DE2238536C2 - Zubereitungen zur Behandlung von Mikrobeninfektionen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Tetrahydrofolatkofaktoren sind in allen Zellen essentielle Metabolite für die Biosynthese von Purinen, Thymidylsäure. Serin und verschiedenen anderen biologisch wichtigen Verbindungen. Die meisten dieser Kofaktoren sind Addukte der Tetrahydrofolsäure. Höhere Tiere und Menschen finden diese in der Nahrung, die gewöhnlich vorgebildete Folate in Form von Vitaminen enthält.

In den Mikroorganismen werden die Kofaktoren aus einfacheren Grundstoffen gebildet. Im allgemeinen wird bei dem biosynthetischen Verfahren zuerst »Dihydropteridin« (Pt), d. h. Z-Amino^-hydroxy-o-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridin(HMPt)-pyrophosphatesler aus seinem Zwischenproduktprekursor HMPt in Gegenwart des Enzyms Hydroxymethyldihydropteridinpyrophosphokinase (HMPPS) gebildet. Pt wird dann mit p-Aminobenzoesäure (pAB) in Gegenwart der Enzym-Dihydropleroatsynthetase unter Bildung von Dihydropteroinsäure (DPtS) kondensiert. Dieses Zwischenprodukt wird weiter mit einem Granulat unter Bildung von Dihydrofolsäure (DFS oder »Folat«) kondensiert, die dann enzymatisch unter Bildung des essentiellen Tetrahydrofolats reduziert wird, beispielsweise in Bakterien oder anderen Mikroorganismen.

Es ist bekannt, daß die Bildung des »Folats« aus den Bausteinen, d. h. Pteridin, pAB und Glutamat und die weitere Umwandlung von diesem in das Tetrahydrofolat auf zwei verschiedenen Wegen inhibiert werden kann. Beispielsweise verdrängen die Sulfonamide pAB in dem oben angegebenen Reaktionsablauf. Wegen ihrer engen strukturellen Ähnlichkeit zu pAB treten die Sulfonamide oder ähnliche andere »Konkurrenten« oder »Kompetitoren« in die Biosynthese ein und verhindern die Bildung von DPtS und von DFS und wirken daher als Antimetabolilen für den Metabolit pAB.

Es ist weiterhin bekannt, daß Verbindungen, die »Inhibitoren« der Enzym-Dihydrofolsäure-Reduktase sind, die zu dem Tetrahydrofolat führende Bildungsstufe blockieren. Eine beträchtliche Anzahl von Pyrimidinderivaten zeigen auf der Basis dieser Blockierung wesentliche antimikrobiell Eigenschaften.

Es wurde ferner später festgestellt, daß solche Inhibitoren mit Sulfonamiden synergistisch zusammenwirken können, d. h. daß eine nachfolgende Doppelblockierung und eine starke wechselseitige Potenzierung der antibakteriellen Wirkungen der beiden Materialien auftreten kann. Der Bereich der durch solche Kombinationen ausgeübten antibakteriell Wirkung ist erheblich umfangreicher, als er aus der Wirksamkeit von jeweils einem der Arzneimittel erwartet werden könnte und Organismen, die nur schwach auf die einzelnen Mittel ansprechen, sind gegenüber den Kombinationen sehr empfindlich.

Es wurde weiterhin hypothetisch angenommen, daß Antimetabolite zu Pt die Biosynthese von DPtS (und DFS) inhibieren könnten (vgl. Hitchings und Burchall, Advances in Enzymology, 27,417-468 (1965)], jedoch M) entsprachen Verbindungen, soweit sie in dieser Hinsicht geprüft wurden, keinesfalls diesen Erwartungen und waren entweder unwirksam oder zu toxisch, oder mitunter auch beides (vgl. die Verbindungen, die in den G B-PS 9 81 506 und 9 87916 beschrieben sind). Es darf festgestellt werden, daß es zur Hemmung des Mikrobenwachstums bzw. für antimikrobielle Zwecke eine Voraussetzung für den wirksamen Antagonismus von Pt ist, daß die Verbindung nur als Inhibitor von HMPPS dienen sollte, ohne auch als Antimetabolit zu dem Dihydropteridin t>5 aufzutreten, das als ein Kofaktor für die Hydroxylierung von Phenylalanin und Tyrosin dient, die Vorstufen der Catecholamine, wie Norepinephrin, darstellen und als Regulatoren von cardiovaskulären Systemen wichtig sind. Eine solche antimetabolische Wirkung könnte zu einer prohibitiven Toxizität bei Vögeln oder Säugern führen, die normalerweise die mit den Mikroben infizierten Wirte sind.

Es wurde weiterhin nunmehr gefunden, daß Substanzen, die diesen Erfordernissen entsprechen, d. h. HMPPS kombiniert mit niedriger Toxizität gegenüber der Wirtsart inhibieren, wie dies beispielsweise bei Küken und Ratten nachzuweisen ist, nicht nur das Wachstum von Mikroorganismen in gewissem Ausmaß inhibieren, sondern auch unerwarteterweise eine starke synergistische Wirkung zeigen, wenn sie mit einem Kompetitor von pAB, d. h. Sulfonamiden und ähnlichen Verbindungen, oder mit selektiven Inhibitoren der Dihydrofolatreduk- s Use, oder mit einer Kombination dieser beiden Arten von antimikrobiellen, d. h. gegen Bakterien gerichteten Mitteln in Kombination verwendet werden.

Die Erfindung schafft daher eine Zubereitung zur Behandlung von Mikrobeninfektionen, wozu man eine wirksame potenzierende Menge eines Mikroben-dihydropteridin-anlagonisten, hier nachfolgend als »Potentiator« bezeichnet, der selbst HMPPS inhibiert und ausreichend niedrige Toxizität aufweist, zusammen mit einer wirksamen Menge eines Kompetitors oder Inhibitors, oder beiden, wie vorstehend definiert, verwendet.

Die Mikrobeninfektionen, gegen welche die Kombinationen dieser Erfindung wirksam sind, sind Protozoenoder Bakterieninfektionen, die durch solche Mikroorganismen verursacht werden, die wenigstens einen wesentlichen Teil ihres Bedarfs an dem Tetrahydrofolatkofaktor bilden. Insbesondere sind es solche infizierende Mikroorganismen, welche die hier beschriebenen pharmazeutischen Kombinationen ausreichend absorbieren is und bei denen weiterhin diese Kombinationen eine synergistische Wirkung dahingehend haben, daß sie die de novo-Synthese der erforderlichen Tetrahydrofolatkofaktoren beeinträchtigen bzw. unterbinden.

Es wurde festgestellt, daß man, wenn Potentiatoren mit einer normalerweise als wirksames antimikrobielles Mittel nicht ausreichenden Menge des Kompetitors und/oder des Inhibitors kombiniert werden, die Kombination als Ganzes ein wirksames antimikrobieiles Mittel darstellt. Dies ist besonders bemerkenswert, wenn die Potentiatormenge so gering ist, daß sie im wesentlichen keine mikrobielle Wirkung aufweist, jedoch in der Kombination eine erhebliche, in manchen Fällen sogar eine sehr beträchtliche Potenzierung bewirkt.

In den vorstehenden Ausführungen bedeutet die Bezeichnung »eine «irksame Menge«, die zusammen mit den Bezeichnungen »Dihydrofolsäure-Reduktase-Inhibitor« und »para-Aminobenzoesäure-Kompetitor« verwendet wird, entweder

(a) eine Menge des Inhibitors oder Kompetitors, die als solche in einem gewissen Grad als antimikrobielles Mittel wirksam ist, jedoch durch die Verwendung eines Potentiators potenziert wird, oder

(b) eine Menge des Inhibitors oder Kompetitors, die zwar als Mittel gegen Mikroben unwirksam ist, die aber in Kombination mit einem Potentiator eine Zubereitung bildet, die ein wirksames antimikrobielles Mittel darstellt.

Eine »wirksame potenzierende Minge« bedeutet eine Menge des Potentiators, welche die Wirksamkeit eines Inhibitors und/oder Kompetitors so erhöht, daß eine verbesserte oder ausreichende Wirksamkeit für die gesamte Kombination erzielt wird.

Es muß daraufhingewiesen werden, daß die Inhibierung der biosynthetischen Prozesse durch derartige Verfahren in allen drei Fällen als kompeliver Antagonismus bezeichnet und bei allen drei Arten von Mitteln von einer Potenzierung gesprochen werden kann. Die Begriffe »Inhibitor«, »Kompetitor« und »Potentiator« werden willkürlich verwendet und sollten nur als zweckmäßige Bezeichnung für die geeignete Art der Komponenten in Kombinationsprodukten dienen, wie sie in dieser Erfindung beschrieben und beansprucht werden.

Die gegen HMPPS gerichtete Inhibierungswirksamkeit eines ausgewählten Potentiators kann beispielsweise im Versuch durch Überwachen der Übertragung des endständigen Phosphat-ATP-y-P³²-Teils an Dihydropteridin nachgewiesen werden. Es wurde festgestellt, daß die Konzentration, die zur 50%igen Inhibierung der Bildung von Pt (IC_5n) erforderlich sind, in solchen Untersuchungen in guter Wechselbeziehung stehen und im Bereich der Fehlergrenzen liegen, die man durch andere in dieser Hinsicht relevanten Untersuchungen erhält, durch die man die Inhibierung von einem der beiden in Betracht kommenden Enzyme bei der Bildung von HMPt und Pt mißt. Eine solche Inhibierung kann beispielsweise leicht durch Bebrüten eines Extrakts von E. coli mit ρ AB-7-C¹⁴, ATP, Mg und Dihydropteridin durchgeführt werden. Die Bildung des Dihydropteroats-C¹⁴ kann durch Versuch quantitativ nach Abtrennen des nicht umgesetzten pAB-Substrats, beispielsweise durch Chromatographie, bestimmt werden. Es wurde festgestellt, daß Verbindungen, die in solchen Versuchen einen IC₅₀- so Wert von etwa 100 μΜ oder weniger, gewöhnlich unter 50 μΜ aufweisen. Verbindungen sind, die eine brauchbare potenzierende Wirkung besitzen, vorausgesetzt daß ihre Toxizität bei den jeweiligen Vertebraten annehmbar ist. Vorzugsweise sollte der Wert 25 μΜ oder geringer sein, also im Bereich zwischen 2 und 12 μΜ liegen, wobei im allgemeinen ein Wert unter 7 μΜ wünschenswert ist.

Wie oben erläutert, ist es bei dieser Erfindung wesentlich, daß der Potentiator keine seine Verwendung verhindernde Toxizität aufweist.

Es wurde nunmehr gefunden, daß eine Zubereitung zur Behandlung von Mikrobeninfektionen, die eine hohe Wirksamkeit besitzt, eine Verbindung der allgemeinen Formel I

H,N I R²

oder ihrer tautomeren Formen oder ihrer pharmazeutisch verträglichen Salze, worin R eine Alkylgruppe mit 1

bis 4 Kohlenstoffatomen ist, die mit einer Hydroxylgruppe, mit einem oder mehreren Halogenatomen oder mit einer gegebenenfalls substituierten Phenoxygruppe substituiert sein kann und die Reste R' und R² gleich oder verschieden sind und jeder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist, oder R¹ und R² zusammen ein Spirocycloalkylringsystem mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen außerhalb des Pteridinrings bilden und ein Sulfonamid enthält.

