CH654108A5

CH654108A5 - Verfahren und vorrichtung zur pruefung von biologischen wirkungen bei zellkollektiven.

Info

Publication number: CH654108A5
Application number: CH6481/81A
Authority: CH
Inventors: Wolfgang Prof Dr Mehlhardt; Fritz-Albert Dr Rer Nat Popp; Martin Rattemeyer; Hans-Guenther Schmidt
Original assignee: Wolfgang Prof Dr Mehlhardt; Fritz Albert Popp Dr Rer Nat; Martin Rattemeyer; Schmidt Hans Guenther
Priority date: 1980-10-10
Filing date: 1981-10-09
Publication date: 1986-01-31
Also published as: CA1174074A; GB2086038A; US4458531A; GB2086038B; FR2497233A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Prüfung von biologischen Wirkungen bei Zellkollektiven, welche eine eigene oder stimulierbare ultraschwache Photonenstrahlung abgeben.

Die bisher bekannten Verfahren zur Prüfung der biologischen Wirkungen von physikalischen oder chemischen Agenzien beruhen entweder darauf, dass Zellkollektive in einem in vitro Test, d.h. als Zellkultur, oder in natürlich vorkommenden Organismen, z.B. in Pflanzen oder Versuchstieren im in vivo Test unter definierten Bedingungen dem zu prüfenden Agens ausgesetzt werden. Unter Berücksichtigung der statistischen Verteilung werden Dosis-Effekt-Kurven ermittelt, die die Abhängigkeit zwischen der Dosis des verabreichten Agens und dem zu untersuchenden Parameter des Objekts, wie beispielsweise der Mutationsrate, aufzeigen. Aufgrund der statistisch bewerteten Messergebnisse lassen sich Schlüsse hinsichtlich zellschädigender oder zellregenerierender Wirkungen bestimmter Agenzien, wie Strahlung, chemische Stoffe und dergleichen, ziehen.

Die Durchführung derartiger Tests erfordert wegen der grossen biologischen Streuungsbreite einen erheblichen Aufwand. Die Zulässigkeit der Anwendung dieser Testuntersuchungen ist dabei von Fall zu Fall unterschiedlich theoretisch fundiert und gerechtfertigt.

Ein Verfahren zur Prüfung biologischer Wirkungen bei Zellkollektiven liegt auch bei der Untersuchung entsprechender Nahrungsmittel mit Zellaufbau vor. Eine bekannte Methode der Nahrungsmittelprüfung beruht darauf, Nahrungsmittel mit blauem bzw. ultraviolettem Licht zu bestrahlen und das reflektierte Streulicht hinsichtlich seines Farbcharakters zu beurteilen. Aus der DE-OS 2 728 717 ist es bekannt, Qualitätsmerkmale eines Prüfobjektes der Fleischwarenkategorie durch die Untersuchung der vom Objekt ausgehenden emittierten oder reflektierten Strahlung, vorzugsweise im sichtbaren oder unsichtbaren Bereich des Lichtes, zu bestimmen, wobei die Wellenlänge und/oder die Intensität und/oder die Polarisation ausgewertet werden. Damit lassen sich jedoch keine hinreichend genauen Bestimmungen von Qualitätsmerkmalen, z.B. des Frischzustandes, durchführen.

Die DD-PS 117 743 beschreibt ein Verfahren, um Beschädigungen landwirtschaftlicher Produkte, beispielsweise bei Kartoffeln, mit Hilfe von Fluoreszenz dadurch zu messen, dass das Messobjekt mit einem chemischen Stoff behandelt wird, der an den Schadstellen eine Verbindung eingeht, die eine fluoreszierende Bewirkung besitzt und die bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht sichtbares Fluoreszenzlicht ausstrahlt.

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Die Erfindung geht von der Aufgabenstellung aus, ein Verfahren zur Prüfung von biologischen Wirkungen bei Zellkollektiven anzugeben, welches eine spezifische, hochempfindliche Prüfung des biologischen Zustandes der Zellkollektive ermöglicht.

Zur Lösung dieser Aufgabenstellung ist vorgesehen, dass zur in vitro Prüfung von Substanzen auf mögliche zellschädigende bzw. regenerierende Wirkungen oder zur Qualitätskontrolle von biologischen Substanzen, wie biologische Lebensmittel (Fleisch, Früchte u.a.), Nutzpflanzen (einschliesslich Heilpflanzen) oder Saat- bzw. Steckgut, als Prüf-grösse die Intensität und/oder die Photonenstatistik der ultraschwachen Photonenemission gemessen wird.

