiose, der Prozentsatz der Gewichtszunahme, die Schadenbewertung, die Oozystenabgabe und die Aktivität bewertet wurden. Der coekale Schadenindex wird errechnet, wobei das nachfolgende Bewertungssystem verwendet wird:

0 = keine Schaden ·

1 = wenige Haemorrhagien (Blutungen), keine Eindickung

der coekalen Wandung

2 = mäßige Haemorrhagien, gewisse Eindickung der coekalen

Wandung

3 = zahlreiche Haemorrhagien mit vorhandenen coekalen Ge- ,

schwulsten

4 = zahlreiche Haemorrhagien, das Ooecum mit großen Ge-

sohwulsten erweitert.

Weiterhin wird bei jedem Tier, das während dem Versuch an Goccidiose eingeht, eine Bewertung von 4 eingesetzt.

Der Coekalschaden-Index =

(GesamtSchadenbewertung der überlebenden Tiere)+(4 χ Anzahl der eingegangenen Tiere)

Anfangszahl der Tiere

In der Spalte zur Kennzeichnung der Aktivität kennzeichnet +++ bzw. ++, +, + und - eine sehr hohe, hohe, leichte, zweifelhafte und keine Aktivität des unter Versuch stehenden Arzneimittels gegen die Eimeria—Infektion,

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Ergebnisse

Die Versuche zeigen, daß während DMHP allein bei allen untersuchten Konzentrationehöhen gegen die Infektion mit · E.tenella unwirksam war, durch DMIlF die Aktivität der Mehrzahl der geprüften Diaveridin/üulfachinoxalingemische in vielen Fällen um das 3- bis 4-Fache potenziert wurde, wodurch eine bessere Kontrolle der Infektion, ein merklicher Rückgang der coekalen Schäden und das Wiedererreichen des Gewichts der Tiere auf ihre Vor-Infektionswerte erreicht wurde. Obgleich eine Verringerung der Aktivität dann beobachtet wurde, wenn die Konzentration von DMHP gesenkt wurde, so läßt dessen Zugabe in Kombinationen sogar in einer Höhe von 10 ppm eine merkliche Verbesserung der Aktivität erkennen, während noch eine Verringerung nach der bchadensbewertung mit einem 4:1 Sulfachinoxalin/Diaveridingemisch bei der Zugabe von nur 5 ppm DMHP beobachtet wurde.

Weiterhin wurde festgestellt, daß nur eine geringe Potenzierung bei alleiniger Verwendung von Diaveridin oder bulfachinoxalin durch die Zugabe von DMHP in den angegebenen Höhen bei der Behandlung der E. tenella-Infektion eintritt und es scheint, daß das Dreiergemisch für die gute Aktivität erforderlich ist, obgleich die lJöglichkeit der Potenzierung einer einzigen Komponente in anderen Konzentrationshöhen nicht ausgeschlossen werden kann.

Eine große Vielzahl relativer Konzentrationen der drei

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■3 09008/1333

Komponenten lieferte günstige Aktivitäten, wobei jedoch festgestellt wurde, daß die Kombinationen besonders wirksam waren, wie sie bereits erwähnt wurden, nämlich solche, mit 15 bis 60 ppm Sulfachinoxalin, 15 bis 60 ppm Diaveridin und 10 bis 90 ppm DMHP. Die bevorzugten Konzentrationsverhältnisse von Sulfachinoxalin/Diaveridin waren 1:1 oder 2:1 bei niederen Gesamtarzneimittelkonzentrationen oder bis zu 4:1 bei höheren Konzentrationen.

Bei den Versuchen, die mit mäßigen Infektionen der intestinalen Spezies E. acervulina durchgeführt wurden, wurde festgestellt, daß DMHP allein bei Konzentrationen von 250 , und 90 ppm wirksam war, obgleich unter dieser Höhe die Aktivität abfiel , wie dies durch eine Senkung des Prozentsatzes der Gewichtszunahme und aus der Erhöhung der Oozystenabgabe zu schließen ist. In ähnlicher Weise war ein 10 ppm Diaveridin/10 ppm öulfachinoxalingemisch allein relativ unwirksam, wobei jedoch die Zugabe von DMHP eine bemerkenswerte Erhöhung der Aktivität brachte, die bei der geringsten Konzentration an verwendeten DMHP erreicht wurde.

Eine Erhöhung der Infektion liinsichblich des Umfangs der Anzahl von Oozysten von E. acervulina, die als Infektionsquelle verwendet wurde, führte zu einer Inakbivibät sowohl von DMHP alLein als auch eines 10. ppm Diaveridin/Iü ppm uuLt'-ichinoKalingomischs. Die Dreierpobenzierung wurde durch

309803/ !3 3 .1

die Zugabe von DMHP zu dem Gemisch nachgewiesen, wobei die Infektion bei allen Konzentrationen des unter Versuch stehenden DMHP kontrolliert wurde.

Beispiel 3

Ein weiterer Versuch wurde durchgeführt, um zu prüfen, ob eine Verbindung der Formel (I) entweder einen !Competitor und/oder einen Inhibitor potenziert bei der Bekämpfung oder Unterdrückung der bakteriellen Infektion mit Pasteurella

multocida.

Versuch 1

Gruppen von 10 Kücken wurden oral mit 8 χ 10 Organismen von Pasteurella multocida infiziert und zwei Tage vor der Infektion wurden Gemische von 85/15 öulfachinoxalin/Diaveridin allein oder zusammen mit DMHP im Verhältnis von 50/20, 50/10, 50/5, 25/20, 25/10 und 25/5 ppm Futter verabfolgt, wobei einige Gruppen als Kontrollen unbehandelt blieben. Es wurde die cumulative Mortalität vom Infektionstag an und die Gewichfcszunahme als Prozentsatz der Gewichtszunahme von nicht infizierten Kontrollen bestimmt und die Ergebnisse in der Tabelle V angegeben.