Die im Rest R gegebenenfalls, snthaltene Phenoxygruppe kann mit einem oder mehreren Alkoxy-, Amino-, Alkyl- oder Hydroxygruppen oder mit Halogenatomen, insbesondere in para-Stellung, substituiert sein. Die Halogenatome können Fluor, Chlor, Brom oder Jod sein und treten vorzugsweise als Mono- oder Disubstituent auf. Die Bromsubstitution ist besonders für <Jie Herstellung geeignet.

ίο Eine besondere Gruppe der Verbindungen der allgemeinen Formel I sind solche, in denen R eine Alkyl- oder HydMÄyalkylgruppe ist. In diesen Verbindungen haben die Substituenten R¹ und R² die oben angegebene Bedeutung, wobei es jedoch bevorzugt wird, daß sie entweder Methyl- oder Äthylgruppen sind. Beispielsweise wurde festgestellt, daß die Verbindungen 2-Amino-4-hydroxy-6-hydΓoxymethyl-7,7-dimethyl-7,8-dihydropteridin, nachfolgend als DMHP bezeichnet, und 2-Amino-4-hydrox}ί-6-hydroxymethyl-7,7-diäthyl-7,8-dihydropteridin hervorragende potenzierende Eigenschaften aufweisen. Diese Verbindungen und ihre Analogen wurden in den britischen Patentanmeldungen 3301/70 und 35 814/72 beschrieben. Verfahren zu ihrer Herstellung sind aus einem Artikel von Pfleiderer und Zondler in Chem. Ben, 99,3008 (1966), der britischen Patentanmeldung 36 289/70 und der BE-PS 7 70 577 bekannt.
Eine weitere Gruppe im Rahmen der allgemeinen Formel I bilden Verbindungen, worin R eine Phenoxyalkyl-

gruppe, insbesondere eine Phenoxymethylgruppe ist, die, wie oben erwähnt, substituiert sein kann. Die Reste R¹ und R² haben die oben angegebene Bedeutung, wobei jedoch die Dimethyl- und Diäthylverbindungen bevorzugt werden. Zu dieser Gruppe von Verbindungen gehört beispielsweise das stark potenzierende 2-Amino4-hydroxy-6-phenoxymethyl-7,7-dimethyl-7,8-dähydropteridin. Seine Herstellung und die Herstellung seiner Analogen ist in der britischen Patentanmeldung 35 816/72 beschrieben.

Eine dritte Gruppe im Rahmen der allgemeinen Formel I sind solche Verbindungen, worin R eine durch Halogen substituierte Alkylgruppe bedeutet und die Reste R¹ und R² die vorstehend definierte Bedeutung haben. Die Halogen enthaltende Gruppe ist vorzugsweise mono- oder dihalogeniert, am zweckmäßigsten mit Bromatomen. Besonders geeignete Verbindungen dieser Gruppe sind 2-Amino-4-hydroxy-6-brommethyl-7,7-d:methyI-7,8-dihydropteridin und das 6-Dibrommethylanalogc, die zusammen mit ihren Analogen in der britischen

Patentanmeldung 35 815/72 beschrieben werden.

Verbindungen der allgemeinen Formel 1 und insbesondere DMHP mögen zwar gegen viele Bakterien, wie u. a. Staphylococcus aureus. Streptococcus pyogenes, Streptococcus faecal is, Escherichia coli, Salmonella typhi, Proteus vulgaris, Pseudomonas aemgenosa, Pasteurella multocida als solche nicht sehr aktiv sein, üben jedoch eine erhebliche potenzierende Wirkung auf die Aktivität von Kompetitoren und/oder Inhibitoren aus. Es ist daher nunmehr möglich, durch Verwendung einer wirksamen potenzierenden Menge einer Verbindung der allgemeinen Formel I in Kombination mit dem Kompetitor und/oder dem Inhibitor die zur Inhibierung des Bakterienwachstums erforderliche Menge des Kompetitors oder Inhibitors drastisch zu senken.

Wie bereits oben erwähnt, betrifft diese Erfindung die Dreifach-Blockade der synthetischen Sequenz ir. Bezug auf Tetrahydrofolat bei Säugetieren. Diese Dreifach-Blockade ist von außerordentlicher Bedeutung für die

Bekämpfung schädlicher Mikroorganismen im Säugetierkörper. Benzylpyrimidine blockieren in Kombination

mit Sulfonamide« nur zwei aufeinanderfolgende Stufen der Tetrahydrofolat-Synthese. Das Blockieren einer weiteren Stufe in diesem Syntheseweg ist offensichtlich von großer theoretischer und praktischer Bedeutung.

Theoretisch läßt sich angeben, ob Kombinationen von Enzym-Inhibitoren antagonistische, additive oder

synergistische Wirkungen auf die Produktion eines Stoffwechselweges aufweisen [J. L. Webb, Enzyme and Metabolie Inhibitors, Vol. I, Seiten 319 bis 392, 487 bis 512, New York, Academic Press, 1963; R. L. Harvey, J. theor. Biol. 74,411 bis 437 (1978)]. für eine solche Vorhersage ist eine vertiefte Kenntnis der Konfiguration des einbezogenen Weges (linear, konvergierend, verzweigt, etc.) und die exakten Wirkungsorte der einbezogenen Inhibitoren innerhalb des Weges erforderlich. Aufgrund theoretischer Erwägungen kann nun vorhergesagt werden, daß Inhibitoren des Enzyms Hydroxymethyldihydropteridin-Pyrophosphokinase Synergismus mit Inhibitoren des Enzyms Dihydropteroat-Synthase (z. B. mit Sulfonamiden) und mit Inhibitoren des Enzyms Dihydrofolat-Reduktase (z. B. mit Trimethoprim, Diaveridin, etc.) zeigen werden. Zwar können andere Faktoren, wie beispielsweise unzureichende Penetration der Zcllcnoberfläche oder Stoffwechsel zu inaktiven Formen, etc., insofern eine Rolle spielen, als durch sie der synergistische Effekt von gewissen Verbindungen in ganzen Zellen getarnt wird, jedoch sollten in einer eng benachbarten Verbindungsreihe die meisten dieser Effekte nicht sehr stark variieren. Daher ist zu erwarten, daß eng benachbarte Analoga von 2-Amino-4-oxo-6-hydroxymethyl-7,7-dimethyl-7,8-dihydropteridin (DMHP) unter vergleichbaren Umständen ebenfalls Synergismus wie

DMHP zeigen, obwohl die Wirksamkeit schwanken wird. Die nachstehenden Tabellen A und B zeigen dies für

eine Auswahl von DMHP-Analoga.

Das gleiche Argument gilt auch für die synergistische Wirkung der beiden anderen Komponenten, nämlich

M) der Sulfonamide und der Pyrimidin-Typ-Antifolate. So lange die Glieder einer jeden Klasse Inhibitoren der Ziel-Enzyme (Dihydropteroat-Synthase bzw. Dihydrofolat-Reduktase) sind, sind sie aus theoretischen Gründen auch zu einem Synergismus mit den beschriebenen Pteridincn fähig.

Tabelle A Synergismus gegen E. tenella in vitro

Verbindung	Ri	R2	n-C.,ll7	Dosis	Bewertung·)	+ Sulfachinonoxalin·*)
R			CH,	(jig/ml)	Allein	+ Diaveridin
	C2H5	C2H5	CH,	100		3
CH2OH	n-C,H7	n-Cjll,	CHj	100	0	1
CH2OH		Spirocyclopcntyl	CHj	100	0	5
CH2OH	n-C,H7	CHj	100	3	3
CjH5	CH,	CH,	25	0	5
CHBr,	CHj	CH,	100	3	***)
CH2Cl	CHj	CH,	1,56	1	···)
C2H5	CHj	CH,	100	0	5
COOCH,	CH,	CH3	6,25	3	2
CH(CH,)j	CH,	CH,	25	1	3
CH2OCH(CHj)2	CH3		6,25	0	3
n-C,H7	CH3	25	1	2
CH2CH2COOCjH5	CHj	100	0	5
CHjCHjCHOHCHj	CHj	25	3	4
CH=CH CONH2	CH,	200	0	5
CH=CH COOC2H5	0

·) Bewertung von 0 (keine Aktivität) bis 5 (vollständige Wachstumshemmung).
**l Untersucht in Kombination mit 0,01 i^g/ml Sultachinoxalin + 0,03125 i-ig/m! Diaveridin, diese sind Konzentralionen mit

unter-inhibitorischcr Wirkung, d. h. sie haben eine Bewertung von 0.
·*·) Starker Synergismus bei 0,125 μg/ml.

Tabelle B Synergismus gegen Bakterien

Verbindung	Ri	R2	Potenzierung*)	E. coli
R				H2pteroat
				Biosynthese
	C2H5	C2H5	+++	I5O, μΜ
CH2OH	CH,	C2H5	+++	2,1
CH2OH	C2H5	C2H5	+ +	1,1
CHO	C2H5	C2H5	+	5.5
CH2O Cl	CH3	CH3	+	>110·*)
CH=CH CN	CH,	CH3	+	>2**)
CH=N	CH3	CH3	+	50,61
CH=N COOC2H5	CH3	CH,	+	50,52
CH2OCH3	CHj	CH,	+	210,340
CH2O	CHj	CH3	+	>10**)
CH2Br	CH,	CH3	+	22,50
CHBr2	CH3	CH3	+	14,25
CH=NOH	CH,	CHj	++	>257**)
NHOH			>100**)

*) Gibt d:e Fähigkeit der Erniedrigung des MIC-Wertes von Trimethoprim oder von Sulfamethoxazol gegen Staph. aureus

oder Pseudo, aeruginosa um mehr als das Zweifache an einer 0 bis +++-Skala an.

**) Das Zeichen »>< gibt an, daB keine Inhibierung bei der höchsten Konzentration, die zu untersuchen möglich war, stattfand.

Zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I setzt man beispielsweise eine Verbindung der Formel Il

R¹

H₂N- C — C — R (II)

R^: X

oder ein Salz derselben, worin die Reste R, R¹ und R² die oben angegebene Bedeutung hüben und X ein ketonisches Sauerstoffatom oder eine hierfür geeignete Schutzgruppe, wie eine Oxim- oder Thiosemicarbazongruppe ist, mit 2-Amino-4-chlor-6-hydroxy-5-nitropyrimidin um, entfernt anschließend die Schutzgruppe, sofern vorhanden, und unterwirft das erhaltene Produkt der reduktiven Cyclisierung. Falls erforderlich, können die Substituentengruppcn nach dem Fachmann bekannten Verfahren in andere Gruppen umgewandelt werden,

is beispielsweise durch Bromierung einer 6-Alkylgruppe unter Bildung des o-Bromalkyl-odero-Dibromalkylderivats.

Andere Pteridinderivate der allgemeinen Formel I können nach in der Literatur angegebenen analogen Verfahren zur Herstellung von Pteridinen hergestellt werden.
Obgleich dem Fachmann viele Verbindungen bekannt sind, die Kompetitoren von para-Aminobenzoesäure und antimikrobiell wirkende Mittel sind, seien hier lediglich als Beispiel die Schwefelverbindungen erwähnt, die als antimikrobielle Mittel im Merck-lndex (8. Auflage, 1968) auf Seite 992 oben bis Seite 1007 angegeben sind.