Der Begriff «ultraschwache Photonenemission», wie er hier verwendet wird, bedeutet eine Wellenstrahlung, deren Energie mindestens um den Faktor 10"10 kleiner ist als die Wärmestrahlung im Infrarotbereich. Die ultraschwache Photonenemission ist als kohärente Eigenstrahlung der Objekte von der inkohärenten Wärmestrahlung u.a. dadurch zu unterscheiden, dass die Intensität und Wellenlängenabhängigkeiten nicht dem Planck'schen Strahlungsgesetz folgen. Temperaturdifferenzen können zur Messung der ultraschwachen Photonenemission nicht benutzt werden. Hierzu müssen Kohärenzmasse der Photonenstatistik und/oder die Intensität der Strahlung bestimmt werden.

Aus der Veröffentlichung «Elektromagnetic Bio-Information von F.A. Popp, G. Becker, H.L. König, W. Peschka,

Edts. Urban & Schwarzenberg, München-Baltimore 1979 ist es bekannt, dass biologische Systeme, insbesondere lebende Zellen, eine ultraschwache Photonenstrahlung emittieren, die von verschiedenen Umgebungseinflüssen abhängt. Das Vorhandensein einer solchen ultraschwachen Photonenemission wird bei dem vorliegenden Verfahren vorausgesetzt, welches sowohl die Wirkung von Agenzien aus ihrem Einfluss auf die Photonenemission biologischer Systeme ableitet und mit den Verhalten ungestörter bzw. absterbender Systeme vergleicht, als auch die Qualitätskontrolle von Lebensmitteln ermöglicht.

Im Prinzip können diese Untersuchungen mit jeder Form eines Zellkollektivs, insbesondere mit einer Zellkultur, aber auch mit einer Testpflanze oder mit einem Versuchstier ausgeführt werden. Da die Intensität der ultraschwachen Photonenstrahlung und/oder die Photonenstatistik durch den Einfluss der Prüfsubstanzen charakteristisch verändert wird, lassen sich aus den Messungen vor und während der Einwirkung der Prüfsubstanz u.U. wertvolle Schlüsse auf den Wirkungsmechanismus und die generelle Wirksamkeit der Agenzien ziehen. Anstelle der bisher üblichen Dosis-Effekt-Kurven treten Diagramme, in denen gegebenenfalls vorteilhaft der spektral unterteilte zeitliche Intensitätsverlauf der emittierten Strahlung, sowie charakteristische Parameter der Photonenstatistik wie z.B. faktorielle Momente, Kumulanten etc. in Abhängigkeit von der Dosis der verabreichten Substanz bzw. der Stärke des applizierten physikalischen Agens, z.B. einer Wärmestrahlung, dargestellt werden. Die so erhaltenen Diagramme werden nach Intensität und nach den verschiedenen möglichen Kohärenzmassen der Photonenstatistik (vgl. R.J. Glauber, Quantum Optics, Academic Press NY London, 1969) ausgewertet.

Das Verfahren kann gegebenenfalls zweckmässig modifiziert werden durch definierten Einsatz weiterer äusserer Einwirkungen, vorzugsweise zusätzlicher magnetischer und/ oder elektrischer Gleich- oder Wechselfelder (Wellenstrahlung), bzw. einer Lichtstrahlung von definierter Wellenlänge, welche auf das Zellkollektiv einwirkt.

Bei der Qualitätskontrolle von biologischen Substanzen kann beispielsweise die Qualität von biologischen Säften oder die Keimfähigkeit von Saatgut nach dem Alterungszustand beurteilt werden, wenn entsprechende Vergleichswerte zuvor, beispielsweise durch geschmackliche Prüfung und/ oder chemische Analyse, bzw. durch Aussaatversuche, aus einer im wesentlichen gleichartig zusammengesetzten Probe s bestimmt wurden. Besonders der Frischezustand von Nahrungsmitteln, der im wesentlichen auf gesunden Zellkollektiven beruht, lässt sich durch Beurteilung der Eigenstrahlung messtechnisch verfolgen. Ausserdem kann der Gehalt von biologisch schädlichen Fremdstoffen beispielsweise von io Giften, wie Spritzmittel bei Fleisch und Pflanzen, als Rückstand nachgewiesen werden.

