DE2236201A1 - Verfahren zur herstellung von reinem kristallinem leukoagglutinin - Google Patents

Description

DIPL.-IJNTG. HANS W. GROENING

DIPL.-CHEM. DR. ALFRED SCHÖN 223620 1

PATENTANWÄLTE

S/M 33-2 '■■■■'

Oy MEDIX Ab, Apollogatan 5 B, 00100 Helslngfors,

Finnland

Verfahren zur Herstellung von reinem kristallinem Leukoagglutinin

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von reinem kristallinem Leukoagglutinin.

Es ist "bekannt, 'dass die Sameza der Bohnenpflanze Pteaeolus vulgaris Substanzen enthalten«, die Phytohämagglutlaia® (PHA) genannt werden. Diese Substanzen "besitzess eine mitogesi© Aktivität, d.h. sie vermögea das Wachstum sowie di© !Dellung von Lymphozyten in G-ewebekultüren zu stimalieren, P%toliäfflagglutinin enthält einige Komponenten mit wechselnder mitogeuer Aktivität. Eine diaser Komponentea ist Iieuk;oagglutinin₉ das stark mitogen ist«, Die Leukoagglutisiinagglutinst© ait Blutzellen (Leukozyten) vermögen jedooh nieht rote Blutzellen (Erythrozyten) zu agglutinieran. Erytteoagglutinin iet eine andere Komponente von Phytohämagglmtinisio Ferner köaaen kombinierte Lsukoerythroagglutinin© irox-liegera^ welch® sowohl Leukozyten als auch Erythrozyten agglirtelnie-ren imä aueh eis© Lymphosyteiiteiluag stimulieren, jedoch wahrscheinlich nieht

209885/1345

- 2 so stark wie Leukoagglutinin.

Leukoagglutinin ist bereits in reiner Form isoliert worden, jedoch nur in kleinen Mengen sowie unter Verwendung von Verfahren, die nicht für eine Durchführung in industriellem Maßstäbe geeignet sind (T. Weber (1969) Scand.J.Clin.Leb.Invest. Suppl. 111, L.W. Allen et al (1969) Proc.Natc.Acad.Scie.63, 334). Reines Leukoagglutinin in kristalliner Form wurde bisher noch nicht isoliert.

Sie Phytohämagglutinin-Präparate, die im Handel erhältlich sind, beispielsweise Bacto-Phytohämagglutinin M und Bacto-Phytohämagglutinin P, vertrieben von der Difco Laboratories, USA, sowie die Zubereitungen, die unter der Bezeichnung Phytohämagglutinin von der Wellcome Reagents Ltd., Grossbritannien, in den Handel gebracht werden, sind ziemlich unreine Mischungen, welche offensichtlich neben Leukoagglutinin und Erythroagglutinin einige Komponenten enthalten, die das Lymphozyten-Wachstum stimulieren.

Erfindungsgemäss ist es nunmehr möglich, das Leukoagglutinin in reiner kristalliner Form zu isolieren. Reines Leukoagglutinin besitzt folgende charakteristische Eigenschaften:

Sei der Scheibenelektrophorese bei einem pH von 4*5 bewegt es sich in Form einer einzigen Zone mit katodaler Beweglichkeit. Es agglutiniert menschliche Leukozyten in Konzentrationen von nur 2 bis 3 mg/ml (beatimmt nach der Killman-Methode, modifiziert von Weber et al, S.A. Killman (1960) Leukocyte Agglutinins, Blackwell Scientific Publications Oxford, Weber et al (1967) Scand.J.Hematoi. 4_f 77). Eine Erythrozyten-agglutinierende Aktivität wurde bei kristallinem Leukoagglutinin in Konzentrationen von bis zu 3 mg/ml unter Anwendung der Methode von SaIk (J.E. SaIk (1944) J.Immunol. 49t 87) nicht festgestellt. Das