Von den bekannten Verbindungen, die Kompetitoren sind, werden die folgenden Sulfonamidverbindungen (oder ihre pharmazeutisch verträglichen Salze) für die Zwecke dieser Erfindung bevorzugt: Sulfanilamid, Sulfadiazin, Sulfamethisazol, Sulfapyridin, Sulfathiazol, Sulfamerazin, Sulfamethazin, Sulfisoxazol, Sulformethoxin, Sulfasomidin, Sulfadimidin, Sulfachlorpyridazin, Sulfafurazol, 2-(p-Aminobenzol)-sulfonamid-3-methoxypyrazin (Kelfizina), o-Amino-p-loluolsulfonamid, 5-Sulfanilamido-2,4-dimethylpyrimidin, 4-(N'-Acetylsulfani!amido)-5,6-dimethoxypyrimidin, 3-Sulfanilamido-4,5-dimethylisoxazol, 4-Sulfanilamido-5-methoxy-6-decyloxypyrimidin, Sulfamonomethoxin, 4-p-(8-Hydroxychinilinyl-4-azo)-phenylsulfanilamido-5,6-dimethoxypyrimidin, Sulfadimethoxin, Sulfamethoxazol und Sulfachinoxalin.

In ähnlicher Weise werden, obgleich viele Verbindungen bekannt sind, welche die Dihydrofolsäurereduktase inhibieren und als antimikrobielle MIttel wirken, die in den folgenden Patentschriften offenbarten Verbindungen als Beispiele für Verbindungen angegeben, die in dieser Erfindung verwendet werden können: US-PS 25 76 939, 25 79 259, 26 24 732, 26 58 897, 26 97 710, 27 49 344, 27 49 345. 27 67 183, 29 09 522. 29 26 166.

29 37 284, 29 45 859, 30 21 332 und 33 22 765.

Die nachfolgenden Inhibitoren (oder ihre pharmazeutisch verträglichen Salze) werden jedoch für die Zwecke dieser Erfindung besonders bevorzugt:

2,4-Diamino-6-äthyl-5-p-chlorphenylpyrimidin (Pyrimethamin), 2,4-Diamino-5-(3\4\5'-trimethoxybenzyl)-pyrimidin (Trimethoprim).

2,4-Diamino-5-(3',4'-dimethoxybenzyl)-pyrimidin (Diaveridin), 2.4-Diamino-5-(2'-isopropyl-4'-chlorphcnoxy)-pyrimidin,

2,4-Diamino-5-methyl-6-sek.-butylpyrido[2.3-d]pyrimidin,

2,4-Diamino-5-methyl-6-benzylpyrido[2.3-d]pyrimidin,
2.4-Diamino-6-benzylpyrido[2.3-d]pyrimidin,

2.4-Diamino-5,6-trimethylenchinazolin,

2,4-Diamino-5,6-tetramethylenchinazolin.

2,4-Diamino-5-(2'.4',5'-trimethoxybenzyl)-pyrimidin,

2,4-Diamino-5-(2'-äthyl-4\5'-dimethoxybenzyl)-pyrimidin und so 2,4-Diamino-5-(2'-rnethyl-4',5'-dimethoxybenzyl)-pyrimidin.

Zu den besonders bevorzugten Kombinationen gehören solche, bei denen DMHP mit Sulfadiazin. Sulfamethoxazol, Sulfadoxin oder Sulfachinoxalin als Kompetitoren, oder mit Trimethoprim, Diaveridin oder Pyrimethamin als Inhibitoren kombiniert wird. Im Hinblick auf mögliche .synergistische Vorteile bei kombinierter Verwendung bestimmter Kompetitoren und Inhibitoren gegen besondere Erkrankungen, und auf die potenzierende Wirkung von Verbindungen der allgemeinen Formel I auf diese beiden Arten von antibakteriellen Verbindungen wird es vorgezogen, Dreierkombinationen zu formulieren, die beispielsweise DMHP mit einem der oben erwähnten bevorzugten Kompetitoren und einem der erwähnten Inhibitoren enthalten. Beispielsweise wurde festgestellt, daß Sulfadiazin/Trimethoprim/DMHP oder Sulfamethoxazol/Trimethoprim/pMHP oder Sulfad-

oxin/Trimethoprim/DMHP oder Sulfachinoxalin/Diaveridin/DMHP im Vergleich zur alleinigen oder paarweisen Verwendung der Komponenten eine verbesserte Wirkung aufweisen.

Die Verbindungen der Formel I zusammen mit dem Kompelitor und/oder Inhibitor können in Verbindung mit einem Träger verabreicht werden, der für pharmazeutische Formulierungen zur parenteralen, örtlichen, rektalen oder oralen Verabreichung geeignet ist. Die Formulierungen zur oralen oder rektalen Verabreichung werden vorteilhafterweise in getrennten Einheiten, wie Tabletten, Kapseln, Cachetten, Ampullen oder Suppositorien dargeboten, wobei jede dieser Einheiten eine vorherbestimmte Menge von jeder der Verbindungen enthält, wobei sie jedoch ebenso als Pulver, Granulate, als Lösung oder Suspension in einer wässerigen oder nicht wässerigen Flüssigkeit oder als Salbe oder Paste zur örtlichen Verabfolgung dargeboten werden können. Zur parente-

raten Verwendung müssen die Formulierungen, die einen wässerigen oder nicht wässerigen flüssigen Träger enthalten, steril sein und in einem verschlossenen Behälter dargeboten werden.

Die Formulierungen können nach irgendeinem der bekannten Verfahren hergestellt werden und sie können einen oder mehrere der nachfolgenden zusätzlichen Bestandteile enthalten: Verdünnungsmittel, gelöste Stoffe, um die Lösung mit dem Blut isotonisch zu machen. Puffer, Geschmackstoffe, Binde-, Dispergier-, Eindick-, Gleit- und Beschichtungsmaterialien, oberflächenaktive und Konservierungsmittel, Bakteriostatika, Antioxidationsmittel, Suppositoricn- und Salbengrundmatcrialien und irgendwelche weitere geeignete Exzipienten.

Jede der vorstehend aufgeführten Verbindungen kann in Form ihrer pharmazeutisch verträglichen Salze einer Mineralsäure oder organischen Säure, beispielsweise von Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Citronensäure, Milchsäure, Maleinsäure oder Salicylsäure, oder, besonders für den Sulfonamidkompetitor, einer Base wie Natrium- oder Kaliumhydroxid, dargeboten werden.

Die Verhältnisse, in denen die therapeutisch wirksamen Verbindungen in den Zubereitungen der vorliegenden Erfindung enthalten sind, können innerhalb weiter Grenzen variiert werden. Beispielsweise ist es im Falle von in vivo-Verwendungen häufig wünschenswert, einen bestimmten Spiegel der Komponenten im Blut oder in den Gewebeflüssigkeiten, vorzugsweise über längere Zeit, aufrechtzuerhalten. Je nach den verschiedenen Absorptions-, Abgabe- oder Zersetzungsgeschwindigkeiten der Komponenten, können die Anfangsmengen und Anteile der Bestandteile der Formulierung gegenüber solchen verschieden sein, die in vivo in Geweben vorliegen. Die Formulierungen oder Dosierungen, die Tür die allgemeine Behandlung einer besonderen Krankheit bei Menschen oder Tieren empfohlen werden, müssen nach den jeweiligen Erfordernissen des Trägers der Krankheit, den bekannten Aktivitäten der !Competitor- oder Inhibitorkomponente gegen den verursachenden Organismus, der Halbwertszeit und derToxizilät der Komponenten in vivo und anderen praktischen Gesichtspunkten eingestellt werden.

Beispielsweise kann die erfindungsgemäße Zubereitung von etwa 1 bis 30 Teile, vorzugsweise 5 bis 15 Teile Potentiator, zum Beispiel eine Verbindung der allgemeinen Formel I oder eine äquivalente Menge eines Salzes derselben und 1 bis 30 Teile, vorzugsweise 5 bis IS Teile, eines Kompetitors oder eine äquivalente Menge eines Salzes desselben und/oder 1 Teil eines Inhibitors oder eine äquivalente Menge eines Salzes desselben, enthalten.

Die Dosierung wird je nach dem infizierenden Organismus variieren. Jedoch können unter gewöhnlichen Umständen täglich bis zu etwa 60 mg/kg von jedem der Potentiatoren und Kompetitoren und bis zu etwa 7,5 mg/ kg Inhibitor in Kombination in mehreren Dosen verabreicht werden.

Die Zubereitung kunn Patienten in Form von Dosierungseinheiten verabfolgt werden, die bis zu 750 mg an Potentiatorverbindung der allgemeinen Formel I und bis zu 750 mg Kompetitor und/oder bis zu 25 mg Inhibitor enthalten. Vorzugsweise sollten für Erwachsene Dosierungen verwendet werden, bei denen der Potentiator etwa 200 mg, der Kompetitor etwa 200 mg und/oder der Inhibitor etwa 25 mg beträgt.

Die pharmazeutische Formulierung, welche die Verbindung der allgemeinen Formel I mit dem Kompetitor und/oder dem Inhibitor kombiniert enthält, ist auch in Lösung zum Spülen von Wunden, beispielsweise nach Operationen, anwendbar, um das Wachstum von Bakterien zu verhindern. Beispielsweise kann eine antibakterielle Lösung mit der nachfolgenden bevorzugten Konzentration von Komponenten, nämlich 1 bis 30 mg/ml Verbindung der Formel 1,1 bis 30 mg/ml Kompetitor und/oder 0,03 bis 1 mg/ml Inhibitor in einem pharmazeutisch verträglichen Lösungsmittel, das zur äußeren Anwendung geeignet ist, verwendet werden.

Die potenzierende Wirkung der Verbindungen der allgemeinen Formel 1 kann in vitro relativ leicht für praktische und Forschungszwecke demonstriert werden. Zu solchen Möglichkeiten gehört die Diagnose und Identifizierung der Bakteriennora der Patienten und das danach auszuwählende klinische Behandlungsschema.

Die Zubereitungen dieser Erfindung sind auch zur Behandlung von Infektionen brauchbar, die durch Mikroorganismen, zum Beispiel Staphylococcus aureus, Pseudomonas aerugenosa und Pasteurella multocida, verursacht werden.

Neben der antibakteriellen Wirksamkeit der oben aufgeführten Kompetitoren und Inhibitoren bei Menschen und in vitro können diese gegen Infektionen durch Mikroorganismen bei Haustieren, einschließlich Geflügel, beispielsweise gegen Pasteurella multocida, aber besonders gegenüber der Protozoenerkrankung durch Coccidiose verwendet werden. Coccidiose ist eine Erkrankung, die bei Haustieren in der ganzen Welt, besonders bei allen Formen von Geflügel, auftritt und durch Parasiten der Gattung Eimeria und Isopora der taxonomen Gruppe Coccidiu hervorgerufen wird. Es sind zwei übliche Arten dieser Infektion bekannt: die akute oder caecale Form, die durch das Coccidium Eimeria tcnella verursacht wird und durch eine schwere Haemorrhagie an oder um den 5. Tag der Infektion gekennzeichnet ist, und die chronische oder intestinale Form, die durch verschiedene Arten der Gattung Eimeria, einschließlich E. accervulina, E. necatrix, E. maxima und E. brunetti hervorgerufen wird.