Versuch 2

Ein Versuch wurde nach dem Verfahren von Versuch 1 durchgeführt, bei dem jedoch 85/15 Gemische von üulfachinoxalin und Trimethoprim (TMP) mit DMHP in Verhältnissen von. 25/2O₁

3 0 9 ft 08/1333

25/10, 25/5, 12,5/20, 12,5/10 und 12,5/5 kombiniert wurden, Die cumulative Mortalität vom Zeitpunkt der Infektion an ist in der Tabelle VI angegeben. .

Aus den Ergebnissen des Versuchs 1 ist zu ersehen, daß Diaveridin allein geringe Aktivität und sehr geringe potenzierende Wirkung auf Sulfachinoxalin hat, das allein gute Aktivität aufweist. Die Zugabe von DMHP liefert sogar bei 5 ppm im Futter eine merkliche Erhöhung der Aktivität des Diaveridin/Sulfachinoxalingemischs. Bei dem zweiten Versuch wurde eine geringere potenzierende Wirkung durch DMHP auf die Kombination von Trimethoprim und Sulfachinoxalin bei den verwendeten Dosierungen beobachtet.

Beispiel 4 ■

Bei weiteren Versuchen hinsichtlich der antibakteriellen Wirksamkeit von Sulfamethoxazol und Trimethoprim, wenn sie mit DMHP entweder einzeln oder als Dreierkombination kombiniert wurden, potenzierte DMHP die einzelnen Aktivitäten von Sulfamethoxazol und Trimethoprim gegen Staphylococcus aureus und erhöhte weiterhin die synergistische Wirkung dieser Arzneimittel., wenn sie zusammen angewendet wurden. Die Tabelle VII faßt die Ergebnisse von einem Versuch zusammen, der in Wellcome Nähr-Agar durchgeführt wurde, wobei die Inkubation 18 Stunden bei 57°O foitgesetzt wurde.

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Beispiel 3

Die Potenziei-ung durch UMIiP wurde ebenso durch die Akzentuierung der Inhibierungswirkungen von Trimethoprim und öulfamethoxazol auf die Wuchsgeschwindigkeit, festgestellt durch Trübungsmessungen, von !Staphylococcus aureus W 491 während einer 7-stündigen Bebrütung in Wellcome-Nährbrühe bei 37°G nachgewiesen. Bei diesen Versuchen wurden unter der Wirkungsgrenze liegende Dosen von Trimethoprim und öulfamethoxazol verwendet, wobei der Prozentsatz der Inhibierung in der Tabelle VIII angegeben ist.

Beispiel 6

Die Ergebnisse eines ähnlichen Versuchs, wie er in Beispiel 4 beschrieben wurde, sind graphisch in der Tabelle IX dargestellt, wobei die Wuchsgeschwindigkeit spektrophotometrisch gemessen wurde. In dieser Tabelle ist der Prozentsatz des erhaltenen Wuchses durch den farbeinheitlichen Streifen dargestellt, wenn 10/Ug DMiIP pro ml ebenso vorhanden waren und es ist ein gefleckter streifen, wenn es nicht vorhanden war.

Dieser Tabelle ist zu entnehmen, daii DMHP nicht nur die Wirkungen von Trimethoprim und öulfamethoxazol fördert, wenn diese Arzneimittel einzeln wirken, daß aber das Vorhadensein im allgemeinen die Wirksamkeit ihrer Kombination verbessert und potenziert.

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HS"

Beispiel 7

In diesem Versuch werden die Wirkungen von DMHP auf die bakterizide Aktivität bei Staphylococcus aureus von Trimethoprim und Sulfamethoxazol, einzel und in Kombination bestimmt. '

Die Ergebnisse sind in der Tabelle X angegeben, wobei die bakterizide Aktivität als Prozentsatz des Anfangsinoculums ausgedrückt ist und gemessen wurde durch Zählen der lebensfähigen Bakterien, die nach ?Λ Stunden Bebrüten bei 37°0 noch am Leben waren. Das verwendete Inoculum lieferte eine Endkonzentration von 10 Organismen pro ml.

Bei diesem Versuch waren, obgleich weder Trimethoprim bei 1,0/Ug/ml noch Sulfamethoxazol bei 10/Ug/ml bakterizid ohne DMHP wirksam war, beide sehr wirksam, wenn 10/Ug/ral DMHP vorhanden war. Weiterhin wurde die bakterizide Wirksamkeit der Kombination von 0,1/Ug Sulfamethoxazol pro ml wesentlich erhöht, wenn 10/Ug/ml DMHP vorhanden war.

Beispiel 8

Bei diesem Versuch wurden die Bereichsangaben für den Inhibitor zur Bewerbung der synergistischen Wirksamkeit von DMiP oder sine 7.7-Diäthylanalogen auf ihre Kombination mit Trimethoprim (TMP) und/oder Sulfamethoxazol (SMX) gegen Staphylococcus aureus und Ptseudomonas aeruginosa unter-- ·

sucht.

