DE2228668B2

DE2228668B2 - Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung eines in einer Fluidprobe enthaltenen Bestandteils

Info

Publication number: DE2228668B2
Application number: DE2228668A
Authority: DE
Inventors: Bernard Yorktown Heights N.Y. Lichtenstein (V.St.A.)
Original assignee: Technicon Instruments Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1971-06-16
Filing date: 1972-06-13
Publication date: 1974-10-24
Also published as: NL170186C; CA944584A; SE374207C; BE784209A; AU4249772A; US3679312A; NL7206774A; CH544938A; SE374207B; DE2228668A1; DE2228668C3; IT955640B; JPS5511218B1; GB1363325A; FR2142353A5; NL170186B; AU455702B2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung eines in einer Fluidprobe enthaltenen Bestandteils durch Messen der Stärke der Lumineszenz, die bei der Reaktion der Probe mit einer anderen Substanz auftritt, mit einem Fotometer zum Nachweisen der Lumineszenz, mit einem Leitungsverbindungsstück zum Zusammenführen und Mischen eines Probenstroms mit einem Reagenzstrom und mit einer an den Auslaß des Leitungsverbindungsstücks angeschlossenen Fluidleitung mit einem vor dem Fenster des Fotometers angeordneten gekrümmt verlaufenden, durchsichtigen Leitungsabschnitt.

Unter Biolumineszenz und Chemolumineszenz versteht man die Emission von Licht, wenn verschiedenartige biochemische oder chemische Substanzen bei einer Temperatur zur Reaktion gebracht werden, die unterhalb der Glühtemperatur liegt. Derartige Lumineszenzvorgänge sind beispielsweise Gegenstand eines Aufsatzes von W. D. McElroy, H. H. Seliger und E. H. White mit dem Titel »Mechanism of Bioluminescence, Chemiluminescence, and Enzyme Function in the Oxidation of Firefly Luciferin«, Photochem. Photobiol. X, 153 bis 170, 1969.

Bei der Lumineszenz handelt es sich also beispiels

weise um die Emission von kaltem Licht, wie es bei der Feuerfliege, dem Glühwürmchen und verschiedenen Bakterienarten der Fall ist. Bei der Feuerfliege reagieren das Enzym Luciferase und das Substrat Lu-

eiferin mit Adenosin-Triphosphat, was im allgemeinen unter der Bezeichnung ATP bekannt ist, um im Schwanz der Feuerfliege einen Lichtblitz auszusenden.

Diese Vorgänge werden in zunehmendem Maße

ίο zum Durchführen von Analysen angewendet. Ferner benutzt man dieses Verfahren zum Nachweis von bestimmten chemischen Mitteln in der chemischen Kriegführung. Alle bekannten lebenden Organismen enthalten ATP. Raumsonden, die zum Nachweis von

»5 Leben dienen, verwenden ATP. Bei antibiotischen Resistenzprüfungen von lebenden Bakterien mit ATP hat man die Biolumineszenz mit einem Fotometer gemessen. Bei der Analyse reiner Kulturen von zahlreichen Bakterienarten hat es sich gezeigt, daß die Kon- zentration des zellulären ATP mit der Anzahl der in der Zelle vorhandenen Bakterien in Beziehung gesetzt werden kann. Diese Forschungsergebnisse, die durchgeführt wurden, um dem Arzt die Möglichkeit zu geben, Infektionskrankheiten mit spezifischen Antibio-

s5 tika zu bekämpfen, sind allgemein bekannt und beispielsweise in einem Aufsatz von E.W.Chapelle und G. V. L e ν i η mit dem Titel »The Use of the Firefly Bioluminescent Assay for the Rapid Detection and Counting of Bacteria«, in Biochem. Med. II, 41 bis 52, 1968, beschrieben.