Έί ist beispielsweise bekannt, daß bestimmte Sulfonamide, wie Sulfamethazin, Sulfadiazin, Sulfadimethoxin und besonders Sulfachinoxalin gegen Coccidiose bei Geflügel wirksam sind, obgleich die erforderlichen therapeutischen Dosen toxische Nebenwirkungen bewirken können. Es ist weiterhin bekannt, daß bestimmte 2,4-Diamino-5-benzyl- oder -5-phenyl-pyrimidine, insbesondere die in 5-Stellung substituierten (3'-Niedrigalkoxybenzyl)-pyrimidine und besonders 2,4-Diamino-5-(3',4'-dimethoxybenzyl)-pyrimidin, nachfolgend als »Diaveridin« bezeichnet, gegen diese Erkrankung wirksam sind. Obgleich die Herstellung dieser Pyrimidininhibitoren des bakteriellen Stoffwechsels im allgemeinen kostspieliger ist als die der Sulfonamide und sie bezüglich auf das Gewicht weniger aktiv sind, wirken sie in Kombination mit den Sulfonamiden synergistisch, so daß schon geringere Mengen des Gemisches gegen die Erkrankungen wirksam sind, wobei die wirksame Dosis von Sulfonamid um einen Faktor bis zu 10 reduziert werden kann.

Die Potentiatoren der vorliegenden Erfindung der allgemeinen Formel I können mit Kompetitoren und Inhibitoren, die gegen Coccidiose wirksam sind, mit Vorteil kombiniert werden, wodurch eine wirksame Dreier-

kombination erhalten wird.

Es wurde gefunden, daß die Kombination von Sulfachinoxalin mit Diaveridin und DMHP gegen Geflügel-Coccidiose, insbesondere bei Küken, besonders wirksam ist. Eine solche Dreierformulierung ist in niedrigeren Konzentrationen als die Sulfonamid- oder Pyrimidinkomponcnten allein wirksam, ermöglicht eine bessere Kontrolle der Infektion und eine Aktivitätserhöhung gegenüber den bisher bekannten Zubereitungen um das Dreibis Vierfache. Diese Formulierung hat weiterhin den Vorteil einer insgesamt zufriedenstellenden Wirksamkeit gegen alle relevanten Eimeria-Spezies, die diese Erkrankung bei Geflügel verursachen.

Die Verbindungen der Formulierung gegen Coccidiosc können vorzugsweise allein oder kombiniert als Additiv zur Einmischung mit dem Geflügelfutter oder der Tränke dargeboten werden. Dieses Additiv kann ein konzentriertes Futter-Vorgemisch oder ein Tränkadditiv sein, das die gewünschten Verbindungen in verdünnter Form enthält, jedoch in konzentrierterer Form vorliegt, als sie dem Geflügel verabfolgt werden soll. Dieses Vorgemisch wird dann mit üblichen Futterbestandteilen und üblichen Futterzusätzen zum fertigen Futter vermischt.
Wenn die Verbindungen der allgemeinen Formel I als Tränkadditive dargeboten werden, verwendet man sie normalerweise in Form ihrer Säureadditionssalze. Diese können in feinverteilter fester Form, gegebenenfalls mit anderen löslichen Additiven, oder als Konzentrat, das die Verbindungen in Lösung in geeigneten Lösungsmitteln enthält, dargeboten werden. Dieses Pulver oder Konzentrat kann dann dem Trinkwasser zugegeben werden.
Konzentrationen von etwa 30 bis 100 ppm (d. h. 0,003 bis 0,01%) Potentiator im Geflügelfutter zusammen mit 10 bis 60 Teilen Diaveridin oder Sulfachinoxalin liefern bereits eine verbesserte Wirkung, wobei jedoch die besten Ergebnisse mit Dreierkombinationen dieser Komponenten erzielt werden. Obgleich ein weiter Bereich von Konzentrationen der Komponenten in solchen Dreierkombinationen geeignet sein kann, sind relative Konzentrationen von etwa 5 bis 250 ppm Potentiator, vorzugsweise 10 bis 90 ppm und etwa 10 bis 100 ppm von jeweils Diaveridin und Sulfachinoxalin, vorzugsweise 15 bis 60 ppm, besonders wirksam. Während bei niedrigen Gesamtarzneimittelkonzentrationen ein 1 : I- oder 2 : 1-Konzentrationsverhältnis von Sulfachinoxalin zu Diaveridin besonders bevorzugt wird, kann dieses Verhältnis auf ein 4 : 1 -Verhältnis bei höheren Konzentrationen des Gesamtarzneimittels erhöht werden.

Ersetzt man DMHP durch sein 6-Methylanaloges, erhält man eine zwar bemerkenswerte, aber weniger ausgeprägte potenzierende Wirkung gegen Coccidiose.

.10 Gemäß dieser Erfindung werden daher insbesondere folgende Formulierungen vorgesehen:

(a) Eine Zubereitung, worin der Potentiator eine Pteridinverbindung ist, wie 2-Amino-4-hydroxy-7,8-dihydropteridin, das in 6-Stellung durch eine Methylgruppe substituiert und in 7-Stellung bisubstituiert ist. Insbesondere enthält die Zubereitung eine Verbindung der Formel 1, wie vorstehend definiert, insbesondere eine solche mit zwei Methyl- oder Äthylgruppen in 7-Stellung;

(b) eine Zubereitung, wie unter (a) angegeben, welche die Verbindung der Formel I enthält, worin R eine 6-Alkyl- oder 6-Hydroxyalkylgruppe ist. Die Alkylgruppe ist vorzugsweise eine Methylgruppe;

(c) eine Zubereitung wie unter (a) angegeben, die eine Verbindung der Formel I enthält, worin R eine Phenoxyalkylgruppe, insbesondere eine Phenoxymethylgruppe ist;

(d) eine Zubereitung wie unter (a) angegeben, die eine Verbindung der Formel I enthält, worin R eine durch Halogen substituierte Alkylgruppe ist. Besonders bevorzugt werden mono- oder disubstituierte Verbindungen, insbesondere mit Brom als Substituenten;

(e) eine Zubereitung, wie vorstehend definiert, die eine wirksame potenzierende Menge eines Potentiators in Kombination mit einer wirksamen Menge sowohl eines Kompetitors als auch eines Inhibitors enthält; (0 eine pharmazeutische Formulierung, die irgendeine der oben definierten Zubereitungen zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält;

(g) eine pharmazeutische Formulierung wie unter (0 angegeben in flüssiger Form zur Inhibierung der Bildung von Dihydrofolsäure durch Mikroorganismen unter in vitro- oder in vivo-Bcdingungen.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Beispiel I

Potentiell wirkende Pteridinantagonisten können dadurch geprüft werden, daß man ihre inhibierende Wirkung auf die Enzyme untersucht, die Tür die Biosynthese von Dihydropteroinsäure (DPtS), nämlich Hydroxymethyldihydropteridinpyrophosphokinase (HMPPS) und Dihydropteroatsynthetase, nachfolgend als »Synthetase« bezeichnet, verantwortlich sind.

1) HMPPS Mg²⁺ _X

2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridin (HMPt) + ATP ^ 2-Amino-4-hydroxy-6-

pyrophosphomethyl-7,8-dihydropteridin (Pt) + AMP.

2) Synthetase Mg²⁺^

Pt + p-Aminobenzoesäure (pAB) Dihydropteroinsäure (DPtS) + Pyrophosphat.

(a) Es wurde eine Untersuchung für HMPPS durchgeführt, bei der die Übertragung des endständigen Phosphatteils von ATP-y-P³² zu Pt überwacht und mit dem Inhibierungsausmaß von HMPPS durch die zu untersuchende Verbindung in Beziehung gestellt werden konnte.
Die untersuchte Verbindung wurde in verschiedene, in Reagenzgläsern befindliche Formulierungen ein-

gebracht, die Stofrwechselprodukte und Enzyme enthielten, wie dies in Tabelle I angegeben ist. Die Komponenten der Mischungen waren folgende:

I. 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyl-7,8-dihydropteridin (HMPt) in einer Konzentration von 800 μΜ,

d. h. 800 Mikromol.

II. Eine HMMPS-Quelle, erhalten aus einem Extrakt von E. coü und von der Synthetase über Sephadex G-IOO nach dem Verfahren von Richey und Brown, J. Biol. Chem. 244,1582-1592 (1969) abgetrennt.

III. 3 mM ATP-y-P". IV. 0,10 M ATP neutralisiert (nicht markiert). V. 0,02 M MgCl₂ · 6 H₂O.

VI. 0,1 M MgCl₂ · 6 H₂O.

VII. Quelle von HMPPS und Synthetase. VIII. Die Versuchsverbindung in einer Konzentration von 0,93 x 10 ³ M.

IX. 0,4 mM pAB-C¹⁴.

Wie aus Tabelle I zu ersehen ist, enthalten alle Reagenzgläser Nr. 1 bis Nr. 9 eine HMPPS-Quclle, indiziertes ATP und 0,02 M MgCl₂ ■ 6 H₂O, die Reagenzgläser Nr. 2 bis Nr. 9 zusätzlich HMPt und die ReagenzgläserNr. 4 bis Nr. 9 die zu untersuchende Verbindung. Die Kontrollreagenzgläser Nr. 10 bis Nr. 12 enthalten sowohl eine HMPPS-Quelle als auch Synthetase, nicht markiertes ATP, 0,1 M MgCI₂ · 6 H₂O und markiertes pAB.

Die Reagenzgläser Nr. 1 bis Nr. 9, welche die in der Tabelle I angegebene Menge an Komponenten enthalten, wurden mit destilliertem Wasser auf 200 μΐ aufgefüllt, 60 Minuten bei 37°C inkubiert und dann auf Eis abgeschreckt. Zu der Lösung wurde Dextrose (20 μΐ mit einem Gehalt von 72,1 mg/ml) und Hexokinase (5 μΐ mit einem Gehalt von 2000 Einheiten/ml) zugegeben und dann 15 Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschließend wurde Aktivkohle (10 mg) zu jedem Reagenzglas zugesck<t, der Inhalt periodisch alle 10 Minuten durchgemischt, die Kohle durch ein »Millipore AP 250 22OO«-Filter (in den Handel gebracht durch die Firma Millipore Corporation, Bedford, Mass./USA) entfernt und das Filter mit drei 10-itnl-Portionen kaltem Wasser gewaschen. Die Kohle und das Filter wurden dann radioaktiv ausgezählt.

Die radioaktive Zählung aus dem Inhalt der Reagenzgläser Nr. 2 und Nr. 3 wurde dann als maximale Zählung angenommen, da diese Reagenzgläser keine Testverbindung enthielten und infolgedessen eine 0%ige Enzyminhibierung aufwiesen. Die prozentuale Inhibierung des Gehalts der übrigen Reagenzgläser wurde dann berechnet, indem ihre wie oben angegeben bestimmte radioaktive Auszählung mit dem Maximum in Relation gesetzt wurde.

Der Inhalt der Reagenzgläser Nr. 10 bis Nr. 12 wurde, wie im Abschnitt (b) beschrieben, chromatographisch analysiert und als Kontrolle verwendet, wobei die Reagenzgläser Nr. 10 und Nr. 11, die keine zu untersuchende Verbindung enthielten (und somit eine 0%ige Inhibierung zeigten), den Wert 100% erhielten. Der durch den Inhalt der Reagenzgläser in Abschnitt (b) ausgewiesene Prozentsatz der Inhibierung des Versuchs konnte dann hierzu ins Verhältnis gesetzt werden, wozu man die entsprechenden Chromatogramme verglich.