309808/133 3

Das Pteridin wurde in ein Soja-Peptonraedium mit geringem Thymidingehalt ( Wellcotest Sensitivity Test Agar), das in einer Petri-Schale enthalten war, eingebracht und die andere Komponente bzw. Komponenten wurden in das Loch gegeben, das man durch Entfernen eines kleinen Pfropfens aus dem Medium bildet. Die Oberfläche des Mediums wurde mit dem unter Versuch stehenden Organismus geimpft und dann bebrütet. Das Ausmaß des Inhibierungsbereiches ist in der Tabelle XI angegeben, wobei die Zahlen die vollständige Inhibierungszone (d.h. die Zentimeterzahl von der Kante des Loches nach etwa sechsfacher Vergrößerung) und die Zahlen in Klammern die Zonen der Teilinhibierung angeben.

Die Ergebnisse zeigen, daß die beiden Verbindungen mit TMP und SMX allein und mehrfachen Synergismus mit beiden gegen Staphylococcus aureus aufweisen, wobei das Diäthylanalog leicht wirksamer ist als DMHP. Eine Potenzierung gegen Pseudomonas aeruginosa ist ebenso bei DMHP festzustellen, wobei dieses die höhere Potenzierung gegen diesen Organismus aufweist.

Beispiel 9

Durch weitere Versuche konnte auf einem Standard-Nährmedium die Brauchbarkeit von Prüfscheiben für Formulierungen, die den Pobentiator mit einem Inhibitor und/oder Konipetit or des bakteriellen Wüchsea enthalten, nachgewiesen werden. Die Er-

aind in der TubeLLe XII angegeben,

-45-.

309808/1333

Beispiel 10

Bei diesem Versuch wurden Mäuse intraperitonal mit Staphylococcus aureus, die in 3$igem Schweinemagenschleira suspendiert waren, infiziert. Gruppen der Tiere wurden oral (P,Ο.) und intraperitonal (I.P.) mit Trimethoprim und Sulfamethoxazol einzeln und zusammen mit und ohne DMHP zweimal täglich 3 Tage lang behandelt. Die Ergebnisse, die in der Tabelle XIII angegeben sind, zeigen, daß DMHP die Schutzwirkung von TMP und SMX erhöhen.

Beispiel 11 - _: .......

Die Wirkung von DMHP auf die Wirksamkeit von Pyrimethamin allein oder zusammen mit Sulfamethoxazol wurde bei mit Protozoen von Toxoplasma gondii infizierten Mäusen geprüft.

Die zum Versuch verwendeten Mäuse wurden mit 0,5 ml eines 1.0~^ Exudats von Mäusen (500C) Protozoen) infiziert, was etwa 1000 LD^Q-Dosen entspricht. Die Behandlung wurde in der Weise durchgeführt, daß man die Verbindung oder die Kombination unmittelbar nach der Infektion, dann 6 Stunden später und wiederum 24 und 28 Stunden später verabfolgt. Die in der Tabelle XIV angegebenen Ergebnisse zeigen, daß DMHP die Antiprotozonwirksamkeit sowohl von Pyrimethamin allein als auch in Kombination mit öulfamethoxazol potenziert.

■^46-

309808/1333

Beispiel 12

Tablettenformulierung

BMHP (rein) 100 mg

■■Trimethoprim (rein) 25 mg

dulfaguanidin (B.P.C.) 100 mg

+ Maisstärke, Lactose, Gelatine, Talkum und Magnesiumstearat

Herstellung· - die oben angegebenen Bestandteile werden unter Verwendung bekannter pharmazeutischer Verfahren miteinander gemischt und granuliert und danach in Tabletten verpreßt .

Beispiel

Tablettenformulierung "Pyremathimine" (Pyrimethamin) B.P. 15 mg DMHP (rein) . 150 mg

Tablettenheretellung wie in Beispiel

Beispiel

Tablettenfürmulierung

Sulfat)iloraid Jj.P.O. I50 mg

I)MHP (rein) I75 mg

Tablettenhorstellung wie in Beispiel

309808/1333

Beispiel 15 Kapselformulierung l'rimethoprim (rein) DMHP (rein) 20 mg
rag

Herstellung - die Verbindungen wurden in körniger iorra zusammen mit Lactose, Maisstärke und Magnesiurastearat gemischt. Das Pulver wurde in zweiteilige Gelatinekapseln unter Verwendung einer Kapselfüllmaschine gefüllt.

Beispiel 16 bpüllösung

DMHE (rein) Trimethoprim (rein) Lösungsmittel 1 rag/ml 0,2 mg/ml Wasser

Beispiel 17 Spüllösung

DMHP (rein) oc-Amino-p-toluolsulfonamid (rein) 2 mg/ml 2 rag/ml

Beispiel 18 Lösung

DMHP (rein) Diaveridin B. Vet Kelfizina

Lösungsmittel

309808/1333 1|5 mg/ml Q-, 5 mg/ml 1,0 mg/ml

Wasser

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Tabelle 2

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Reagenz glas Nr,	Synthetase	Versuchsverbindung Endk onz entr at i on	i Inhibie— rung
1 2 3 4 5- Eontrollen	+ + +	' 8.7 χ 10"5M Ix KT5M ß 2.5 χ "IO M	9 O 5
6 •7		1 χ 10 "5 M	S3

Tabelle 3

VersuQhsverbindung .	R	Ε1)	R2	IC50 (yM)
CH2OH	Me	Me	2-4
- "Me	Me	Me-	75
CH2Br	Me	Me	,5
CH Br2	Me	Me	25
. CH2OH	Et	Et	2.1

309808/1333

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Tabelle 4 (Fortsetzung)