2 0 3885/134b

Leukoagglutinin verursacht eine maximale Inkorporation von 125 I/üridin durch. Lymphozyten in einer Konzentration von 2,8 mg/ml. Die Stimulierung beginnt "bei einer Konzentration von 0,087 mg/ml und endet bei einer Konzentration von 180 mg/ml.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, das sich für die industriel· Ie Erzeugung eines reinen kristallinen Präparats von Leukoagglutinin aus Extrakten von Ptaseolus vulgaris* eignet« Das Verfahren sieht die Reinigung disircn. Ausfällung und Dialyse, Adsorption, Eluierung und erneute Ausfällung des Proteins vor. Das erfindungsgemässe Verfahren besteht darin, eine Lösung des gereinigten Proteinmaterials bei einem schwach sauren pH mit einem chromatographiscb-en Material zur Abtrennung von Leukoagglutinin von anderen Proteinen durch Verrühren zu vermischen und anschliessend das ehromatographische Material abzutrennen und gegebenenfalls au waschen, worauf das Leukoagglutinin mit einem Puffer mit einem schwach sauren pH eluiert wird. Dann wird das eluierte Protein gesammelt, worauf das Leukoagglutinin ausgefällt wird«, Anschliessend wird die Salzkonzentration in dem Leukoagglutinin-Uiederschlag solange vermindert, bis das Leukoagglutinin kristallisiert, worauf die Leukoagglutinin-Kristalle gesammelt werden.

Eine geeignete Menge des chromatographischen Materials liegt bei ungefähr 1 g pro Gramm Protein. Ein chromatographisches Material, das sich, für das erfindungsgemässe Verfahren eignet, wird von der Pharmacia AB, Schweden unter dem Warenzeichen "SP-Sephadex C 50^M verkauft. Vorzugsweise wird destilliertes Wasser für die Dialyse des Leukoagglutinin-Niederschlags verwendet.

Vor der Zugabe des chromatographischen Materials wird die Proteinlösung vorzugsweise solange dialysiert, bis ein Gleichgewichtszustand erreicht worden ist, und zwar gegen eine

209885/134b

Pufferlösung mit einem pH von ungefähr 5, beispielsweise einem 1/15 m-Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 4,9.

Die Eluierung des Leukoagglutinins von dem chromatographiechen Material kann unter Verwendung eines 1/15 m-Natriumphosphatpuffers mit einem pH von 5,6 - 6,0 durchgeführt werden.

Bas folgende Beispiel erläutert die Erfindung. Beispiel

1. Extraktion

1 kg feinrermahlene Phaseolus vulgaris-Bohnen werden hei 4⁰C Über Nacht unter Verwendung von 4 1 einer Lösung extrahiert, die 0,9 £ig an NaCl und 0,1 η an HCl ist. Sie Aufschlämmung wird durch ein Gazetuch filtriert. Die Extrakt wird unter Verwendung Ton 1,5 i der gleichen Lösung wiederholt, worauf die Extrakte vereinigt und während 10 Hinuten hei 7000 χ g zentrifugiert werden.

2. Ausfällung

Der überstehenden Flüssigkeit wird die Hälfte ihres Volumens an 94 tigern (Gewicht/Gewicht) Äthanol sugesetzt, wobei die Temperatur zwischen -5 und + 5°C gehalten wird. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren hei 7000 χ g in der Kälte während 10 Minuten gesammelt, und anschliessend gegen Leitungswasser während einer Zeltspanne von drei Tagen dlalyeiert.

3. Adsorption an Diäthylaminoäthyl-(DÄAÄ)-Zellulose und Eluierung

Bas Volumen des dialysierten Niederschlags wird auf ungefähr

1 1 durch Zugabe von 0,05 m tris-(Hydroxymethyl)-rtiinomethan- j

HCl (tris)-Puffer mit einem pH von 8,0 eingestellt, worauf der '

pH unter Verwendung von 2 m-tris auf 8,0 einreguliert wird. Die J;

209885/13^b i

Hauptmenge der DÄAÄ-Zellulose (DE-52, Whatman), aus welcher die Hauptmenge des Puffers durch Filtration auf einem Büchner-Trichter entfernt worden ist, wird in einer Menge von 10 g/1 g Proteinmaterial zugesetzt. Zuvor wird die DÄAÄ-Zellulose mit 0,05 m-tris-Puffer mit einem pH von 8,0 geeicht. Die Mischung wird während einer Zeitspanne von wenigstens einer Stunde gerührt und zentrifugiert, worauf die Zellulose dreimal unter Verwendung des gleichen Volumens an 0,05 m-tris-Puffer mit einem pH von 8,0 gewaschen wird. Die gewaschene Zellulose wird in einer kleinen Menge des gleichen Puffers suspendiert. Der gleiche 1 m-Puffer "bezüglich NaCl wird der Suspension in solchen Mengen zugesetzt, dass ihre NaCl-Konzentration 70 niM beträgt. Die Suspension wird während einer Zeitspanne von wenigstens 1 Stunde gerührt. Die Zellulose wird durch Zentrifugieren abgetrennt und zweimal unt^r Verwendung von 70 mM UaCl/ 0,05 m-tris-Puffer mit einem pH von 8,0 gewaschen. Alle Eluate werden vereinigt, worauf Ammoniumsulfat in einer Menge von 65 g/100 ml zugesetzt wird. Nach einer Wartezeit von wenigstens 1 Stunde wird der Niederschlag durch Zentrifugieren bei 7000 χ g während einer Zeitspanne von 20 Minuten gesammelt. Der Niederschlag wird in gepufferter NaCl-Iösung gelöst (0,9 # NaCl in 10 mM-Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 7,4).