Obwohl man versucht hat, antibiotische Empfindlichkeitsanalysen mit ATP unter Verwendung eines Biolumineszenzdetektors und von Meßeinrichtungen zu automatisieren, haben diese Versuche keine Iei stungsfähigen Anordnungen hervorgebracht, die das allgemein bekannte und weithin benutzte Prinzip der kontinuierlichen Durchflußanalyse nach der USA.-Patentschrift 2792 149 und nach der USA.-Patentschrift 3 241 432 benutzen. In diesem Zusammenhang wird auf einen Aufsatz von K. V a η D y k e et al, »An Automated Procedure for the Sensitive and Specific Determination of ATP«, Clinical Chemistry, Band 15, 1969, Heft 1, Seiten 3 bis 14, verwiesen, aus dem die eingangs beschriebene Vorrichtung bekannt ist. Um eine möglichst große Menge der bei der Reaktion der Probe mit dem Reagenz auftretenden Lumineszenz nachzuweisen und zu messen, ist es bei dieser Vorrichtungbekannt, den vor einem zylindrischen Fenster des Fotometers angeordneten durchsichtigen Leitungsab schnitt der das Proben-Reagenz-Gemisch führenden Fluidleitung als kleine schraubenförmige Mischschlange auszubilden, also dem durchsichtigen Leitungsabschnitt einen gekrümmten Verlauf zu geben, damit die von dem Fotometer erfaßte Länge des Lei tungsabschnitts möglichst groß ist. Diese bekannte Anordnung mit dem zylindrischen Fotometerfenster und der davor angeordneten schraubenförmigen Mischschlange ist jedoch für eine genaue wiederholbare Messung der bei der Reaktion auftretenden ge- samten Lichtmenge nicht geeignet, da sich einige Teile der Mischschlange in bezug auf das Fotometer selbst abdecken oder durch eine zwischen dem Fotometer und der Mischschlange vorgesehene Gehäusewand abgedeckt sind und da infolge der schraubenlinienför migen dreidimensionalen Ausbildung die einzelnen Teile eier Mischschlange verschieden große Abstände von dem Fotometerfenster haben. Abgesehen von der mangelnden Genauigkeit ist auch die Empfindlichkeit

inten

der bekannten Vorrichtung zu gering.

In diesem Zusammenhang sei erwähnt, daß es sich bei dem Nachweis und der Messung der Lumineszenz tatsächlich um einen Integrationsvorg,ang handelt. Die XU messenden Lichtimpulse treten nämlich während des Durchflusses des Proben-Reagenz-Stroms durch die an das Leitungsverbindungsstück angeschlossene Fluidleitung zu willkürlichen Zeitpunkten auf, und 2VKU-gerade dann, wenn Luciferase und Luciferin mit ATP reaperen. Andere bekannte Analyseverfahren, bei denen zum Nachweis von ATP die auftretende Biolumineszenz gemessen wird, zeichnen sich daher dadurch aus, daß die Probe mit dem ATP in eine Küvette oder in ein Reagenzglas gegeben wird, das ein Luciferin-Luciferase-Gemisch enthält. Die zusam- t* mengegebeneii Stoffe werden so schnell und so gut wie möglich miteinander vermischt. Dabei entsteht ein Lichtblitz, dessen Spitzenwert der vorhandenen ATP-Menge proportional ist. Derjenige Teil der Lichtemission, der nach dem Spitzenwert auf einen ao niedrigen Pegel absinkt und danach langsam über eine Periode von mehreren Sekunden abfällt, ist ebenfalls der ATP-Menge proportional. Mit diesen bekannten Analyseverfahreii kann man zwar eine höhere Genauigkeit und Empfindlichkeit erzielen, jedoch nutzen »5 diese Verfahren nicht die Vorteile aus, die eine kontinuierliche Durchflußanalyse bietet.

Bei Anwendung des kontinuierlichen Durchflußprinzips kann man nämlich einen aus aufeinanderfolgenden Proben bestehenden Probenstrom erzeugen und die einzelnen Proben des Stroms aufeinanderfolgend fotometrisch oder auf eine andere Weise analysieren, nachdem sie zur Analyse automatisch vorbehandelt wurden. Bei den Proben kann es sich um Gase oder um Flüssigkeiten handeln. Flüssige Proben können durch inerte Fluide voneinander getrennt sein, beispielsweise durch Gasschübe, die die Wandung der Fluidtransportleitungen reinigen und auf diese Weise eine Verseuchung der nachfolgenden Probe durch die vorangegangene verhindern. Zusätzlich zu den inerten Fluidschüben oder an Stelle von diesen kann man die einzelnen Proben durch Waschflüssigkeitsschübe voneinander trennen. Es ist allerdings nicht immer erforderlich, die einzelnen Proben in dem Probenstrom durch Trennfluide voneinander zu Hennen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die eingangs beschriebene Vorrichtung unter Beibehaltung des kontinuierlichen Durchflußprinzips derart weiter zu entwickeln, daß die aufeinanderfolgenden Proben mit einer höheren Empfindlichkeit und Genauigkeit analysiert werden können. Die zu schaffende Vorrichtung soll insbesondere für antibiotische Suszeptibilitätsuntersuchungen, aber auch zur Durchführung von anderen Analysearten eingesetzt werden.

Zur Lösung dieser Aufgabe ist die eingangs beschriebene Vorrichtung nach der Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß das Lichteinfallfenster des Fotometers eben ausgebildet ist, daß die Krümmung des durchsichtigen Leitungsabschnitts in einer zu dem ebenen Fenster parallelen Ebene verläuft und daß der eben gekrümmte Leitungsabschnitt flach an dem Fensteranliegt und dieses praktisch vollkommen abdeckt.