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		behänd. Kontrolle	•. SQX DV	SQX ,DV :			15		10	10			3.3	+	++ .·
		SQX + DV	' SQX DV + DMHP	SQX -DV + DMHP :		•	15 ' · ·	• · · -3 · ■ . · ·	. 10 .	0/10	100	0.0	•—· · ·
		SQX + DV + DMHP	DV				•	- ·			1.0
		SQX + 'DV + DMHP					10	6/10	4	2.6
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		SQX + DV + DMHP	15			-	0/10 . ·	95	■
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		nicht behänd.Kontrdls	15 ·	20	•20	0/9 .	61		-
		infiziert, nicht	IS ■	-	20	3/10	• - 31 ·	3.6	—
		behänd. Kontrolle		-	-			3.8	• -
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		20			3.8	-
		20	6/10	11	3.7	—
	10	. — .	• 8/10	18	3.2	·-
—	40	8/10	5	.3.8
	-	8/10.	16 ·	3.4
10 .	-	8/9	-el	3.8
—	40	5/9	15	3.9 .
10	40 .	. 7/10	27	3.6
10	40	3/10	26	2.8
20	" 8/9	18	4.0 ·
-	9/10	20	2.0
—	6/10	20	1.2
20	1/9	32
-	9/1Θ	19
20	0/10	80
20	0/10	90

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Tabelle 4 (Portsetzung)

such Behandlung	licht infiziert,	•	3.1	Konz.M	•	32	Konz.SQX	Konz.EMHP	Mortalität	f» Gew.I	öchad.	Γ	100	tung	^ktT^
	licht behänd.Kontrolle		Il	im Puttea	32	1 im Putter	im Putter	durch					srität
	infiziert, nicht be	η	ppm	32	ppm	vxxa	Kokzidiose	18	0.0
	händ. Kontrolle	Il		32
	■ 1:1	Il					0/20	97	3.£
		4:1		33.4				• 94
5		Il		33.4			19/20	Ö4	0.5
		Il		33.4				73	1.5
		Il ·	20	33.4	20	40	0/20		2.3	+++
	2:1	Il	20	20	20	0/20	97	2.8	++
		5:1	20	20	10	1/20	87		+
		It	20	20	5	2/20 ·	69	.0.9
	If. /					■ Ö7	1.4
		26.7	13.3	40	1/20		2.Ö	+++
		26.7	13.3.	20 ■	0/20	92	..3.2	++
	26.7	13.3 '	10	3/20	84
	26.7	13.3	5	Ö/20	.· 60	1.6
					ν 57	2.3
	30	10	40	0/20		■ 3.2 ·■	++
	30	10	20	7/72	94	3:5·	. .-
	30	10	10 . ■	7/19 ·	83		■ ·■ — ■·
	' 30 ' '	■· ίο · ■	■ " 5	11/20"^ '*·'***'·>■	71	1.5
				■ 40	2.7
	8	40	Ό/20		3.2
	8	20	3/20	100	3.7
	8	10	9/20	70		. - - i
	8	. 5 ■	.15/20	42	2.0	■··—
				31	3.4
	6.6	40	1/20	3.6	■ +
	6.6	20	7/20	3.9	-
	6.6	10	12/20	-
	6.6	5	18/20

!Tabelle 4 (Fortsetzung)

	V er	■	'0	Bshandlun* · KonzcDV	1:1	in Futter	20	nicht infiziert,	DMHP	30 30 30 30	Konz,SQX	η Futter	-	"" i-iortalrijat	250 90 ■ 30	■ ' ·	90	-ve	ft CrGV/.	Schad, iUrti-	vität	L	I
	sue			2:1	"ΡΤ3Π1	26.7	nicht behänd.Kontrolle	DMHP	30	r im Futter	■cm	-	durch	10	30		Zuaahr	e Bewer		..'	an
				3:1	30	infiziert, nicht	• DMII?			-	Koksi&iose		10 ' '	24.48 ;		tung	—
		4:1	32	behänd. Kontrolle	SQX + DV SQX + DV + DMHP SQX + DV + DMHP		20	-	5/20		5	-ve -ve -ve -ve	72	3.0	—	I
		5:1	33.4	' 'SQX + DV SQX + DV + DMHP SQX + DV + DMHP SQX + DV + DMHP	SQX + DV + DMHP SQX + DV + DMHP		13.3		16/20	90· 30	-ve	77	3 /8	-	;
				SQX + DV + DMHP			10	40	18/20.	10 5		23	3 .'9		i ί (
				nicht infiziert,		—	8:	20	19/20		-ve	2	• 4.0	—	-ί
				nicht behänd.Kontrolle		...	6.6	10	15/20			42	3.7		.;
				" I infiziert, nrcht.		„			19/20	11.45 5.06	7	3.9	—	i
		ι behänd. Kontrolle DMHP		10 10 10	-	18/20	4.57	■ 15	3.9	_
				10 10	-	19/20	8.84	2	3.9		I
					20/20	16.18		4.0
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	2	50	85	(uninfect	20	-			Kumulative Mortalität nach Tagen 1,2 3 4 56	-	-	-	-	-	1	1	1		1	Durchschnitt gewichtd. Kücken, Bag der Behandig ( κ )	261.0	Gewichts zunahme {$> der Kontrolle)	N?
	3	50	. ed)	10	-			-	-	2 ■	4	1	1	-	-	-	1	—	131	244.0	86	CO OO
	4	50		5			-	-	2	3	5	6	1	1	1		1	126.5	202.0	77	536,
	5	25	20	-	-	1	r-i	3	4	5	6	6	6	-	6	130.5	225.0	47
VJ	6	25	10	-	-	1	4	5	■4	5	5	5	5		5	127.5	179.0	. 64
O (O	■ 7 8	25	5	-	-	4	3	6	6	7	6	6	6		6	124.5	131.0	36
CD O	9	100 ".' 50	-		3	5	..5	8	10	9	9	9	9	130.5	233.5 105.0	-
ο»	10	25	-	Ml	2			6	6					132.0 122.0	-	67
'133		DV SOX	-		2	2			7	7	7	7	129.0	140.0	-
ω	11	30 -	-	1	-	-	5	. 8					131.0
	12	15		—■	-	-	■-		9	IC			-
	13	-	-	3	6	-ι	1·.				126.0	259.5	-
	14	-	3	-	-	9	9	1	1	1	133.0	234.0	84
	15	-	-			-	-	10			130.0	-	69
		-					-	-	-	126.5	282.5	■ -
		-						131.0		100
				,.■ . .ν...	I