Bei biologischen Proben ohne ausgeprägte Eigenstrahlung kann es gegebenenfalls zweckmässig sein, die Probe vor und/ oder während der Messung zur Photonenemission durch ein 15 magnetisches und/oder elektrisches Gleich- oder Wechselfeld zu stimulieren. Eine solche zweckmässige Stimulation lässt sich gegebenenfalls auch durch eine Lichtstrahlung von definierter Wellenlänge beispielsweise von 5000 nm, bzw. durch erhöhte oder niedrige Temperaturen, herbeiführen. 2» Eine andere gegebenenfalls vorteilhafte Möglichkeit zur Stimulation einer keine hinreichende Eigenstrahlung aufweisende Probe kann mit der definierten Anregung mit Hilfe chemischer Zusatzstoffe, z.B. mit Zellgiften, erreicht werden. Als möglicher Zusatzstoff erscheint beispielsweise Äthanol 25 günstig. Die stimulierte Eigenstrahlung zeigt, wie die natürliche Eigenstrahlung, ebenfalls eine von den biologischen Voraussetzungen abhängige Intensität und/oder Photonenstatistik.

Eine vorteilhafte Vorrichtung zur Durchführung des Ver-30 fahrens kann so aufgebaut sein, dass in definierter Anordnung gegenüber einer Probe, d.h. in bestimmtem Abstand von der Probe, die gegebenenfalls in einer für die Photonenstrahlung durchlässigen Küvette untergebracht sein kann, ein Photonensensor für ultraschwache Photonenstrahlung vorge-35 sehen ist, v/elcher eine wesentliche Nachweisempfindlichkeit in dem zu untersuchenden Wellenlängenbereich zwischen 10 000 nm und 200 nm aufweist. Die Ausgangsgrösse des Sensors wird durch einen Messverstärker verstärkt, der mit einem schreibenden und/oder anzeigenden Messgerät in Ver-40 bindung steht. Im einzelnen haben sich Sensoren mit Photokathoden aus Alkalimetallen und aus mehreren Elementen zusamengesetzte Stoffe, wie Na, K, Cs, Sb, als geeignete Substanzen erwiesen. Bei dem Messverstärker wird zweckmässig eine an sich bekannte Ausführung in Form eines Photomulti-45 pliers mit einem Verstärkungsfaktor V >106 verwendet.

In der Zeichnung sind Ausführungsbeispiele der Erfindung schematisch dargestellt; es zeigen:

Fig. 1 den Verlauf der Photonenemission bei Gurken-5» keimen,

Fig. 2 den Verlauf der Photonenemission bei zwei Proben von Rübensäften verschiedener Qualität,

Fig. 3 eine Messanordnung.

55 Im oberen Teil von Fig. 1 ist der Verlauf der Photonenemission von Gurkenkeimen als Photonenzählrate PCR dargestellt, die zu dem angegebenen Zeitpunkt A mit dem Zellgift Heparin behandelt wurden. Unmittelbar nach Zugabe von Heparin nimmt die Strahlenemission zunächst ab, um 60 dann nach mehreren Stunden mit immer deutlicher werdenden Fluktuationen anzusteigen, bis nach etwa elf Stunden ein maximaler Anstieg erreicht wird, der durch stetigen Abfall bis auf Null den Tod des Zellkollektivs ankündigt.

Wie Fig. 1 in ihrem unteren Teil erkennen lässt, wird dieser 65 Verlauf durch den Antagonisten Protamin verhindert. Unmittelbar nach Protaminzugabe zum Zeitpunkt B, die etwa 30 Minuten nach der Gifteinwirkung erfolgt, zeigt sich zunächst ein spontaner Anstieg der Photonenemission, der

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aber nach kurzer Zeit in einen Kurven verlauf übergeht, der für gesunde Keime charakteristisch ist.

In Fig. 2 sind zwei Proben von Rübensäften verschiedener Qualität dargestellt. Die Proben wurden unter vergleichbaren Bedingungen durch Kaltpressen hergestellt und bis zur Messung etwa 2 Wochen gelagert.