(b) Die Aktivität der zu untersuchenden Verbindung gegen »Synthetase« wurde durch Beobachtung der Formulierung von Dihydropteroat-C¹⁴ wie folgt festgestellt:

Ein Vorrat an Pt wurde aus neutralisiertem ΑΤΡ(50μΙ,0,! M)₁MgCI₂ · 6 H₂O (50 μΐ, 0,1 M),Dithiothreit(100 μΐ, 0,1 M), TrispufTer (100 μΙ, 0,4 M, p„ 8,3), HMPt (25 μΙ, 876 μΜ) und 170 μΙ einer Lösung mit dem Gehalt von HMPPS hergestellt. Dieses Gemisch wurde 60 Minuten bei 37⁰C inkubiert, kurz auf Eis abgeschreckt, bei Raumtemperatur Dextrose (100 μΐ. Gehalt 72,1 mg/ml) und Hexokinase (20 μΙ, Gehalt 2000 Einheiten/ml) zu der Lösung zugegeben und diese dann 15 Minuten lang stehengelassen.

in jedem von fünf Reagenzgläsern wurde eine Lösung von MgCI₂ · 6 H₂O (10 μΙ, 0,1 M)pAB-C¹⁴ (ΙΟμΙ, 0,4 mM), Dithiothreit (20 μΐ, 0,1 M) und Trispufler (20 μΐ, 0,4 M, p_lt 8,3) hergestellt und anschließend wurden zusammen mit Synthetase und/oder der Versuchsverbindung, wie in Tabelle II angegeben, 80 μΐ des obigen Vorrats zu jedem Reagenzglas zugegeben. Die Lösung wurde dann mit destilliertem Wasser auf 200 μΙ aufgefüllt. Es wurden zwei Kontrollproben hergestellt, die jede ATi⁵ (10 μΙ, 0,1 M), MgCl₂ · 6 H₂O (10 μΐ, 0,1 M), Dithiothreit (20 μΐ,/,ΐ M),Trispuffer (20 μΙ,0,4 M, p„ 8,3), pAB-C¹⁴ (ΙΟμΙ,0,4 mM) und 20μΙ einer Lösung mit HMPPS und Synthetase bekannter Aktivität enthielt. Die zu untersuchende Verbindung wurde dem zweiten dieser beiden Reagenzgläser bis zu einer Endkonzentration von 10 ⁵ M zugegeben und dann beide Gläser mit destilliertem Wasser auf 200 μΙ aufgefüllt.

Alle sieben Reagenzgläser wurden anschließend 30 Minuten lang bei 37⁰C inkubiert, auf Eis abgeschreckt und dann zusammen mit den Kontrollproben Nr. 10 bis Nr. 12 von Abschnitt (a) wie folgt chromatographisch analysiert:

100 μΐ des Inhalts aus jedem Reagenzglas wurde auf Whatman Nr. 3 MM-Chromatographiepapier (2 x 20 cm) am Startpunkt aufgebracht und in einem Sorensen-Puffer von Kalium- und Natriumphosphaten (0,1 M, p» 7,0) 10 bis 15 cm absteigend Chromatographiert. Aus den relativen Lagen der einzelnen Flecken, die man von dem Inhalt der verschiedenen Reagenzgläser erhält, konnte die verschiedene prozentuale Inhibierung der Synthetase in bezug auf die Kontrollreagenzgläser Nr. H und Nr. 12, die eine 0%ige Inhibierung ergaben, bewertet werden. Die Spalte X der Tabelle I und die vierte Spalte der Tabelle Il geben den Prozentsatz der Inhibierung an, den DMHP als Versuchsverbindung zeigt.

Verbindungen, die bei diesen Untersuchungen eine 50%ige Inhibierung bei einer Konzentration von 100 μΜ oder weniger liefern, besitzen eine brauchbare Potenzierungsaktivität und können auf Grund ihrer günstigen Toxizität in den Zubereitungen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.

Die Ergebnisse der Inhibierung, die durch die bevorzugten Potentiatoren dieser Erfindung erreicht werden, sind in der Tabelle III angegeben.

Beispiel 2

Es wurden »Klassifizierungsuntersuchungen« durchgeführt, um die Wirksamkeit der Verbindungen der Formel 1 sowohl allein, als auch in Kombination mit einem Kompetitcr und/oder einem Inhibitor und die breuch-

S barsten relativen Konzentrationen einer jeden Komponente zur Bekämpfung oder Verhinderung von Coccidiose zu bestimmen.

Gruppen von »Rangew-Hähnchen in kleinen erwärmten Käfigen mit Drahtböden, die in umgebungsgesteuerten Isolierräumen untergebracht waren, wurden oral mit sporentragenden Oozysten von Eimeria spp wie E. tenella oder E. acervuiina infiziert. Die geeignete Versuchsverbindung bzw. Versuchsverbindungen [DMHP, Sulfachir.oxalin (SQX) oder Diaveridin (DV), oder irgendeine Kombination von diesen] wurden in einer geringen Menge einer spezifisch formulierten Laboratoriumsration mit Vitamin K-Mangel als 1/10 Vorgemisch eingebracht, das dann mittels einer horizontal arbeitenden Walzentrommel in das Futter eingemischt und Gruppen von Küken einen Tag vor der Infektion verabfolgt wurde. Einige Gruppen, die als Kontrolle vorgesehen waren, wurden nicht behandelt. Die Verabreichung wurde mehrere Tage lang, beispielsweise etwa 8 oder 9 Tage, fortgesetzt

Das Ausmaß der Schädigung, erkenntlich durch Schäden in den caecalen Wandungen, wurde bei den Küken, die während des Versuchs eingingen, und bei den anderen, die am letzten Tage der Verabreichung getötet wurden, untersucht und mit den nicht behandelten Kontrolltieren als Basis zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit verglichen. Zusätzlich wurde die Mortalitätsrate und die prozentuale Gewichtszunahme bei den verschiedenen Gruppen bestimmt. Eine merkliche oder begrenzte Wirkung des verabfolgten Arzneimittels konnte sogar dann festgestellt werden, wenn die Mortalitätsraten ähnlich oder gleich waren, weil die Erhöhung der Gewichtszunahmen und die Verringerung des Ausmaßes der Schaden, die sich aus der Schadensbewertung ergibt, für eine Verbesserung typisch ist.

Versuch 1

Gruppen von je S Küken im Alter von einer Woche wurden oral mit 200 000 mit Sporen versehenen Oozysten des Weybridge-Stammes von E. tenella infiziert. Einen Tag vor dieser Infektion wurde DMHP in Konzentrationen von 10, 30,90 oder 250 ppm Futtermittel allein oder zusammen mit einem Gemisch von Diaveridin (30 ppm) und Sulfachinoxalin (30 ppm) verabreicht und dies 8 Tage lang fortgesetzt. Die Mortalität durch Coccidiose und die Schaden, die 6 Tage nach der Infektion bestimmt wurden, sowie die Gewichtszunahme der Tiergruppe wurde vom Tag der Infektion bis zum 6. Tag nach der Infektion ermittelt und mit den unbehandelten Kontrollen verglichen.

ss Versuch 2

Gruppen von je 10 Küken im Alter von einer Woche wurden mit 200 000 sporentragenden Oozyslen des Weybridge-Stamms von E. tenella infiziert. Nach dem Verfahren von Versuch 1 wurden den Tieren zur Bestimmung der potenzierenden Wirkung von DMHP Diaveridin/Sulfachinoxalin-Gemische in Mengen von 60/60,30/30, 15/15 und 7,5/7,5 ppm allein und zusammen mit DMHP in einer Konzentration von 100 ppm verabreicht.

Versuch 3

Gruppen von je 10 Küken im Alter von einer Woche wurden mit 100000 sporentragenden Oozysten von E. tenella infiziert und mit einer suboptimalen Kombination (15/15 ppm) Diaveridin/Sulfachinoxalin allein und zusammen mit DMHP in Konzentrationen von 3, 10, 30 und 90 ppm behandelt.

Versuch 4

Gruppen von je 10 Küken im Alter von einer Woche wurden mit 100 000 sporentragenden Oozysten von E. tenella infiziert und verschiedene Kombinationen von Diaveridin (10, 20 ppm), Sulfachinoxalin (20,40 ppm) und DMHP (10,20 ppm), jede Komponente einzeln oder zusammen entweder mit einer oder den beiden anderen Komponenten, verabreicht, um festzustellen, ob DMHP eine stärkere Potenzierung mit der Pyrimidin- oder Sulfonamidkomponente bewirkt.

Versuch 5

Gruppen von je 5 Küken im Alter von einer Woche wurden mit 100000 sporentragenden Oozysten von E.

tenella infiziert. Es wurden Gemische von 5 Verhältnissen Diaveridin/Sulfachinoxalin von 1 : 1 bis 5 : 1 bei

M) suboptimalen Konzentrationen (40 ppm insgesamt) mit DMHP in vier Dosen von 5 bis 40 ppm verabreicht, um

den optimalen Anteil der drei Komponenten und damit die geringsten Mengen an erforderlichem Arzneimittel lu bestimmen.

Versuch 6

Gruppen von je 5 Küken im Alter von 3 Wochen wurden mit 500 000 sporentragenden Oozysten des Weybridge-Stamms von E. acervuiina infi/icrt, wobei nach dem Verfahren von Versuch I gearbeitet und die zu untersuchende Verbindung bzw. Verbindungen 9 Tage lang verabreicht wurden. Die Coccidiose-Mortalität, die

Schäden, die Gesamtoozyslenabgabe pro Tier während des 5., 6. und 7. tags nach der Infektion, sowie die Gewichtszunahme vom Tag der Infektion bis zum 7. Tag nach der Infektion wurden bestimmt.

Versuch 7

Gruppen von je 5 Küken im Alter von 3 Wochen wurden wie in Versuch 6 infiziert. Einen Tag vor der Infektion wurde DMHP in Konzentrationen von 5,10,30 oder 90 ppm Futter allein und zusammen mit einem Gemisch von Diaveridin (10 ppm) und Sulfachinoxalin (10 ppm) verabreicht und dies 9 Tage lang fortgesetzt.

Versuch 8

Gruppen von je 5 Küken im Alter von 3 Wochen wurden mit 5 000 000 sporentragenden Oozystcn des Weybridge-Stamms E. acervulina infiziert und nach dem Verfahren von Versuch 7 vorgegangen, mit der Ausnahme, daß DMHP nur in Konzentrationen von S, 10 und 30 ppm verabreicht wurde.

Versuch 9

Gruppen von je S Küken im Alter von 1 Woche wurden mit 100 000 sporentragenden Oozysten des Weybridge-Stamms E. tenella infiziert und nach dem Verfahren von Beispiel 1 behandelt. Den Tieren wurden 4 :1-Sulfachinoxalin/Diaveridin-Gemische in Mengen von 80/20,60/15,40/10 und 20/5 ppm allein und zusammen mit DMHP in einer großen Vielzahl von niedrigen Konzentrationen verabreicht.

Die Ergebnisse dieser Klassifizierungsuntersuchungen sind in der nachfolgenden Tabelle IV angegeben, in der die Konzentration der verschiedenen Komponenten in ppm der Tiernahrung, die Mortalität durch Coccidiose, der Prozentsatz der Gewichtszunahme, die Schadenbewertung, die Oozyslenabgabe und die Aktivität bewertet wurden. Der caecale Schadenindex wird berechnet, wobei das nachfolgende Bewertungssystem verwendet wird:

0 = Keine Schaden.