Tabelle 6

CO O CD CO O OO

co ca

Gruppe	15:85 TMP SQX	MHP	20	1	Kumulative Mortalität	3	4	5	6	an c	len Tagen	1	-	7 ,	Ho	11	1
	ppm	ppm	ιό ■	0	2	.2	2	5	5.·	7	8 <5		8	7	7
1 '	25	.5	0	1	4	5"	1S	8	6	7	9 :	8	8
2.	25	20	0	4	4	7	9	9	8	8 :	9	9	9
3	25	10	0	4	.2	5	7	8	9;	9		9	'■9
4	12.5	5	0	2	3	■ 6	10		8	9
5	12.5	-	0	3	4	7	10				0
6	12.5	-	0	4	0	0	0	0				0	0
7	50 ' "	-	0	0	1	5	9	9	0	0
8 ·	25,		0	1	6	8	9	9	10
9	12.5 '	-		4					10
	TFP , SQX	tem	0		4	8	10
10	15	- ■	0	4	5	8	8	10			1		•
11	30 - '	-	0	2	0	1	1	1				1
12	85 .	mm	0	ρ	6	7	10		1
13	42.5		3	5	4	7	9	10
I 14 !		3 '

TO

co

OO ¹ cn co OT

Tabelle 7

CS CD O

Wi.l.C. in iig/ml und Erhöhung der Aktivität von Sulfamethoxazol und • Trimethoprim

Kons. von DMHP ug/ml

i

-

]

DMHP

keine

Sulfamethoxazol

Aktivität

Trimethoprim

Aktivität

Trimethoprim in Gegenwart von χ 20 Sulfameth oxazol

Aktivität

'ver bin- - dung

M.I.C

■

M.I.C.

M.I.C.

25 12.5 6.2 3.1

' 1.0

X 100 . X 10 χ 10 χ 1

0.3

χ 300 χ 30 χ 30 • :Χ 10

0.015

>χ 300 · χ 100 - χ 30 χ 10

0.03 0.3 0.3 1.0

0.0015 0.015 0.015 0.05

<O.00015 0.0005 0.0015. 0.005

ro ro co OO

co CD

	Arzneimittel	ug/ml D	Tabelle 8·	6 12 1 ·	■ DMHP · 5 ug/ml	Vers.2	DMHP 10 ug/ml	Vers.2	-	223853
	Trimethoprim	I 'SuIfamethoxazol		14	rers , 1	3 1' 99	Vers.1	55 39 96		CD
	0.004 0.002 0.002			1	0 0 74	• 97		99
	0.002	O-.l		8	95 .	98 '		.98
09808/1:	0.001	0.2		10	96	■89		97
co	-	0.1		20	98		90
		' 0.1	Prozentsatz der Inliibierung nach 7 Stdn.	51
		..0.2	DMHP kein	85 0 97
	Vers.1 Vers,2 i	98
	8 10 17	97
19	87
o ·	94
16
34

- 46 - .

Tabelle 9 **

Trimethoprim

Trimethoprim SMX"1.0 ng./ml

Trimethoprim

+
SMX 0.3 μβ./ml.

Trimethoprim

♦
SMX 0.1 μβ./π>1.

Trimethoprim

+ Ss

SM 0.05 Hß./ml. ,50*

Sulphamethoxazol

0.01 0.05 0.1 0.5

Trimethoprim - pg./ml.

309808/1333

Tabelle 10

ο co co

co

CO

Behandlungsmittel - μ^/ηϋ	Sulfametlioxazol	Prozentsatz des	Versuch 2	Lebensfähigen Inoculums nach 24 Stdnj.	DMHP 10 us/ml	Versuch 2	Vers .J	Vers.2
Trimethoprim		. DfilHP kein	> 100	DMHP ,5 jUft/ml	-	15	. 7
	-	Versuch1	> 10°	Versuch 1	-	> 100	>100
1.0	-	>100	85 I 1		- ..	0.33	24
0.3	1.0	>100	>100		-	> 100	>100
o.i ■	1.0	>100	)100		-	45 .	>100
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-	10.0	>100
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BAD ORIGINAL 3 0 9 8 0 8 /1 W3^:-^;

Tabelle 13

- 64 -

TPM	2.0	SMX	]	—	•	0.5	DMHP	I.P.	Ourch-	Über	Verbesse	/
ng/Maus		mg/Maus				mg/i/laus		sclinitts-	leben	rung deli.	±
							Pagc		DMHP	—
	1.0	-.			-	Überleben	O		/
			0.25	m t	2.0	6.33	O	+
			2.0		6.80	O	+
0.5	*"			-	4.00	O
	2.0	0.25	_	1.0	2.0	O	+
	1.0		1.0		4.83	O	/
	0.125	-	0.5	3.50	O	/
		O. 5		1.50	O	/
		—	-	3.83	50	+
				10.83	50	+
		-	—	10.50	O	4-
			2.0	3.66	O	+
		2.0		6.83	O
		-	1.0	4.60	O	(
1.0	-	1.Ü		5.O	O	?
			„	4. 16		/
0.5		0.5		O	/
	0.5	-	1.83	O	±
			2.16	100	—
	-	-	14	66.6	./
	W.	0.5	12.60	16.6	/
	0.5		13.50	O	/
	-	2.0	7.16	O	/
	2.0	—	<0.16	O	/
	—	1.0	0.83	O	/
•4 ,. „	1.0	—	<0.16	O	/
-	0.5	0.16	O
0.5	-	<0.16	O
-		0.16	O
-	0.16

309808/1333

Tabelle 14

Arzneimittel mg/iiaus DMHP mg/Maus

Sulfat
oxazol

eth- ' Pyrimethamin

onne

2 mg oral

2 mg intraperitonal

durchschnittl. _# durchschnittl. _# durchschn.