Als Ordinate ist die Wahrscheinlichkeit p (n, At), n Photonen im Messzeitintervall At zu registrieren, aufgetragen. Der Messung liegen jeweils 300 Messwerte mit einem At = 500 ms zugrunde. Als Abszisse ist das Verthältnis n_

n gewählt, mit n als Mittelwert der Photonenzahl im Messintervall At. Damit ist gewährleistet, dass verschiedene Messkurven mit verschiedenen Mittelwerten unmittelbar vergleichbar sind.

Aus dem unterschiedlichen Kurven verlauf kann durch vorangehende chemische bzw. sensorische Prüfungen festge-5 stellt werden, dass die Probe 1, welche die geringere Streubreite der Verteilungskurve aufweist, eine gegenüber der Probe 2 bessere biologische Qualität, d.h. in diesem Falle einen natürlicheren Geschmack aufweist.

Die Wahrscheinlichkeit p (n, At) wird als Photonenstatistik io bezeichnet und gibt an, mit welcher Häufigkeit n Photonen (n = 1,2,3...) in einem vorgegebenen Messzeitintervall At emittiert werden.

Zur Gewinnung weiterer Qualitätsmerkmale können gegebenenfalls zusätzliche Mess werte der beiden Proben herange-ls zogen werden. Diese sind aus der nachstehenden Tabelle entnehmbar.

Mittelwert m Streuung C7 faktorielles Entartungs-

Moment Parameter

1. Ordnung rr2-"1

m

Probe 1 40,86 counts 10,56 counts 0,04counts 1,73 Probe 2 29,59 counts 10,83 counts 0,10 counts 2,96 Kontrolle 21,92 counts 9,53 counts 0,14 counts 3,14

Hier zeigt sich ebenfalls ein gravierender Unterschied der ultraschwachen Photonenstrahlung zwischen beiden Lebensmittelproben. Der Mittelwert der besseren Probe 1 liegt unter Berücksichtigung des Kontrollwertes, welcher der leeren Küvette als Probenaufnahmegefäss entspricht, etwa doppelt so hoch wie bei der schlechteren Probe 2. Ebenso lässt sich erkennen, dass sich die faktoriellen Momente 1. Ordnung und der Entartungsparameter in beiden Proben signifikant unterscheiden.

Bei karzinogenen Stoffen wird nach den bekannten Forschungsergebnissen unterstellt, dass Funktionen angesprochen werden, die nicht unbedingt von der Art des untersuchten biologischen Systems abhängig sind. Im allgemeinen ist die Karzinogenität eines Stoffes molekülspezifisch und damit nicht von der Art des betroffenen biologischen Systems abhängig. Die gleiche Betrachtung gilt auch für die Mutage-nität. Zwischen tierischen und pflanzlichen Tumoren bestehen zunächst keine fassbaren prinzipiellen Unterschiede. .

Zur Prüfung dçr Karzinogenität einer Substanz genügt es deshalb im allgemeinen, auf ein Zellkollektiv in Form einer Testpflanze zurückzugreifen, die eine besonders ausgeprägte und gut messbare Photonenemission aufweist. Dies gilt beispielsweise für die in Fig. 1 untersuchten Gurkenkeime.

Unter vergleichbaren Bedingungen werden die Keime 30 einerseits mit bekannten nicht karzinogenen Substanzen ähnlicher molekularer Konfiguration und andererseits mit der Prüfsubstanz (bzw. dem Agens), deren Karzinogenität zu testen ist, behandelt. In beiden Fällen wird die Gesamtintensität der ultraschwachen Photonenstrahlung in bestimmter 3s Spektralverteilung untersucht.

Ändert sich die Photonenstatistik p (n, At) bei der Prüfsubstanz weniger stark in Richtung zunehmender Inkohärenz der Strahlung im biologischen System als bei der nicht karzi-40 nogenen Vergleichssubstanz, dann kann durch Vergleich des zeitlichen Verlaufs der Photonenstatistik auf nicht karzinogene Eigenschaften der Prüfsubstanz geschlossen werden. Umgekehrt muss bei genau festlegbaren Inkohärenzkriterien mit der karzinogenen Wirkung der Prüfsubstanz gerechnet werden.

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Fig. 3 erläutert in einfacher schematischer Darstellung die benutzte erfindungsgemässe Messvorrichtung. Man erkennt ein Probeaufnahmegefäss 1 aus Quarzglas, in dem die zu untersuchende Zellkultur untergebracht wird. Vor seiner so Austrittsfläche befindet sich ein Photonensensor 2 in Form einer Photokathode. Die Ausgangsgrösse des Sensors wird über einen Messverstärker 3 einem Messgerät 4 zugeführt.