1 = Wenige Haemorrhagien; keine Eindickung der caecalen Wandung.

2 = Mäßige Haemorrhagien; gewisse Eindickung der caecalen Wandung.

3 - Zahlreiche Haemorrhagien mit vorhandenen caecalen Geschwülsten.

4 - Zahlreiche Haemorrhagien; Caecum mit großen Geschwülsten erweitert.

Der Caecalschaden-Index

(Gesamtschadenbewertung der überlebenden Tiere)

+ (4x Anzahl der eingegangenen Tiere)

ursprüngliche Anzahl der Tiere

10 15 20 25 30

Weiterhin wird bei jedem Tier, das während des Versuchs an Coccidiose eingeht, eine Bewertung von 4 eingesetzt.

In der Spalte zur Kennzeichnung der Aktivität kennzeichnet +++bzw. ++,+,±und - eine sehr hohe, hohe, leichte, zweifelhafte und keine Aktivität des untersuchten Arzneimittels gegen die Eimeria-Infektion.

Ergebnisse

Die Versuche zeigen, daß, während DMHP allein bei allen untersuchten Konzentrationen gegen die Infektion mit E. tenella unwirksam war, die Aktivität der Mehrzahl der geprüften Diaveridin/Sulfachinoxalingemische durch DMHP in vielen Fällen um das 3- bis4fache potenziert wurde, wodurch eine bessere Kontrolle der Infektion, ein merklicher Rückgang der caecalen Schaden und das Wiedererreichen des Gewichtes der Tiere auf den Wert vor der Infektion erreicht wurde. Obgleich bei einer Erniedrigung der Konzentration von DMHP ein Absinken der Aktivität beobachtet wurde, läßt dessen Zugabe zu Kombinationen sogar in einer Höhe von nur 10 ppm eine merkliche Verbesserung der Aktivität erkennen, wobei mit einem 4 : 1-Sulfachinoxalin/Diaveridingemisch bei der Zugabe von nur 5 ppm DMHP noch eine Verbesserung in der Schadensbewertung festzustellen war.

Weiterhin wurde gefunden, daß bei der Behandlung der E. tenella-Infektion bei alleiniger Verwendung von Diaveridin oder Sulfachinoxalin durch Zugabe von DMHP in den angegebenen Mengen nur eine geringe Potenzierung erfolgt. Es hat den Anschein, daß die Dreierformulierung für die gute Aktivität erforderlich ist, obgleich die Möglichkeit der Potenzierung einer einzigen Komponente in anderen Konzentrationsbereichen nicht ausgeschlossen werden kann.

Eine breite Vielzahl relativer Konzentrationen der drei Komponenten ergab günstige Aktivitäten, wobei jedoch festgestellt wurde, daß die bereits erwähnten Kombinationen, nämlich mit 15 bis 60 ppm Sulfachinoxalin, 15 bis 60 ppm Diaveridin und 10 bis 90 ppm DMHP, besonders wirksam waren. Die bevorzugten Konzentrationsveiiiältnisse von Sulfachinoxalin/Diaveridin waren 1 : 1 oder 2 : I bei niederen Gcsamtarzneimittelkonzentrationen oder bis zu 4 : 1 bei höheren Konzentrationen.

In den Versuchen, die bei mäßigen Infektionen mit der intestinalen Spezies E. acervulina durchgeführt wurden, wurde testgestellt, daß DMHP allein bei Konzentrationen von 250 und 90 ppm wirksam war, obgleich unter dieser Menge die Aktivität abfiel, wie dies aus der Senkung des Prozentsatzes der Gewichtszunahme und aus der Erhöhung der Oozystenabgabe zu schließen ist. In ähnlicher Weise war ein 10 ppm Diaveridin/10 ppm Sulfa-

40 45 50

55

60

65

chinoxalingemisch allein relativ unwirksam, wobei jedoch die Zugabe von DMHP eine signifikante Erhöhung der Aktivität bewirkte, die bei der niedrigsten Konzentration an eingesetztem DMHP aufrechterhalten wurde.

Eine Erhöhung der als Infektionsquelle verwendeten Anzahl von Oozysten von E. acervulina um eine Größenordnung führte zur Inaktivität von sowohl DMHP allein als auch eines Gemisches von 10 ppm Diaveri-

din/10 ppm Sulfachinoxalin. Die Dreifachpotenziening wurde durch Zugabe von DMHP zu dem Gemisch nachgewiesen, wobei die Infektion bei allen Konzentrationen des untersuchten DMHP kontrolliert wurde.

Beispiel 3

ίο Es wurde ein weiterer Versuch durchgeführt, um zu prüfen, ob eine Verbindung der Formel 1 entweder einen KorcjTstitor und/oder einen Inhibitor bei der Bekämpfung oder Unterdrückung der bakteriellen Infektion mit Pasteurella multocida potenziert.

Versuch 1

Gruppen von je 10 Küken wurden oral mit 8 x 10* Organismen von Pasteurelle multocida infiziert. Zwei Tage vor der Infektion wurden Gemische von 8S/1S Sulfachinoxaiin-Diaveridin allein oder zusammen mit DMHP im Verhältnis von 50/20,50/10,50/5, 25/20,25/10 und 25/5 ppm Futter verabreicht, wobei einige Gruppen zur Kontrolle unbehandelt blieben. Es wurde die kumulative Mortalität vom Infektionstag an und die Gewichtszunähme als Prozentsatz der Gewichtszunahme von nicht infizierten Kontrolltieren bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle V angegeben.

Versuch 2

Es wurde ein Versuch nach dem Verfahren von Versuch 1 durchgeführt, bei dem jedoch 85/15-Gemische von Sulfachinoxalin und Trimethoprim (TMP) mit DMHP in Verhältnissen von 25/20,25/10,25/5,12,5/20,12,5/10

und 12,5/5 kombiniert wurden. Die kumulative Mortalität vom Zeitpunkt der Infektion an ist in der Tabelle VI angegeben.

Aus den Ergebnissen des Versuchs 1 ist zu ersehen, daß Diaveridin allein eine geringe Aktivität und eine sehr

geringe potenzierende Wirkung auf Sulfachinoxalin hat, das allein gute Aktivität aufweist. Die Zugabe von DMHP liefen sogar bei 5 ppm im Futter eine merkliche Erhöhung der Aktivität des Diaveridin/Sulfachinoxalingemisches. Im zweiten Versuch wurde eine geringere potenzierende Wirkung durch DMHP auf die Kombination von Trimethoprim und Sulfachinoxalin bei den verwendeten Dosierungen beobachtet.

Beispiel 4

Bei weiteren Versuchen zum Studium der antibakteriellen Wirksamkeit von Sulfamcthoxazol und Trimethoprim, entweder einzeln mit DM HP oder als Dreierkombination, potenzierte DMHP sowohl die Aktivitäten von Sulfamethoxazol als auch von Trimethoprim gegen Staphylococcus aurcus und erhöhte weiterhin die synergistische Wirkung dieser Arzneimittel, wenn sie in Kombination angewandt wurden. Die Tabelle VII faßt die Ergebnisse von einem Versuch zusammen, der in »Wellcome-Nähr-Agar« durchgeführt wurde, wobei die Inkubation 18 Stunden lang bei 37°C fortgesetzt wurde.

Beispiel 5

Die Potenzierung durch DMHP wurde ebenso durch die Betonung der Inhibicrungswirkungen von Trimethoprim und Sulfamethoxazol auf die Wuchsgeschwindigkeit, festgestellt durch Trübungsmessungen, von Staphylococcus aureus N 491 während einer 7stündigen Inkubation in Wellcome-Nährbrühe bei 37°C nachgewiesen. Bei diesen Versuchen wurden unter der Wirkungsgrenze liegende Dosen von Trimethoprim und Sulfamethoxazol verwendet, wobei der Prozentsatz der Inhibierung in Tabelle VIII angegeben ist.

Beispiel 6

Die Ergebnisse eines ähnlichen Versuchs, wie er in Beispiel 4 beschrieben wurde, sind graphisch in Tabelle IX dargestellt, wobei die Wuchsgeschwindigkeit spektrophotometrisch gemessen wurde. In dieser Tabelle ist der Prozentsatz deserhaltenen Wuchses durch den farbeinheitlichen Streifen dargestellt, wenn 10 μ% DMHP pro ml vorhanden waren und durch den gesprenkelten Streifen, wenn DMHP fehlte.

Dieser Tabelle ist zu entnehmen, daß DMHP nicht nur die Wirkungen von Trimethoprim und Sulfamethoxazol steigert, wenn diese Arzneimittel einzeln wirken, sondern auch das Vorhandensein ganz allgemein die Aktivität ihrer Kombinution verbessert und potenziert.

Beispiel 7

In diesem Beispiel werden die Wirkungen von DMHPa-'rdie bakterieide Aktivität von Trimethoprim und Sulfamethoxazol gegen Staphylococcus aureus, einzeln und in Kombination, bestimmt.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle X angegeben, wobei die bakterieide Aktivität als Prozentsatz des Anfangsinoculums ausgedrückt ist und gemessen wurde durch Zählen der lebensfähigen Bakterien, die nach 24stündiger Inkubation bei 37°C noch am Leben waren. Das verwendete Inoculum lieferte eine Endkonzentration von 1O*¹ Organismen pro ml.

Obgleich weder Trimethoprim in einer Konzentration von 1,0 ng/ml, noch Sulfamethoxazol in einer Konzentration von 10 μβ/ml ohne DMHP baktericid wirksam waren, sind beide sehr aktiv, wenn 10 μg/ml DMHP zugegen ist. Weiterhin wurde die bakterieide Wirksamkeit von 0,1 μ§ Sulfamethoxazol pro ml wesentlich erhöht wenn 10 ng/ml DMHP vorhanden war.

Beispiel 8

Bei diesem Versuch wurden die Bereichsangaben für den Inhibitor zur Bewertung der synergistischen Wirksamkeit von DMHP oder seines 7,7-Diäthylanalogen auf ihre Kombination mit Trimethoprim (TMP) und/oder Sulfamethoxazol (SMX) gegen Staphylococcus aureus und Pseidomonas aeruginosa untersucht.

Das Pteridin wurde in ein Soja-Pepton-Medium mit geringem Thymidingehalt (Wellcotest Sensitivity Test Agar), das in einer Petri-Schale enthalten war, eingebracht und die andere Komponente bzw. Komponenten in das Loch gegeben, das man durch Entfernen eines kleinen Pfropfens aus dem Medium bildet. Die Oberfläche des Mediums wurde mit dem zu untersuchenden Organismus geimpft und dann bebrütet. Das Ausmaß des Inhibierungsbereiches ist in der Tabelle XI angegeben, wobei die Zahlen die vollständige Inhibierungszone (d. h. die 15 L-

Zentimeterzahl von der Kante des Loches nach etwa sechsfacher Vergrößerung) und die Zahlen in Klammern die Zonen der Teilinhibierung angeben. <

Die Ergebnisse zeigen, daß die beiden Verbindungen mit TMP und SMX allein und mehrfachen Synergismus "

mit beiden gegen Staphylococcus aureus aufweisen, wobei das Diäthylanaloge etwas aktiver als DMHP ist. Eine Potenzierung gegen Pseudomonas aeruginosa ist bei DMHP ebenso festzustellen, wobei dieses die höhere Potenzierung gegen diesen Organismus aufweist.