4. Adsorption an Sephadex und Eluierung

Der gelöste Ammoniumsulfat-Niederschlag wird gegen 1/15 m-Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 4,9 solange dialysiert, bis das ionische Gleichgewicht erreicht ist, worauf zentrifugiert wird. Der überstehenden !Flüssigkeit wird Sulfopropyl-"Sephadex" (SP-Sephadex C 50, Pharmacia AB), geeiöht mit dem gleichen Puffer, in einer Menge von 1 g/g Protein zugesetzt. Die Mischung wird während einer Zeitspanne tos wenigstens 1 Stunde gerührt und dracoh einen Büchner~fricht@r filtriert, worauf die Hauptmenge des Sephadex zweimal mit 1/15 m-Iatrium-

209885/13 4 5

•»Ο "~

phoBphatpuffer mit einem pH von 4,9 gewaschen wird. Bas Sephadex-Material wird in Form einer Säule mit einem Durchmesser von 25 mm gepackt. Gegebenenfalls wird es mit dem gleichen Puffer solange gewaschen, bis die Extinktion bei 280 nm des Eluats unterhalb 0,05 liegt. Bas Leukoagglutinin wird aus der. Säule unter Verwendung von 1/15 m-Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 5,6 - 6,0 eluiert. Bie Proteinmenge wird gesammelt, worauf 65 g/100 ml Ammoniumsulfat zur Ausfällung des Proteins zugesetzt werden.

5. Kristallisation

Bor mit Ammoniumsulfat erhaltene Niederschlag wird gegen destilliertes Wasser dialysiert. Zu Beginn löst sich der Niederschlag auf. Nachdem die Ionenstärke in ausreichendem Maße vermindert worden ist, tritt eine Kristallisation auf. Bie Ausbeute an kristallinem Leukoagglutinin schwankt zwischen 100 und 300 mg.

209885/ 134b

Claims (5)

1. - 7 Patentansprüche

   ν i) Verfahren zur Herstellung von reinem kristallinem Leukoagglutinin aus Extrakten von Phaseolus vulgaris, bei dessen Durchführung der Extrakt durch Ausfällen, Dialyse, Adsorption, Eluierung und erneute Ausfällung des Proteinmaterials gereinigt wird, dadurch gekennzeichnet, dass eine Lösung des gereinigten Proteinmaterials unter Rühren bei einem schwach sauren pH-Wert mit einem chromatographischen Material zur Abtrennung von Leukoagglutinin von anderen Substanzen vermischt wird, das chromatographische Material von der Lösung abgetrennt und gegebenenfalls gewaschen wird, das Leukoagglutinin aus dem ohromatographlsch.en Material unter Verwendung einer Pufferlösung mit einem schwach, sauren pH-Wert elulert wird, das eluierte Protein gesammelt wird, und das Leukoagglutinin ausgefällt wird, worauf die Ionenstärke des Niederschlags solange reduziert wird, bis sich, das Leukoagglutinin auskristallisiert, worauf die Leukoagglutinin-Kristalle gesammelt werden,
2. 2. Verfahren nach. Anspruch. 1, dadurch, gekennzeichnet, dass die Ionenstärke des Leukoagglutinin-Niedersehlags durch. Dialyse gegen destilliertes Wasser vermindert wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass chromatographisches Material in Mengen von ungefähr 1 g/g des Proteinmaterials zugesetzt wird.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung des gereinigten Proteinmaterials vor ihrer Behandlung mit dem chromatographischen Material gegen eine Pufferlösung mit einem pH von ungefähr 5 dialysiert. wird.
5. 5. Verfahren nach, einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Leukoagglutinin aus dem Chromatographiechen Material unter Verwendung eines Phosphatpuffers mit einem pH von 5,6 bis 6,0 eluiert wird. 209885/13 45