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Verfahren und mittel zur Bestimmung der Lipase in Körperflüssigkeiten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und mittel zur Bestimmung der Lipase in körperflüseigkoiten,
Lipase ist ein Ferment, das die Spaltung der Fette in Glyzerin und Fettsäuren bewirkt.
Dieses Ferment wird im menschlichen Körper hauptsächlich in der Bauchspeicheldrüse
gebildet und von dort an den Verdauungstral<t abgegeben. Bei Entzündungen dieser
Drüse, die mit Zellzerfall einhergehen, kommt es zum Anstieg des Lipasespiegels
im Blut. Die Bestimmung dieses Ferments im Serum ist daher von großer Bedeutung
bei der Beurteilung von Pankreaserkranungen.
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Es sind eine Reihe von Verfahren bekannt, die zur Bestimmung der Lipase
in Körperflüssinkeiten dienen. Eine besondere Bedeutung kommt bei dieser Uestimmungsreaktion
dem Substrat zu. Es hat sich nämlich herausgestell£, daß die Pankreas-Lipase vornehmlich
die Fettsäureester angreift, die mit Wasser nicht niscbar sind; wasserlösliche Fettsäureester
werden von unspezifischen Esterasen umgesetzt und stellen daher für die Lipasereaktion
ein unspezifisches Substrat dar. Ganz besonders geeignet hat sich Olivenül als Substrat
erwiesen. Die Lipasereaktion findet an der GrenzFläche zwischen ül und Wasser statt.
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Um optimale Bedingungen zu schaffen, muß diese Berührungsfläche mögtichet
groß gehalten werden Dies hat man bisher dadurch zu lüsen versucht, daß man das
01 in Form kleinster Tröpfchen in der Pufferlösung emulgiert hat. Solche Emulsionen
haben den Nachteil, daß sie unbeständig sind. Wen hat zwar zur Stabilisierung der
Emulsion Gummi arabicum oder ähnliche Stoffe zugegeben, aber die gleichzeitige Anwesenheit
von Puffersalzen bewirkt, daß es nach verhältnismößig
kurzer Zeit:
zu einer Auftrennung der Emulsion in die wässrige und ölige Phase koomt, Man nuß
daher vor Derchführung der Lipasereaktion die Emulsion jedesmal frisch herstellen.
Trotzdem besteht auch mührend der Reakting die Gefahr, daß die @rsprünglich große
Oberfläche dadurch Zusammentreten einzelner Ultröpfchen verlcleinert wird.
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Andererseits hängt der Substratumsatz von der Grüne der Berührungsfläche
ab, so daß man, je nach Verteilungsgrad der Emulsion, zu unterschiedlichen Ergebnissen
kennt.
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Die Aktiwität des Fermente wird durch die Messung der bei der iveaktion
@reig@@@tzten freien Fettsäuren bestinmt.
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Dabei gibt es die Möglichkeit, cie freien @ettsäuren zu titrieren
oder ei über ihre chlasofarmtöslichen Kupfersalze zu bestimnen. Die Titration hat
den Nachteil, daß andere protonenfceisetzende Rcoktioßen, die @@ben der Lipasereaktion
ablaufen und unspezifisch sind, miterfaßt werden. Der zeiten möglichkeit ist daher
wegen der größeren Spezifität der Vorzug zu geben. Außerdem ist beim Titrationsverfahren
eine elektrometrische Endpunkteinatellung notmendig, was einen grüßeren apparativen
Aufwand und den Einsatz gröberer Serummengen notwendig macht.
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Ziel der Erfindung ist es, ein Substrat von stets gleichbleibender
Oberfläche für die Bestimmung der Lipase herzustellen, bei der die deakting zwischen
einem m@ssurunlüslichen Fettsäureester und dem im Wasser gelösten Ferment Lipase
auf größtmöglicher Oberfläche stattfinden kann, wobei sich auch während der Reaktionsdauer
die Grüße der Berührungsfläche nicht ändert. Dabei sollte dieses Substrat fijr die
Fettsäuren-Bostimmung über die chloroformlüalichen Kupfersalze möglich sein.
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Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die Reaktion auch sehr
gut durchgeführt werden kann, wenn man das wasserunlöslichs Subatrat, vornehmlich
Olivenöl, auf einen feindisperaen
Träger aufbringt, so da die Oberfläche
dieses Tragers von einer. nur wenige Bulex@le dicken Filn des die überze--en ist.
Ein solcher Träger verliert dadurch nicht die Fähigkeit, auch noch das nässrige
Serum aufzussugen und au einen innigen Kuntakt zmiechen mässriger und öliger Phase
herzustellen. Als Träger sind neutrale oder schmach-caure, feindisperse Festatoffe
@esignet, @olche die finigesetzton Fettsäuren beim Ausschutteln mit Chloroform am
dieses abgeben. @asische Stoffe können nicht verwendet werden, da hier die Fattsäuran
adsurptiv fest chalten verden. Es kommen z.B.
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in frage: gelluloae-P@lver, Glespulver, feiner quarzsand, Kieselgel.
Als besonders geeignet hat sic das feindisperse Aerosil gezeigt. Zu der Herstellung
eines erfindungsgemäßen substrates ist ea zweckmäßig, des glivenöl in einem leicht
flüchtigen Läaungsmittal z.B.