Überlebenszeit ^Überleben Überleb.Zeit fo Überleben Überleb. ^Überleb. e _: lage Zeit_tTac:e

0,8 0.4 0.2

0.1 M5.33 >18.83 10.16 8.16

33.3	>17.83
33.3	>17.0
O	9.16
O	7.83
16.6	^ 24.5
33.3	5- 18.5-
O	> 15. ■ 16
16.6	10.83

50

33.3 O O

4.0 >12.0 8.66 6.16

O O O O

0.4 0.2 0.1 0.05 >19.33 >19.33 11.0 >12.83

66.6

33-3 .16.6 O

12.5 10.16

50 16.6

O •

nichtbehandelte Mäuse

6.5

7.0

6.33

	Organism en _,	\	Stannyl ο co c cus	Grosse	+ K	Tabelle 12	-X-	in	1	cm	(6fache Vergrösseruz	TMP 4	SMX 23.75μ£	DMHP
	aurcus Cd 491	TMP 1Γ25 μ		des Bereichs	DMHP OO μg	SMX ■ 23.75		ν-ε		kein DMH?	+ DM-JP 100 μ5	100 pg
	Streptococcus	kein DMPIP		24	kein DMHP		DMr 00 \.	iP ig	34	36 .	0
	faecal.is CW 478	21			26		28
3098	Escherichia			34					36	36 '	10 '
C?	coll CiJ 314 Proteus vul^aris	28			0		14				■ - 0"
co	CN 329 Pseudorronas			34					38	38	0
	nyru--inosa CN 200	34		20	28 "		28		42	42	0
CL? UJ		19		26	36		36		30	36	22
	0		32	36

co cn co

Claims (1)

1. Patentansprüche:

   1. Zubereitung zur Prüfung oder Behandlung von Mikrobieft-Bystemen oder -Infektionen dadurch gekennzeichnet , daß sie eine wirksame potenzierende Menge eines Potentiätors, wie vorausgehend definiert, der selb die Enzym-Hydröxyinethyldihydropteriäin-Pyrophösphdkiriäse inhibiert und eine ausreichend geringe ^rJoxizität hat, zusammen mit einer wirksamen Heft ge eiries Kompetito'rs öder Inhibitors oder beidenf wie vorausgehend definiert, eiithält.

   2. Zubereitung geröaß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet , daß der Pdtentiätor öine 2-Amino-4-hydroxy-?.8-dihydropt eridinverbindung ist.

   3. Zubereitung gemäß Anspruch 2 dadurch; gekennzeichnet , daß die Pteridinverbindung in 6-Stellung durch ein Kohlenstoffatom substituiert und in 7-ötellung disübötituiert ist.

   4. Zubereitung gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche dadurch g e k e η η ζ e i c h il e t , daß sie eine Verbindung der Formel (I) odor ihre toutomeren Formen oder ihre phurmezuutiseh verträglichen ris'lzö enthält

   -67»

   3Ö98Ö8/1333

   (D,

   worin R eine Alkylgruppe ist, die gegebenenfalls mit einer Hydroxygruppe,mit einem oder mehreren Halogenatomen öder mit einer gegebenenfalls substituierten ~Phettöx£gruj?pe stib-

   Ί 2 '■■;■■■

   stituiert ist und die Reste R und R gleich ddär verschie-

   A 2

   den sind und jeder eine Alkylgruppe ist Öder R und R zusammen ein Spirocyclöalkylringsystem mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen außerhalb des Pteridinrings bilden;

   5. Zubereitung gemäß Anspruch 4 d a d U r c U gekennzeichnet , daß sie eine Verbindung der Formel (I) enthält, worin R eine Alkyl- oder Hydroxyalkylgruppe ist.

   6. Zubereitung gemäß Anspruch 5 dadurch gekennzeichnet , daß die Alkylgruppe eine Methyl» gruppe ist.

   7. Zubereitung gemäß Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet , daß sie eine Verbitidüng der Formel (I) enthält, worin K eine Phenoxyalkylgruppe ist.

   -68-

   309800/1333

   2230536

   β. Zubereitung gemäß Anspruch 7 dadurch, gekennzeichnet , daß die Phenoxyalkylgruppe eine Phenoxymethylgruppe ist.

   9. Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 4, 7 und 8 d a durch gekennzeichnet, daß sie eine Verbindung der Formel (1) enthält, worin die Phenoxygruppe mit einer oder mehreren Alkoxy-, Amino-, Alkyl- o.der Hydroxygruppe bzw. -gruppen oder einem oder mehreren Halogenatomen substituiert ist.

   10. Zubereitung gemäß Anspruch 9 dadurch gekennzeichnet , daß die Phenoxygruppe mono- oder dihalogensubstituiert ist.

   11. Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 9 und 10 d a durch gekennzeichnet, daß die Phenoxygruppe in para—stellung substituiert ist.