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3 Blatt Zeichnungen

Claims

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1. Verfahren zur Prüfung von biologischen Wirkungen bei Zellkollektiven, welche eine eigene oder stimulierbare ultraschwache Photonenstrahlung abgeben, dadurch gekennzeichnet, dass zur in vitro Prüfung von Substanzen auf mögliche zellschädigende bzw. regenerierende Wirkungen oder zur Qualitätskontrolle von biologischen Substanzen, als Prüfgrösse die Intensität und/oder die Photonenstatistik der ultraschwachen Photonenemission gemessen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Prüfung von biologischen Wirkungen physikalischer und/oder chemischer Agenzien auf Zellkollektive zur Untersuchung von Substanzen auf zellschädigende bzw. regenerierende Wirkungen, dadurch gekennzeichnet, dass die ultraschwache Photonenemission und die Photonenstatistik des gesunden bzw. des erkrankten oder sterbenden Zellkollektivs, ohne das Agens ermittelt wird, dass die Photonenemission nach Einwirkung des Agens als Photonenstatistik ermittelt wird, und dass die Beurteilung des Agens hinsichtlich seines schädigenden oder regenerierenden Einflusses danach erfolgt, ob sich die Photonenemission im Sinne eines gesunden Zellkollektivs oder eines erkrankten bzw. sterbenden Zellkollektivs ändert.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1 zur Qualitätskontrolle von biologischen Substanzen, insbesondere von Lebensmitteln, zum Beispiel für haltbar gemachte biologische Lebensmittel am Beginn und während der Lagerungszeit, dadurch gekennzeichnet, dass als Qualitätsmassstab die Intensität und/oder die Photonenstatistik der kohärenten ultraschwachen Photonenemission gemessen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität der ultraschwachen Photonenemission und/oder Photonenstatistik in Zuordnung zu vorgegebenen Qualitätsmerkmalen aufgrund visueller, chemischer, physikalischer und/oder sensorischer Prüfung bestimmt wird, dass die Intensität der ultraschwachen Photonenemission und/ oder deren Photonenstatistik für die zu untersuchende biologische Probe bestimmt wird, und dass die Qualitätsmerkmale nach den vorgegebenen Vergleichswerten festgelegt werden.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Aufnahme der Photonenstatistik unter dem Ein-fluss des zu prüfenden Agens eine Photonenstatistik unter der Einwirkung eines anderen Agens von bekannter Wirkung aufgenommen wird, und dass zur Beurteilung des Prüfergebnisses beide Photonenstatistiken verglichen werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass bei einem auf seine karzinogenen Eigenschaften zu prüfenden chemischen Stoff eine erste Photonenstatistik mit einem nicht karzinogenen Stoff von chemisch ähnlichem Strukturaufbau ermittelt wird, dass eine zweite Photonenstatistik mit dem zu prüfenden Stoff aufgenommen wird, und dass beide Photonenstatistiken miteinander unter dem Gesichtspunkt der Inkohärenz der Strahlung verglichen werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität der ultraschwachen Photonenemission und/oder deren Photonenstatistik getrennt in verschiedenen Spektralbereichen gemessen wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass auf das Zellkollektiv vor und/ oder während der Messung der ultraschwachen Photonenemission zusätzlich ein magnetisches und/oder elektrisches Feld einwirkt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Lichtstrahlung von definierter Wellenlänge auf das Zellkollektiv einwirkt.

10. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe vor und/oder während der Messung durch chemische Zusatzstoffe zur Photonenemission stimuliert wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass zur Stimulierung Äthanol verwendet wird.

12. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein für ultraschwache Photonenstrahlung durchlässiges Probegefäss vorgesehen ist, dass sich an dessen Austrittsfläche der Strahlung ein Photonensensor befindet, welcher eine Nachweisempfindlichkeit in dem zu untersuchenden Strahlungsbereich aufweist, und dass die Ausgangsgrösse des Sensors durch einen Mess verstärker verstärkt wird, der mit einem schreibenden und/oder anzeigenden Messgerät in Verbindung steht.

13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass als Sensor zum Nachweis der Photonenstrahlung eine Photokathode vorgesehen ist.