Auf diese Weise ist es trotz eines einfachen Aufbaus möglich, praktisch die gesamte, bei einer Reaktion auftretende Lichtmenge zu erfassen und auszuwerten, so daß die gewonnenen Analysenergebnisse sehr genau und wiederholbar sind. Ferner zeichnet sich die nach der Erfindung ausgebildete Vorrichtung durch eine hohe Empfindlichkeit aus.

Um eine gute Durchmischung der Probe mit dem Reagenz zu erzielen, ist der gekrümmte Leitungsabschnitt vorzugsweise als flache Spirale ausgebildet. Die Mischwirkung kann dadurch gesteigert werden, daß die mit dem Reagenz zusammengeführte Probe in der flachen Spirale von innen nach außen strömt, der Fluidejnlaß der Fluidleitung also im mittleren Bereich der flachen Spirale angeordnet ist.

Damit der Abstand zwischen den einzelnen spiralförmigen Windungen des Leitungsabschnitts möglichstgering ist, ist es zweckmäßig, die Spirale in einem durchsichtigen Block auszubilden, so daß die dünnen Zwischenwände geschützt sind.

Ausführungsbeispiele der Erfindung werden an Hand von Figuren beschrieben. Es zeigt

Fig. 1 eine teilweise Seitenansicht einer nach der Erfindung ausgebildeten Vorrichtung,

Fig. 2 eine Ansicht in Richtung der in der Fig. 1 dargestellten Pfeile 2-2, und

Fig. 3 eine perspektivische Ansicht eines abgewandelten Bauteils der Vorrichtung.

Bei der in der F i g. 2 dargestellten Analysiervorrichtung dient eine Leitung 10 zur Probenzufuhr und eine Leitung 12 zar Reagenzzufuhr. Diese Leitungen sind an die Einlafkttfnungen eines Leitungsverbindungsstücks 14 angeschlossen. Das eine Ende einer Leitung 16 ist mit der Auslaßöffnung des Leitungsverbindungsstücks 14 verbunden. Das andere Ende der Leitung 16 ist mit dem Fluideinlaß 17 einer aus Glas hergestellten Leitung verbunden, deren Hauptteil ein gekrümmter Leitungsabschnitt 18 ist. Ein sich an den gekrümmten Leitungsabschnitt 18 anschließender Auslaßabschnitt 20 kann zu einem Abfluß oder zu einem Speichergefäß führen. Bei dem besonderen, in der Fig. 2 dargestellten Ausführungsbeispiel besteht der gekrümmte Leituugsabschnitt 18 aus Leitungswindungen in Form einer flachen Spirale. Bei der in der Fig. 2 gezeigten Ausführungsform führt der Fluideinlaß 17 zum Mittelpunkt der flachen Spirale 18, während der Auslaßabschnitt 20 mit einer Außenwindung verbunden ist. Der Einlaß- und der Auslaßabschnitt können auch vertauscht sein, so daß sich der Auslaß im Mittelpunkt der Spirale und der Einlaß am Außenumfang der Spirale befindet.

Wie es aus der Fig. 1 hervorgeht, bildet der gekrümmte Leitungsabschnitt 18 eine flache Spirale in Form eines Körpers, der sich in einer parallelen Ebene an das ebene Lichteinfallfenster eines Fotometers 21 anschmiegt. Das Fotometer 21 ist über ein Kabel 22 an eine Aufzeichnungseinrichtung 24 angeschlossen, bei der es sich um einen herkömmlichen Streifenblattschreiber handeln kann, dessen Schreibstift mit einem vorschiebbaren Streifenblatt zusammenarbeitet, um die Analysenergebnisse aufzuzeichnen

Wie es die Fig. 1 zeigt, ist der den gekrümmten Leitungsabschnitt 18 darstellende flache Körper über ein optisches Medium 26, beispielsweise ein optisches Fett oder Immersionsöl, mit dem Stirnfenster der Fotoelektronenvervielfacherröhre gekoppelt, um in dem Bereich zwischen dem den gekrümmten Leitungsabschnitt 18 darstellenden Körper und dem Stirnfenster die durch mögliche Lichtbrechung hervorgerufenen Schwierigkeiten zu beseitigen.