   12. Zubereitung gemäß. Anspruch 4- dadurch gekennzeichnet , daß sie eine Verbindung der Formel (I) enthält, worin si eine Alkylgruppe ist, die mit einein oder mehreren Halogenatomen substituiert ist.

   13". Zubereitung gemäß Anspruch 12 dadurch g e L ο η η ν, e i c h η e t , daß dieAlkylgruppe mono- oder dih.-Jlogeunub/jbituiert ist„

   309808/1333

   14. Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 15 dadurch gekennzeichnet, daß die Halogenatome liromatome sind.

   15. Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 14 dadurch gekennzeichnet, daß die Keste K

   2
   und K beide Hethylgruppen sind.

   16. Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 14 dadurch gekennzeichnet, daß die Keste K und K beide Äthylgruppen sind.

   17. Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 14 dadurch gekennzeichnet, daß die Keste K

   und K zusammen einen bpirocycloalkylring mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen außerhalb des Pteridinrings bilden.

   18. Zubereitung gemäß Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet , daß die Verbindung der Formel (1) 2-Amirlo-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7.7-dimethyl-7.ö-dihydropteridin ist.

   19· Zubereitung gemäß Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet , daß die Verbindung der Formel (1) 2-Amino-4-h,ydrox_<y-6-meth_lyl-7.7-dimethyl-7.b-diliydropteridin ist.

   309808/1333

   20. Zubereitung gemäß Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet , daß die Verbindung der Formel (1) 2~Amino-4-hydroxy-6-brommethyl-7.7-dimethyl-7·8-dihydropteridin ist.

   21. Zubereitung gemäß Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der 'Formel (I) 2-Amino-4-hydroxy-6-dibrommethyl-7.7-aifflethyl~7.8-dihydropteridin ist.

   22. Zubereitung gemäß Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet , daß die Verbindung der Formel (I) 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl~7.7-diäthyl~7.8-dihydropteridin ist.

   23. Zubereitung gemäß Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel (I)

   dihydropteridin ist.

   24. Zubereitung gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß sie etwa 1 bis JO Teile von jeweils Potentiator und Kompetitor, vor zugsv/eise 5 bis I5 I'eile oder äquivalente Mengen ihrer fciolae enthält .-

   25. Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23 d a -

   -70-

   309808/1333

   -Ttr-

   durch gekennzeichnet, daß sie etwa 1 bis 30 Teile Potentiator, vorzugsweise 5 bis 15 Teile, und 1 Teil Inhibitor oder äquivalente Mengen ihrer Salz

   enthält. j

   26. Zubereitung gernäß einem der vorausgehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß sie eine wirksame potenzierende Menge des Potentiators zusammen mit einer wirksamen Menge sowohl des Kompetitors als auch des Inhibitors enthält.

   27. Zubereitung gernäß Anspruch 26 dadurch gekennzeichnet , daß sie etwa 1 bis 30 Teile sowohl von Potentiator wie !Competitor, vorzugsweise 5 bis 15 Teile, und 1 Teil Inhibitor oder äquivalente Mengen ihrer - ^alze enthält.

   28. Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 24 bis 27 dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form von Dosierungseinheiten vorliegt, die bis zu 750 mg, vorzugsweise etwa 200 mg, Potentiator enthalten.

   29. Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 24 und 26 bis dadurch gekennzeichnet, daß sie in "Form von Uoüierungseinheiten vorliegt, die bis zu 75O mg, vorzugsweise etwa 200 mg, Kompetitor enthält.

   -71-

   309808/1333

   - 71 -

   30. Zubereitung gemäß einem der Ansprüche .25 bis 29 iti Form von Dosierungseinheit dadurch gekennzeichnet , daß sie bis zu 25 mg Inhibitor enthält.

   31. Pharmazeutische Formulierung, gekennzeichnet durch den Gehalt einer Zubereitung gemäß irgendeinem der vorausgehenden Ansprüche zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger,

   32. Pharmazeutische Formulierung gemäß Anspruch 31 in flüssiger Form dadurch gekennzeichnet, rs:!;": ' i zur Inhibierung der Bildung von Dihydrofolsäure durch Mikroorganismen unter in vitro- oder in vivo-Bedingungen» ..'"·..""

   33· Pharmazeutische Formulierung gemäß einem der Ansprüche 31 und 32 zur äußeren Verwendung dadurch gekennzeichnet , daß sie 1 his 30 mg/ml sowohl Potentiator wie Korapetitor in einem pharmazeutisch verträglichen Lösungsmittel enthält.

   34. Pharmazeutische Formulierung gemäß einem der Ansprüche 31 und 32 zur äußeren Verwendung dadurch gekennzeichnet , daß sie 1 bis 30 mg/ml Potentiator und 0,03 bis 1 mg/ml Inhibitor in einem pharmazeutisch verträglichen Lösungsmittel enthält.

   -72-

   309808/1333

   35. Pharmazeutische jiOrrriulieruug gemäß einem der Ansprüche 31 bis 34 zur äußeren Verwendung d a O. u r c h g e kenn z· eich net, daß sie 1 bis $ü mg/ml sowohl Potentiator wie Korapetitor und 0,03 bis 1 rag/ml Inhibitor in einem pharmazeutisch verträglichen Lösungsmittel enthält .

   36. In vitro-Untersuchungsscheibe mit dem Gehalt einer pharmazeutischen Formulierung gemäß einem der Ansprüche 31 oder 32 dadurch gekennzeichnet, daß si^etwa 10 Dis 100/Ug/ml Potentiator, 5 bis 50/Ug/ml competitor und 0,5 bis 5/Ug/ml Inhibitor in Kombination mit einem Träger enthält.