Beispiel 9 Bei diesem Versuch wurden Mäuse intraperitoneal mit in 3%igem Schweinemagenschleim suspendiertem Sta- 25 '

phylocoecus aureus infiziert. Gruppen der Tiere wurden oral und intraperitoneal mit Trimethoprim und Sulfamethoxazol einzeln und zusammen mit und ohne DMHP zweimal täglich 3 Tage lang behandelt. Die Ergebnisse, die in der Tabelle XII angegeben sind, zeigen, daß DMHP die Schutzwirkung von TM P und SMX erhöht.

Beispiel 10

Die Wirkung von DMHP auf die Wirksamkeit von Pyrimethamin allein oder zusammen mit Sulfamethoxazol wurde bei mit Protozoen von Toxoplasma gondii infizierten Mäusen geprüft. ^;

Die zum Versuch verwendeten Mäuse wurden mit 0,5 ml eines 10 ' Exudats von Mäusen (5000 Protozoen) '

infiziert, was etwa 1000 LD5,,-Dosen entpricht. Die Behandlung wurde in der Weise durchgerührt, daß man die Verbindung oder die Kombination unmittelbar nach der Infektion, dann 6 Stunden später und wiederum 24 und 28 Stunden später verabreicht. Die in der Tabelle XIIl angegebenen Ergebnisse zeigen, daß DMHP die Antiprotozoonwirksamkeit sowohl von Pyrimethamin allein als auch in Kombination mit Sulfamethoxazol potenziert.

Beispiel 11
Tablettenformulierung:

DMHP (rein) 100 mg Trimethoprim (rein) 25 mg Sulfaguanidin (B.P.C.) 100 mg

+ Maisstärke, Lactose, Gelatine, Talkum und Magnesiumstearat

Herstellung - die oben angegebenen Bestandteile werden unter Verwendung bekannter pharmazeutischer Verfahren miteinander gemischt, granuliert und danach zu Tabletten verpreßt.

Beispiel 12 Tablettenformulierung: m

»Pyremathimine« (Pyrimethamin) B.P. 15 mg S|

DMHP (rein) 150 mg Tablettenherstellung wie in Beispiel 11.

Beispiel 13
Tablettenformulierung:

Sulfanilamid B.P.C. 150 mg DMHP (rein) 175 mg Tablettenherstellung wie in Beispiel 11. Kapselformulierung:

Trimethoprim (rein) DMHP (rein)

Beispiel 14

mg mg

Herstellung - die Verbindungen wurden in körniger Form zusammen mit Lactose, Maisstärke und Magnesiumstearat gemischt. Das Pulver wurde in zweiteilige Gelatinekapseln unter Verwendung einer Kapselfullmaschine abgefüllt.

Spüllösung:

Trimethoprim (rein) Lösungsmittel

Spüllösung:

DMHP (rein) (7-Amino-p-toluolsulfonamid (rein)

Lösung:

DMHP (rein) Diaveridin B. Vet C Kelfizina Lösungsmittel

Beispiel 15

i mg/mi 0,2 mg/ml Wasser

Beispiel 16

2 mg/ml 2 mg/ml

Beispiel 17

1,5 mg/ml 0,5 mg/ml 1,0 mg/m! Wasser

Tabelle

III

Vl

VII

Endkonzentration

IX

Prozentuale Inhibierung

Reagenz-	-	μΙ	100	μΐ	15	μΐ	-	10	μΐ	- - -	-
glas-Nr.	5	μ)	100	μΙ	15	μΐ	-	10	μΐ	-	-
1	5	μΐ	100	μΐ	15	μΐ	-	10	μΐ	- - -	-
2	5	μΐ	100	μΐ	15	μΐ	-	10	μΐ	2,5XlO6M -	44
3	5	μί	100	μΐ	15	μΐ	-	10	μΐ	2,5 χ 10" M -	33
4	5	μ!	100	μΐ	15	μ)	-	10	μΐ	1Χ1Ο"5Μ	87
5	5	μΙ	100	hJ	15	μΐ	-	10	μΐ	IXlO5M	55
6	5	μΐ	100	μ]	15	μΙ	-	10	μΐ	0,93 χ 10" M -	98
7	5		100	μΙ	15	μΐ	-	10	μΐ	0,93XlO4M -	95
8
9
Kontroll	-	μΐ	-		-		10 μΐ	-		10 μΙ 20 μΐ - 10 μΐ	-
versuche	5	μΐ	-		-		10 μΐ	-		10 μΙ 20 μΐ - 10 μΐ	-
10	5		-		-		10 μΙ	-		10 μΙ 20 μΙ IX 10 5M 10 μΐ	79
U
12

14

Tabelle II Synlhctase

Versuchsverbindung Kndkon/enlralion

Inhibierung

Reagenzglas Nr. 1

2
3
4
5
Kontrollen

Tabelle Hl

8,7 x 10"⁵M 1 x 10"⁵M 2,5 x 10"~M

1 X 10"⁵M

83

	Versuchsverbindung	R1	R2	ICs0	% Gew. Sehad.	Aktivität
	R			(μΜ)	Zunahme Bewer
		Me	Me	2-4	tung
	CH2OH	Me	Me	75
	Me	Me	Me	5
	CH2Br	Me	Me	25
	CHBr2	Et	Et	2,1
	CH2OH
Tabelle IV		Konz.	Kon*.	Mortalität
Ver- Behandlung	Kon/.. DV	SQX	DMHP	durch
such	im Futter	im Futter	im Futter	Kokzidiosc
		ppm	ppm
	ppm

nicht infiziert,

nicht behänd. Kontrolle

infiziert, nicht behänd.

Kontrolle

DMHP
DMHP DMHP DMHP

SQX + DV 30 30

SQX + DV + DMHP 30 30

SQX + DV + DMHP 30 30

SQX+ DV+ DMHP 30 30

SQX+ DV+ DMHP 30 30

nicht infiziert,

nicht behänd. Kontrolle

infiziert, nicht

behänd. Kontrolle

SQX + DV 60 60

SQX+ DV 30 30

SQX+ DV 15 15

SQX+ DV 7,5 7,5

SQX + DV + DMHP 60 60

SQX + DV + DMHP 30 30

SQX+ DV+ DMHP 15 15

SQX + DV + DMHP 7,5 7,5

250 90 30 10

250 90 30 10

100 100 100 100

2/5
1/5
2/5
3/5
3/5
0/5
0/5
0/5
0/5
0/5

0/10

6/10

6/10

0/10

0/10

0/10

100

26 29 36 45 40

9Q

96 89 89 79

100

100

104

0,0

3,4 3,0 3,2 3,4 3,4 !,6 0,0 0,0 0,0 1,0

0,0

3,6 0,1 2,2 3,4 3,9 0,0 0,0 0,2 2,5

15

Tabelle IV (Fortsetzung)

	6/10
	4/9
90	0/10
30	0/9
10	0/9
3	3/10

4	3,7
42	3,3
95	0,0
100	1,0
61	2,6
31	3,3

	6/10
	8/10
	8/10
10	8/10
10	8/9
10	5/9
	7/10
10	3/10
	8/9
	9/10
20	6/10
20	1/9
20	9/10
	0/10
20	0/10

Il	3,6
18	3,8
5	3.8
16	3,8
-1	3,7
15	3,2
27	3,8
26	3,4
18	3,8
20	3,9
20	3,6
32	2,8
19	4,0
80	2,0
90	1,2

Ver- Behandlung Konz. DV Konz. Konz. Mortalität % Gew. Schad. Aktivität

such im Futter SQX DMHP durch Zunahme Bewer-

5 im Futter im Futter Kokzidiose tung

ppm ppm ppm

nicht infiziert,

nicht behänd. Kontrolle 0/10 100 0,0

infiziert, nicht behänd.

Kontrolle

SQX+ DV 15 15

SQX+ DV+ DMHP 15 15

SQX+ DV+ DMHP 15 15

SQX+ DV+ DMHP 15 15

SQX+ DV+ DMHP 15 15

nicht infiziert,

nicht behänd. Kontrolle 0/iO 100 0,0

^:u infiziert, nicht behänd.

Kontrolle

DV 10

SQX - 20

DMHP -

DV+ DMHP 10

SQX +DMHP - 20

SQX DV 10 20

SQX DV+ DMHP 10 20

DV 20

SQX - 40

DMHP -

DV + DMHP 20

SQX +DMHP - 40

JS SQX DV 20 40

SQX DV+ DMHP 20 40

nicht infiziert,

nicht behänd. Kontrolle 0/20 100 0,0

infiziert, nicht behänd.

Kontrolle 19/20 18 3,9

1 : I

1:1 20 20 40 0/20 97 0,5 +++

1:1 20 20 20 0/20 94 1,5 ++

« 1:1 20 20 10 1/20 84 2,3 +

1:1 20 20 5 2/20 73 2,8 ±

2: 1

2: 1 26,7 13,3 40 1/20 97 0,9 +++

2:1 26,7 13,3 20 0/20 87 1,4 ++

2:1 26,7 13,3 10 3/20 69 2,8 ±

2: 1 26,7 13,3 5 8/20 87 3,2

3: 1

3:1 30 10 40 0/20 92 1,6 ++

55 3:1 30 10 20 7/72 84 2,3

3:1 30 10 10 7/19 60 3,2

3:1 30 10 5 11/20 57 3,5

4:1

4:1 32 8 ,40 0/20 94 1,5 ++

⁶⁰ 4:1 32 8 20 3/20 83 2,7 ±

4:1 32 8 10 9/20 71 3,2

4:1 32 8 5 15/20 40 3,7

5:1

65 5:1 33,4 6,6 40 1/20 100 2,0 +

5: 1 33.4 6.6 20 7/20 70 3,4

5: 1 33.4 6,6 10 12/20 42 3,6

5: 1 33,4 6,6 5 18/20 31 3,9

Tabelle IV (Fortsetzung)

Vcr- Behandlung
such

1 :
2:
3:
4:
5:

nicht infiziert,

nicht behänd. Kontrolle infiziert, nicht behänd.

Kontrolle
SQX + DV
SQX + DV + DMHP SQX + DV + DMHP SQX+ DV+ DMHP SQX+ DV+DMHP

nicht infiziert,

nicht behänd. Kontrolle

infiziert, nicht behänd.

Kontrolle

DMHP

DMHP

DMHP

DMHP

SQX + DV

SQX+ DV+ DMHP

SQX+ DV+ DMHP

SQX+ DV+ DMHP

SQX+ DV+ DMHP

nicht infiziert,
nicht behänd. Kontrolle infiziert, nicht behänd. Kontrolle

DMHP

DMHP

DMHP

SQX + DV

SQX+ DV+ DMHP

SQX+ DV+DMHP

SQX+ DV+DMHP

nicht infiziert,

nicht behänd. Kontrolle

infiziert, nicht behänd.