Die Lumineszenzreaktion findet in dem gekrümmten Leitungsabschnitt 18 statt, unabhängig davon, ob es sich um Biolumineszenz oder Chemolumineszenz handelt. Dort wird sowohl der Anfangs- oder Spitzen-

teil der Reaktion nachgewiesen und gemessen als auch das Ende des Reaktionsablaufes. Um dem Fotometer möglichst viel des durch die Reaktion erzeugten Lichtes zuzuführen, kann man parallel und angrenzend an den gekrümmten Leitungsabschnitt 18 einen Spiegel 28 anordnen, dessen Reflexionsoberfläche dem gewundenen Durchgang und dem Stirnfenster der Fotoelektronenvervielfacherröhre gegenüberliegt. Der Spiegel 28 ist jedoch nicht unbedingt erforderlich. Obwohl ein Teil des Lichtes in dem gekrümmten Leitungsabschnitt 18 reflektiert wird, tritt infolge der Konstruktion des gekrümmten Leitungsabschnitts 18 und infolge der Lage in bezug auf das Stirnfenster der Fotoelektronenvervielfacherröhre nahezu die gesamte Lichtenergie in das Stimfenster ein. Der den gekrümmten Leitungsabschnitt 18 darstellende flache Körper deckt praktisch das Stimfenster der Fotoelektronenvervielfacherröhre ab und hat etwa die gleiche Größe wie das Fenster.

Obwohl bei der Darstellung nach der Fig. 2 der Zusammenfluß des Probenstromes und des Reagenzstroms in dem Leitungsverbindungsstück 14 der besseren Übersicht halber in einem gewissen Abstand von dem gekrümmten Leitungsabschnitt 18 vorgenommen wird, ist es in der Praxis erwünscht, daß der Zusammenfluß dieser beiden Ströme so dicht wie möglich bei dem gekrümmten Leitungsabschnitt 18 erfolgt. Der Zusammenfluß kann sogar innerhalb des gekrümmten Leitungsabschnitts 18 vorgenommen wer den. Dadurch wird sichergestellt, daß die gesamte Lumineszenzreaktion innerhalb des gekrümmten Leitungsabschnitts 18 stattfindet.

In der Fi g. 3 ist ein Körper gezeigt, der eine abge-

S wandelte Form des beschriebenen gekrümmten Leitungsabschnitts 18 darstellt. Die Fig. 3 zeigt einen Block 30 aus Glas, der gegossen sein kann und der einen spiralförmigen Leitungsabschnitt 32 enthält. Der Abschnitt 32 weist einen Einlaß- und einen Aus laß auf, die dem beschriebenen Fluideinlaß 17 und Auslaßabschnitt 20 ähnlich sind. Zur Herstellung des Blocks 30 wird ein gewundenes Metallrohr mit einem Glasblock von passenden Abmessungen umgössen, wobei die Enden des Metallrohres aus dem Block her ausrager.. Danach kann man durch das Metallrohr ein Ätzmittel leiten, das das Metallrohr wegätzt. Auf diese Weise ist es möglich, den spiralförmigen Leitungsabschnitt in einem Glasblock auszubilden und die Glaswände zwischen den einzelnen Spiralen sehr dünn zu

ao machen.

Es wurde bereits erwähnt, daß man bei der spiralförmigen Ausbildung des gekrümmten Leitungsabschnitts 18 den Fluideinlaß 17 mit dem Auslaßabschnitt 20 vertauschen kann. Die dargestellte

as Anordnung, bei der der Fluideinlaß 17 zum Mittelpunkt der Spirale geführt ist, wird vorgezogen, weil herkömmlich aufgebaute Fotometer in der Mitte des Lichteinlaßfensters auftretendes Licht am besten nachweisen und messen können.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung eines in einer Fluidprobe enthaltenen Bestandteils durch Messen der Stärke der Lumineszenz, die bei der Reaktion der Probe mit einer anderen Substanz auftritt, mit einem Fotometer zum Nachweisen der Lumineszenz, mit einem Leitungsverbindungsstück zum Zusammenführen und Mischen eines Probenstroms mit einem Reagenzstrom und mit einer an den Auslaß des Leitungsverbindungsstücks angeschlossenen Fluidleitungmit einem vor dem Fenster des Fotometers angeordneten gekrümmt verlaufenden, durchsichtigen Leitungsabschnitt, dadurch gekennzeichnet, daß das Lichteinfallfenster des Fotometers (21) eben ausgebildet ist, daß die Krümmung des durchsichtigen Leitungsabschnitts (18) in einer zu dem ebenen Fenster parallelen Ebene verläuft und daß der eben gekrümmte Leitungsabschnitt flach an dem Fenster anliegt und dieses praktisch vollkommen abdeckt.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der gekrümmte Leitungsabschnitt (18) als flache Spirale ausgebildet ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluideinlaß (17) der Fluidleitung im mittleren Bereich der flachen Spirale angeordnet ist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der spiralförmige Leitungsabschnitt (18) aus einem Schlauch besteht, dessen Windungen dicht nebeneinanderliegen.

5. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der spiralförmige Leitungsabschnitt (32) in einem Block (30) ausgebildet ist, in dem die Windungen der Spirale dicht nebeneinanderliegen.