   37. Untersuchungsscheibe gemäß Anspruch 36 d a d u r c h gekennzeichnet , dsß der Träger ein I-iedium ist, das ein Gemisch einer wäßrigen Infusion und von Papaindigest von Pferdemuskelfleisch enthält.

   38. Phax^mszeutische Formulierung gemäß einem der Ansprüche 31 bis 33 dadurch gekennzeichnet, daß sie vorliegt in Jform einer Packung von getrennt aogepacktem Potentiutor, lnhioitor oder Kompetitor mit Anweisungen für deren kombinierte Verwendung für medizinische oder veterin.^;irmed j r-inische Zwecke.

   39· Pharmazeutische Poriiiulierun/i zur Prüfung oder xiehaud-

   -7.7-

   309808/1333

   La·.:: νοα uocciuieasysbemeu oder inieicbionen d a ü u r c ti . £ i\. e η η ζ e i c h neb , daß axe eine wirksüme pobeti-.;iuL'jü la heilte- üines i/oteutiab'ors, wie vorausgerieuU-de.fiti":-.:fb, ^u^ammen mit einer wirKsarnen l-.onge eines Kompetibors r J.nnLbib'ors oder von beiden, wie vorausgehend dei'inierb,

   ■ jrtiuiiierun^· tcotuäii iiiirf^ruch ^9 d a ί r c ti [j; ο κ e ti η ζ e i c h u e U , daii der ivonipebif L)U ι i.icLiinoxaiin und. el ex· luuiuitor Jjiaveridin ioC.

   "t'\. i'ha LMiiazoutisGUH i-Ortnuliex^uug getnaii iLti'tjpruuii ^9 und 40 d a ei α r ο η g e k e η η κ ο i ο η η e b , dab uer ιό-

   7.b—difiydropüeriditi Lat.

   4<iJ. fhariiiaz-eubiriclie fOftiiuiierung gemäß eirieui der Ansprüche 59 uud 41 dadurch gekennzeichnet, dab cie etwa υ,ϋθί> uis 0,01/0 üew./ü-ev/. i-obenbiatox" uud ebwu υ,ϋυ'Ι uis 0,0u6^ G-ew./dew. buli'achinoxaiin eubtiüiü.

   4;>. i'fiax'iiiazeLiüische i'Orwuiierutii-; gemäß einem der Ansprüche 29 ^un( ·''· d a . t u r ν λ . ^ e i<: e η η ζ e i c h η e t , daio ti ie uLwa 0,0^ bis u,01/i üew./Gew. iOteutiatox· und etv;a 0,Li¹I b.L·. 0,uub/a uew./Gew. biaveridiu errbh.uii;.

   44. tlmr-Muj,tiatii^tiu x'Ox'iauiierung gemäß einem der

   BAD ORIGINAL ■ 309808/1333

   py uis 43 (i a J ur c ii .; e k ο η η ζ e i c ti η e t , din j üie etwa ϋ,ϋυϋ¹? ois 0,025>ο Gew. /Gew. i'otentiator, vorzugsweise O,vUi uiü 0,009/* Gev/./Gev/. , und etwa 0,001 bis U,u1>o Gew./Gew. von jeweils bulx'acninoxalin und Diaveridin, vorzugsweise ü,uü'IS bis U,C0b/ü Gew./Gew. enthalt·

   Ό. LtiannuzeuLiioctie jOrmui.iei-un^ t':ei.,'jLij eineui der Ansprüche '^Jy 4Ü mid 44 α a d u r c ti gekennzeichnet;, daü daa ivüiiz&iibt-:ibionüVüL'ir..iiüLiiü von ouli'achinoxalin zu von 1:1 ui. ; 4:1 üetrdp;t.

   -'Ib. νi.Tfahren zi:r iioi'Süoxlun,··: einer Zubereitung oder pharmözeubiucheii i'Onnu Liwrun;; ^;οιη^αί einem der vorauagehendeii Ansprüche dauurch gekennzeichnet, uaii man wirksame nuiijaii .ier ;--eei^neben. Komponenten rniücnt juu in kombinier bor 'Ovu> tiafoi

   4'/. Verfahren zur i.eannaLurif-· und Vermeidung von hikrobieniui'elb ionen !.durch ^; e k e α η ζ e i c h η e b , daß mau dem vjirt eine .'juoeroLüun;;. oder pnarmaaeubiöche For mulierung gemiiß einem der Atu.prüche 1 ois 44 verabfolgt.

   4o. vuX'T'liren ::eniaii mu^ vac'n 4'/ u a d u r c h g e Iv e an zeichnet;, du'u wan uis zu ebwa 60 mg/kg Jeweils i'obetibi: box· und i.ompebibor dem 'jxvt fcuglich in raeh rei'en Dosen

   309808/1333 BAD ORIGINAL

   4-9. Verfahren gemäß Anspruch 4-7 dadurch gekennzeichnet , daß man bis zu etwa 60 mg/kg Iotentiator und bis zu etwa 7>5 mg/kg. Inhibitor dem Wirt täglicn in mehreren Dosen verabfolgt.

   50. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 46 bis 4-8 dadurch gekennzeichnet, daß man bis zu etwa 60 mg/kg jeweils Potentiator und Kompetitor und bis zu etwa 7i5 rag/kg Inhibitor dem Wirt täglich in mehreren Dosen verabfolgt-

   51. Verfahren zur Inhibierung der Herstellung von Dihydrof ölsäure durch !Mikroorganismen dadurch gekennzeichnet, daß man die !Mikroorganismen mit einer Zubereitung oder pharmazeutischen Formulierung ge-

   jiiäß einem der Ansprüche 1 bis 44 in Kontakt bringt.

   309808/1333