Kontrolle
SQX + DV
SQX + DV
SQX + DV
SQX + DV
SQX+ DV+ DMHP SQX+ DV+DMHP SQX+ DV+ DMHP SQX+ DV+ DMHP

Korv. DV	Kon/.	Konz.	Mortalität	% Gew.	—	Schad.
im Futter	SQX	DMIIP	durch	Zunahme	Bcwcr
	im Futter	im Futter	Kok/idinsc		lung
ppm	ppm	ppm
20	20		5/20	72	3,0
26,7	13,3	-	16/20	77	3,8
30	10	-	18/20	23	3,9
32	8	-	19/20	2	4,0
33,4	6,6		15/2G	42	3,7
		40	19/20	7	3,9
-	-	20	18/20	15	3,9
-	-	10	19/20	2	3,9
-	-	5	2C/2O	4,0

80 60 40 20 80 60 40 20

30 30 30 30 30

10 10 10 10 10

10 10 10 10

20 15 10

20 15 10

250 90 30 10

-ve

24,48

-ve

-ve

-ve

-ve

-ve

-ve

0,0

0/20

100

48

95

105

109

107

99

100

	11,45	58
90	5,06	108
30	4,57	97
10	8,84	73
5	16,18	78
	6,42	88
90	-ve	115
30	1,12	110
10	2,35	98
5	5,81	103

100

	0.07	-2
30	0,0	5
10	0,0	12
5	0,0	6
	2,304	25
30	0,0	79
10	0,0	83
5	1,76	70

100

0,0

3,3 0,2 0.0 0,1 0.0 0,0

0,0

	12/20	29	3,6
	0/20	102	0,5
	0/20	93	2,0
	7/20	61	3,3
	12/20	38	3,6
30	0/20	105	0,0
22,5	0/20	106	0,0
15	0/20	82	2,1
7,5	13/20	34	3,7

Aktivität

Tabelle IV (Fortsetzung)

Ver- Behandlung	SQX + DV + DMHP	Konz. DV	Konz.	Konz.	8 9 10	Mortalität	%Gew.	Schad.	gewicht	des	(g)	Aktivität B	+++
such	SQX + DV + DMHP	im Futter	SQX	DMHP		durch	Zunahme	Bewer	überlebenden		I	+++
	SQX + DV + DMHP		im Futter	im Futter	Kokzidiose		tung	der Behandlung Kücken			+
	SQX+DV+DMHP	ppm	ppm	ppm				(g)			-
SQX + DV + DMHP	80	20	20	0/20	104	0,0			+++
SQX + DV + DMHP	60	15	15	0/20	102	0,3	+++
SQX + DV + DMHP	40	10	10	0/20	77	2,3	-
SQX + DV + DMHP	20	5	5	12/20	25	3,6	-
SQX + DV + DMHP	80	20	15	0/19	106	0,0	+++
SQX + DV + DMHP	60	15	11,3	0/19	102	0,5	++
SQX + DV + DMHP	40	10	7,5	1/20	78	2,9	+
SQX + DV + DMHP	20	5	3,8	8/20	55	3,3	-
SQX + DV + DMHP	80	20	10	0/20	99	0,0	+++
SQX + DV + DMHP	60	15	7,5	0/20	97	1,1	+++
SQX+ DV+ DMHP	40	10	5	0/20	70	2.7	-
SQX+ DV+ DMHP	20	5	2,5	11/20	29	3.6	-
Tabelle V	80	20	5	0/20	102	0,2
Gruppe 15 : 85 DMHP	60	15	3,8	0/20	98	1,2	Gewichts
DV/SQXX	40	IO	2,5	3/20	72	3,0	zunahme
	20	5	1,3	12/20	32	3,6
ppm ppm	Kumulative	Mortalität nach Tagen	Durchschnitts- Durchschnitts	(V. der
			gewicht des	Kontrolle)
		Kücken, Tag
12 3 4	5 h 7

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11 12 13 14 15

50 50 50 25 25 25 100 50 25

DV SQX

30 -

15 170 85

Nicht infiziert

20 10

20 10

- - - - - ι ι ι ι ι

- - - - 1 1 1 1 1 --24566666 -12 3 4 5 5 5 5 -1 13456666

-445679999 -3 368 10----

-255667777

-1 22589 10-

- - - 1 1 1 3 3 6 9 9 10 -

- 126,0

- - 133,0 1 I 130,0

- - 126,5

- - 131,0

261,0 244,0 202,0 225,0 179,0 131,0 233,5 105,0

140,0

259,5 234,0

282,:5

86

77 47 64 36

67

84 69

100

IR

Tabelle VI

Gruppe

15:85

TMP

ppm

SQX

UMHP
ppm

Kumulative Mortalität an den Tagen 123456789 10

Tabelle VII

25

25

25

12,5

12,5

12,5

50

25

12,5

TMP

15

30

0
0
0
0
0
0

4 4

2 2

3 3

4 4

0 0

0
0

1
4

SQX

85 42,5

0 4 4

0 2 5

0 0 0

0 5 6

3 3 4

2 5 7 5 6 7 0 5 8

8 8 1

7 7

7 10 10

0

9

6

8

9 8

0 10

7

8

9 9

0

9

10

8 1

10

9

1111

M.I.C. in (ig/ml und Erhöhung der Aktivität von SuU'amelhoxazol und Trimethoprim

Verbin- Konz. von Sulfamcthoxazol Trimethoprim Trimethoprim in Gegenwart

dung DMHP von χ 20 Sulfamethoxazol

M. I.C. Aktivitül M. I.C. Aktivität

M. I.C.

Aktivität

DMHP

keine

25 12,5

6,2

3,1

i.O

0,03

0,3

0,3

1,0

XlOO
XIO
x 10
Xl

0,3

0,0015
0,015
0,015
0,05

x x 30 x 30 x IO

0,015

<0,00015 0,0005 0,0015 0,005

>X3OO XlOO X XlO

Tabelle VIII

Arzneimittel ug/ml Pro/entsalz der Inhibicrunj; nuch 7 Stdn.

Trimethoprim Sullamelhoxazol DMlIP DMHP DMHP

kein 5 ng/ml 10 μg/ml

Vers. 1 Vers. 2 Vers. 1 Vers. 2 Vers. I Vers.

0,004	—	8	6	0	3	85	55
0,002	-	10	12	0	1	0	39
0,002	0,1	17	1	74	99	97	96
0,002	0,2	19	14	95	97	98	99
0,001	0,1	0	1	96	98	97	98
-	0,1	16	8	20	89	87	97
_	0,2	34	10	51	98	94	90

19

Tabelle IX

Trimethoprim

ίο

35 40 45

Trimethoprim SMX 0.03'

♦Sulfamethoxazol Tabelle X

100

χ>·ί

1001

15	Trimethoprim SMX* 1,0' ug/ml	0 100
		ϊ *
	Trimethoprim SMX 0.3· ug/ml
25		0 100
		•yj 1 50
30	Trimethoprim SMX 0,1* ug/ml

50"

R.

0,01

0,0J 0,1

Trimethoprim - ug/ml

50 Behandlungsmittel - :*/ηιΙ l'ni/cnlsat/ des lebensfähigen Inoculums nach 24 Sldn.

Trimethoprim Sulfamelhoxazol I)MIII' DMIIP I)MHP

kein 5 ι*/ml IO ijg/ml

Versuch 1 Versuch 2 Versuch I Versuch 2 Versuch I Versuch 2

55

1.0	—	1.0	>IOO	>100	41
0,3	-	1.0	>IOO	>100	>IOO
0.1	3.0	>IOO	85	100
-	10.0	>IOO	>100	>100
-	>KH)	>100	>100
_	>|(M)	>1(M)	.1

15	7
>100	>IOO
0,33	24
>100	>100
45	>100
8	>l

20

Tabelle XI

Drug	Staphylococcus	aurous	TMP + SMX	I'scudomonas aeruginosa	SMX	TMP + SMX
	TMP	SMX	(S)(IOO)	TMP	(300)	(5)(100)
(«!/ml)	(30)	(300)	(30)

R=CH₂OH R'=R² = Et (30) R=CH₂OH R' = R²=El

R=CH₂OH R'=R² = Et

DMHP

DMHP

DMHP

Kontrolle

Tabelle XII

12,5(17,0) 12,5(17,0) 12,5(17,0)

10,5(13,0) 10,5(14,0) 11,0(14,5)

8,5 (iü,

8,0(10,0) 6,0 (7,0) nicht geprüft

(5,0) 13 (16,0)

11,0(14,0) 9,0(14,5) 11,5(14,5)

nicht geprüft

4,0(10,0) 3,0 (7,0)

10,0(12,0) 8,5 (10,0) (5,0)
(5,5)

9,0(14,0) 6,0 (8,0)

8,0(12,0)

6,5(i2,5) i0,5 (Ί2,5) (3,0) 9,ϋ(Ί3,ϋ) 7,0(10,0)

8,5(10,5) 5,0(12,0) 10,5(12,0) (6,0) 15,0(20,0) 12,0(15,0)

10

20

8,0(11,0)

3,5 (5,0)

mg/Maus

SMX

mg/Maus

DMHP

mg/Maus

P.O. IP.

Durchschnifts-Tugc "A Überleben Überleben

Verbesserung

den. DMHP

2,0 1,0

0,5

0,25

0,25 0,125

2,0

1,0 0,5

2,0 1,0 0,5

0,5 2,0 1,0 0,5

2,0

1,0 0,5

2,0 1,0 0,5

0,5

2,0 KO 0,5

5,0
4,16
1,83
2,16
14

0 0 0

0 0 0

0 0

50 50

0 0 0

0 0

0 0

100

66,6

16,6

0 0 0 0 0 0

35

40

45

50

55

60

65

21

Tabelle XIII	mg/Maus	DMHP mg/Maus	% Überleben	2 mg oral durchschnittl. Überlebenszeit Tage	% Überleben	2 mg intraperitonal ,; durchschn. % ;V; : Überlebenszeit Überleben ;.<:" Tage I	gj η ι" κ?
Arzneimittel	Pyrimeth amin	ohne durchschnittl. Überlebenszeit Tage	33.3	> 17,83	50	4,0	0
Sulfameth- oxazol	0,8	> 15,33	33,3	>17,0	33,3	>12,0	0
	0,4	> 18,83	0	9,16	0	8,66	0
	0.2	10,16	0	7,83	0	6,16	cn JU
	0,1	8,16	16.6	>24,5	66,6	>21,ίό	16,6
	0,4	> 19,33	33.3	> 18,5	33,3	>U,16	0
!	0.2	> 19.33	0	>15.16	16,6	12,5	0
1	0.1	11,0	16.6	10,83	0	10,16	ο Ι 1
1	0,05	> 12,83	0	7,0	0	6,33
1	nichtbehandelte Mäuse	6,5

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Zubereitung zur Behandlung von Mikrobeninfektionen, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Verbindung der allgemeinen Formel 1

H₂N

U)

oder ihrer tautomeren Formen oder ihrer pharmazeutisch verträglichen Salze, worin R eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist, die mit einer Hydroxygruppe, mit einem oder mehreren Halogenatomen oder mit einer gegebenenfalls substituierten Phenoxygruppe substituiert sein kann und die Reste R¹ und R² gleich oder verschieden sind und jeder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist, oder R¹ und R² zusammen ein Spirocycloalkylringsystem mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen außerhalb des Pteridinrings bilden und ein Sulfonamid enthält.

2. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich ein Benzylpyrimidin enthält.

3. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie 1 bis 30 mg/ml von sowohl einer Verbindung der Formel 1 als auch von einem Sulfonamid und 0,03 bis 1 mg/ml eines Benzylpyrimidins in einem pharmazeutisch verträglichen Lösungsmittel, enthält.

4. Pharmazeutische Zubereitung nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Sulfonamid Sulfachinoxalin und das Benzylpyrimidin Diaveridin ist.