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Äthar oder Chloroform zu läsen, es zusammen mit dem Träger aufzuschlennen
und das Löungemittel ver@unsten zu lassen oder in Vakuum abzudampfen. Außerdem ist
es zmeckmäßig, dem auf dem festen Träger aufgezogenen Substrat auch noch fein verriebene
Puffersalze beizumischen, so daß bei Zugabe des gerums gleichzeitig das optimale
@@ der Lipase-Keaktion eingestellt mird. obense können den Substrat auch cholsaure
Salze zur Aktivierung der Lipase-Beaktion beigegeben werden. Die durch die Lipase
freigesetzten Fettsäuren werden vorzugsweise als chloro-. furmlösliche Kupfarsalze
bestimmt. Jedoch eignet sich das aufindungsucmäße Substrat auch zur titrimetrischen
Erfassung der freigesetzten Fettsäuren.
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Beispiele zur Herstellung des Substrat-Pulvers: Beispiel 1.
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250 mg k'aliundihydrogenphosphat und 2,8 g Dinatriumhydrogenphosphat,
1 g Cholsäure-Natriumsalz werden genau gewogen und in einer Reibschale fein verrieben.
Dann werden
40 9 Aerosil in kleinen Portionen hunter stündigem Vertreiben
zugegeben, so daß ochlioßlich ein homogenes Ohmisch der Puffersalze, der Cholsäure
und des Aerosils gegeben ist. Zu diesem Gemisch werden 40 ml gereinintes Olivenöl,
das in 500 ml ether gelöst ist, zugegeben und durch kröftigec Rühren und Schütteln
eine gleichnäüigm Aerosilsuspension im Äther hergestellt. Anschliessend wird der
Äther bei ca. 400 abdestil-liert und das zurückblaibende Gemiscil in Vakuum vollomnen
vom restlichen Äther befreit. Es darf kein Äthergeruch mehr wahrnehmbar sein. Das
vüllig tockene Pulver wird durch ein feinmaschiges Sieb gegeben und stellt das fertige
Substrat dar.
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Beispiel 2.
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280 mg kaliumdehydrngenponsphat und 2,5 g Dinatriumhydrogenchosphat,
1,0 g Chalsäure-Gatriumsalz merden abgewagen und in einer Reibschale fein verrieben.
Dann werden 45 g Cellulnsepulver wie oben angegeben portionsweise zugegeben unci
gut durchmischt. 40 ml gereinigtes -Olivenöl werden in 500 ml Chloroform gelöst
und mit dem Cellulosepulver zu einem Brei verrührt. Das Chloroform wird im Vakuum
abdestilliert und im Vakuum getrocknet, bis der Chloroformgeruch vollkommen verschwunden
ist.
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Weiter wird wie in Beispiel 1 verfahren.
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Oeispiel 3.
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200 mg Kaliumdihydrogenphosphat und 2,8 g Dinatriumhydrogenphosphat,
1 g Cholsäure-Natriumsalz werden in einer schale fein verrieben. Dann werden 55
g Glaspulver (oder feiner geglübter Quarzsand) in kleinen Portionen unter ständigem
Verreiben zugegeben, so daß schließlich ein homogenes Gemisch der Puffersalze, der
Cholsäure und des Glaspulvers (oder Quarzsandes) gegeben ist. Zu diesem Gemisch
werden 40 ml gereinigtes Olivenöl, das in 500 ml Äther gelöst ist, zugegeben und
weiter wie in Beispiel 1 verfahren.
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Im Gegensatz zu beispiel 1 und 2 mer@nm zur 0estinnun Rnstallu von
70 mg Subetrntpulver 95 mg Hiog@setzt.
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Die Lüsungsn zur Bestimmung dar aus dem Substrat durch die Lipase-?eaktion
froigesetzten Fettsäuren sind an sich bekannt, sie werden hier der Vollständigkeit
halber nochmals angegeben: Kupfarläsung: 665 ml friäthanolamin, 322 ß Kupfernitrat
x 2 H2B, 100- g Bstriumchlorid werden auf 10 Liter mit, dest. Uasser aufgefüllt.
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Farbreagens: Diäthyldithiocarbamst-Löaung 1% in sek. Butylzlkohol.
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Standardlöeung: Als Standard dient eine 25 n?ol @upferpzlmitatlösung
-in Chloroform.
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Durchführung der Bestimmung: 70 mg des Substratpulvere merden in ein
Reagensglas gegeben und 5 Minuten im Wassorbed von 37° vorgowärmt. In das Substratoulver
läßt man 0,2 ml Serum einsnugen und bebrütet den Aasetz genau 20 Binuten bei 37°.
Die Fermentreaktion wird abgestoppt durch Zugabe von 4 ml Chloroform und 1 ml Kupfernitrat,
wobei das Gemisch kräftig durchgeschüttelt wird. Anschließend wird zentrifugiert.
Der wässrige Überstand wird mit Hilfe einer Wasserstrahlgumpe abgesaugt. Vom Chlorofurmrückatend
wird 1 ml weiterverwendet; der mit 1,5 ml Farbreagens versetzt wird.
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Ein Serum-Leerwert wird wie folgt angesetzt: 4 ml Chloroform, 1 ml
Kupfernitrat, 0,2 ml Serum werden mit 70 mg Substratpulver geschüttelt und ohne
Bebrütung zentrifugiert. Die Chloroform-Phase wird wie die Analyse bebandelt. Außerdem
mird @in Beagentien-Lecrwert angssetzt, der aus 4 mi Chloroform und 1 ml Kupfernitrat
besteht.
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Nach dem Schütteln und Zentrifugieren wird ebenfalls 1 ml
der
Chloroform-Phase mit 1,5 ml Farbreagens versetzt. Zur Erstellung des Standardansatzes
wird 1 ml der Standardlösung mit 1,5 ml Farbreagens versetzt.
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Analyse, Standard und Serum-Leerwert werden gagen den Leerwert bei
420-4G mm gemessen.
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Die Berechnung erfolgt nach der Formel: Extinktion Analyse - Extinktion
Serum-Leerwert X 25 = mU Lipase Extinktion Standard