DE2213134C3 - Enzympräparat und dessen Verwendung zur stereospezifischen Bestimmung von D(-)-4-Hydroxy-3-methoxymandelsäure - Google Patents

Description

4-Hydraxy-3-methoxymandelsäure. nachstehend als HMS bezeichnet ist ein Hauptmetabolit von Epinephrin und Norepinephrin bei Menschen. Abnorme Werte von HMS im Urin stellen wichtige Hinweise auf bestimmte Krankheitszustande, wie auf Schizophrenie und auf ein Pheochromocy'om. dar. Hohe HMS-Werte werden unter zahlreichen anderen Bedingungen gefunden, die tu' verstärkten Umwandlung der in Ganglinienzellen vorkommenden Vorläufer I pinephrin und Norepinephrin führen. Es wurden gezeigt, daß die HMS-Ausschct dung unter einer Vielzahl von Streßbedingungen ansteigt, da HMS ein Hauptmetabolit der Catecholaminc ist. Die Messung der Änderung der HMS-Ausscheidung ist als Methode /ur Untersuchung der vorgenannten I lormone von beträchtlichem Interesse.

Nur die D( - J-HMS ist ein Meiafoolit der vorgenannten Verbindungen Im menschlichen Urin kann jedoch auch U-J-HMS enthalten sein. Das I. Isomere wird gewöhnlich mn der Aufnahme von Nahrung in den Körper eingeführt. Deshalb muH jedes Verfahren /ur Bestimmung von D( - J-HMS siereospe/tfisch fur das D-Isomere sein, um physiologische Rückschlüsse /ti erlauben

Aus Clin. Chemistry, Bd. 10 (1964), S. 675 bis 677, ist ein Verfahren zur Bestimmung von Vanillylmandelsäure (4-Hydroxy-3-methoxymandeIsäure) bekannt. Dabei wird eine aus Pseudomonas fluorescens A 312 erhaltene L-Mandelsäuredehydrogenase verwendet. Dieses Verfahren ist somit L-spezifisch und zur Bestimmung von D( — J-HMS nicht geeignet.

Bei früheren Versuchen zur Bestimmung der Konzentration von D(-J-HMS im menschlichen Urin war die Anwendung von Extraktions- oder Reinigungsmethoden, wie der Säulenchromatographie, erforderlich. Die Durchführung dieser Verfahren erfordert einen beträchtlichen Zeitaufwand und eine Vielzahl von Reagentien, und die Versuchsergebnisse sind mit beträchtlichen Fehlern behaftet.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Enzympräparat zur Verfugung zu stellen, das eine genaue, rasche und einfache stereospezifische Bestim-fjng von D( - J-HMS in biologischen Flüssigkeiten ermöglicht.

Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert.

Zur Bestimmung von D(-)-4-Hydroxy-3-rneihoxymandelsäure in biologischen Flüssigkeiten, wird erfindungsgemäß in die biologische Flüssigkeit das erfindungsgemäße D( - J-Mandelsäuredehydrogenase- Präparat eingebracht, das Gemisch so lange inkubieri. bis eine zur Messung ausreichende Menge von D( - )-4-Hydroxy-3-methoxymandelsäure umgewandelt ist. und anschließend die Menge des Umwandlungsproduktes bestimmt.

Erfindungsgemäß wird nur Df-^HMS enzymatisch in Vanillylglyoxylat umgewandelt. Ein Teil des so entstandenen Vanillylglyoxylat wird weiter in Vanillin überführt. Die Menge der bei der enzymatischen Reaktion entstandenen Umwandlungsprodukte, die der in der Urinprobe ursprünglich vorhandenen HMS-Mengc direkt proportional ist. kann mittels üblicher spektrophotometrischer Methoden, wie der UV-Absorption und der Fluoreszenzanalyse, rasch bestimmt werden. Die Umwandlungsprodukte können auch in andere Verbindungen überführt werden, die dann quantitativ bestimmt werden können.

F.rfindungsgcmatt wird D( - J-HMS in Gegenwart eines F.n/ympräparats gemäß der Erfindung, das D(~)-Mandelsaure ( Nk/epiorJ-oxidoreduklase. in der vorliegenden Beschreibung als D( - J-Mandelsauredehydrogenasc bezeichnet, enthält, in Vanillylglyoxylat und weiter in Vanillin gemäß dem nachstehenden RcakiKinsschcniii timgewandelt:

( ooil
Il ( oll

COOII C

< Hvd.ition

Il

( O.

II,

oll
IIM.S

O( Il oll

Vanillyhjlyoxyliil o( II,

oll
Vimillin

Bei Durchführung der nachstehend beschriebenen Bestimmung mit Hilfe der f'liiorimetrie oder der UV-Absorption ist eine Auftrennung der Umwandlungsprodukte nicht erforderlich, da ihre gemessenen speklrophotometrischen Ligensc haften praktisch gleich sind. Hie iretiii.-.-.uneii Werte sind die Summe der von jedem Umwandlungsptüdukt herrührenden Beiträge.

Die Geschwindigkeit der Bildung von Vanillylglyoxy· InI unter Verwendung eines Enzympräparat mit gleichbleibender Aktivität is( eine Funktion der

Enzymkonzentration in der Urinprobe. Um innerhalb vernünftiger Zeiträume meßbare Mengen von Vanillylglyoxylat und Vanillin zu erhalten, ist es erforderlich, daß jede Probe mit einer ausreichenden Enzymmenge versetzt wird. Es wurde festgestellt, daß das Substrat bei ϊ einem pH-Wert des Reaktionssystems von 6,5 mit optimaler Geschwindigkeit oxydiert wird. Dieser pH-Wert ist deshalb bevorzugt. Bei höheren oder niedrigeren pH-Werten ist die Bildungsgeschwindigkeit des Vanillylglyoxylats geringer.

Die in einer bestimmten Urinprobe enthaltene Menge von D(-)-HMS wird dadurch bestimmt, daß man Vanillylglyoxylat und Vanillin quantitativ mißt und diese Werte mit den Werten vergleicht, die für unter identischen Bedingungen umgesetzte Proben mit bekannter D( — )-HMS-Konzentration erhalten werden.

Bei Bestimmung des Uinwandlungsproduktes mit Hilfe der UV-Absorption wird der Wert der Extinktion einer bestimmten Urinprobe gemessen, die mit D(-J-Mandelsäuredehvdrogenase behandelt wurde. Die Menge des gebildeten Umwandlungsproduktes wird durch Vergleich der Extinktion der unbehandelten Probe mit der Extinktion der mit dem Enzympräparat umgesetzten Proben bestimmt.

Vanillylglyo\\ldt und Vanillin zeigen bei hohen pH-Werten eine charakteristische Absorption im ultravioletten Spektralbereich bei 34' nm.

Bei Bestimmung der Umwandlungsprodukte mit Hilfe der Fluoreszenzanalyse wird das nach der enzvmatischen Reaktion erhaltene Reaktionsgemisch jo mit einer gepufferten Lösung einer Verbindung vermischt, die m. den Umwandlungsprodukten der Enzvmreaktion fluoreszierende Verbindungen bildet. Man kann auch das Enzym und die zur Herstellung fluoreszierender Verbindungen cinge'-tzte Verbindung js miteinander vermischen und die Urinprobe direkt dem so erhaltenen Gemisch einverleiben In diesem Falle wird Vanillylglyoxylat und Vanillin sofort nach der Bildung in die entsprechende fluoreszierende Verbindung überführt. 4Π

Fine besonders bevorzugte Verbindung zur Herstel lung fluoreszierender Verbindungen ist 1.2-Diaminonaphthalin Die Umwandliingsprodukteder F.nzymreaktion können in gleicher Weise mit 2.3-Diaminonaphtha-Iiη zu fluoreszierenden Verbindungen umgesetzt wer- 4> den. Diese Verbindungen zeigen jedoch nicht die intensive Fluoreszenz, die den bei der Umsetzung mit 1.2-Dianunonaphtlialin erhaltenen Produkten eigen ist. Zur Herstellung fluoreszierender Derivate von Vanillyl· glyoxylat und Vanillin kann auch Diaminoben/oesäure i» und Diaminoben/ol verwendet werden.

Fs wurde fesigeste'lt, daß die Fluoreszenzanalyse etwa 20 bis 40mal empfindlicher ist als die UVAbsorp tionsanalvse. Die Fluores/enzanalyse erlaubt somit die Bestimmung niedrigerer Konzentralionen von v> D( J-HMS als die I IV-Ahsorptionsan.ilyse. Kombinier te Vanillvlplvt'xyliit-Vanillin-Werte können nut Hilfe der [ luorcv/en/an.ilvsc bis zu einer unteren Kon/cntra tionsgren/i von 4.4 * IO * m bestimmt werden, wäh rend mn Hilfe der I¹V Absorptionsan.ilvse lediglich mi KuiuenUittiunui bis /.u einer linieren (jrcn/.e vun 4χ 10-⁶IH nachgewiesen werden können. Demgemäß werden bei der Durchführung der Bestimmung riiit Flilfe der Fluoreszenz.analyse geringere Enzymmengen benötigt als bei der UV-Absorptionsanalyse. Die zu hi untersuchende Probe muß jedoch mit einer ausreichenden Menge des Enzympräparats vcrsel/t werden, um sicherzustellen, daß innerhalb der gewählten Zeit zumindest die geringste nachweisbare Menge von Vanillylglyoxylat und Vanillin gebildet wird. Da die Umwandlungsgeschwindigkeit von D(-)-HMS in erster Linie eine Funktion der Enzymkonzentration ist, wird bei niedrigeren Enzymkonzentrationen weniger HMS in Vanillylglyoxylat und Vanillin umgewandelt. Zur Bestimmung der in einer bestimmten Urinprobe ursprünglich vorhandenen D(-)-HMS-Konzentration wird die Fluoreszenz der Umwandlungspro-iukte gemessen und mit den bei ähnlichen Proben mit bekannten D( —)-HMS-Konzentrationen erhaltenen Werten verglichen, wobei die zuletzt genannten Proben mit derselben Enzymmenge während derselben Zeit umgesetzt wurden. Bei Verwendung geringerer Enzymmengen werden die Kosten des erfindungsgemäßen Verfahrens herabgesetzt, und die Genauigkeit der Bestimmungen nimmt zu, da die durch Trübung der Probe verursachte Störung abnimmt.

Die erfindungsgemäß eingesetzte D( —)-Mandelsäuredehydrogenase stammt aus dem Bakterienstamm MB-15 von K. Hosakawa. Dieser Stamm wurde aus der Erde mit Hilfe der Benzoatanreicherung isoliert und als Stamm von Pseudomonas putida A identifiziert. Dieser Stamm wurde bei der American Type Culture Collection unter der Nr. ATCC 17 426 hinterlegt. Der vorgenannte Stamm nimmt, soweit bekannt, unter den zahlreichen Stämmen von Pseudomona!> putida eine besondere Stellung ein, da er ein sehr stabiles Enzym mit hoher Aktivität bezüglich der erlindungsgemäßen Umwandlung von D( - J-HMS enthält. So zeigt z.B. Pseudomonas puiid*. A Stamm A.3.12. ATCC 12 633. nicht diese vorteilhaften Eigenschaften. Pseudomonas putida A ATCC 17 426 wird bei 30'C unter starker Belüftung in einem Mineralienmedium gezüchtet, das ein Gemisch anorganischer Salze, wie Natrium· und Kaliumphosphate. Calciumchlorid und Magnesiumsulfat, und verschiedene organische Verbindungen als einzige Kohlenstoff- und Energiequellen enthält. Das verwendete Mineralienmedium is: in der Arbeit von Hegeman. »Synthesis of the Enzymes <j.^r the Mandelate Pathway by Pseudomonas Putida«. Journal of Bacterio logv.Band91 (1966). Seite 1140 bis 1154, beschrieben.

Für die Herstellung des Enzympräparats ist es von Wichtigkeit, daß die Zellen des Mikroorganismus in einem mandelathaltigen Medium gezüchtet werden. Das Mandelat wuJ üblicherweise in Form eines Gemisches der D- und L-Isomeren eingesetzt. Wenn als einzige Kohlenstoff und Energiequelle das Racemat der Mandelsäure eingesetzt wird, wird nur das D-Isomere oxydiert. Das nichtoxydiertc I.-Mandcl.it. das zur Herstellung verschiedener Arzneimittel und organischer Verbindungen verwendet wird, stellt ein wichtiges Nebenprodukt dar. das nach üblicher Methoden in einfacher Weise gewonnen werden kann

Die Züchtung des Mikroorganismus wird so lange durchgeführt, bis kein feststellbarer Anstieg det Trübung der Kluturbiuhf.· mehr eintritt. Aul diese Weise wird sichergestellt, daß die /eilen wahrend der spaten e*ponentiellen V\>.u hstumsphase geerntet werden Zur Freisetzung ties I n/v ms werden dann die /el I wände der geerntete!'. Zeilen dufgeb:mhen. Nadi Lntfernung der Zellwändc wird das Enzym als Suspension in einer rosafarbenen Paste von ZcHpfotoplasfha isoliert. Diese Paste kann ohne einen nachweisbaren Aktivitätsvcrlusl bis zu einem )ahr bei 0°C aufbewahrt werden.

Nach einem bevorzugten Verfahren werden die Zellen in einem Puffer, wie m einem wäßrigen 0.1 m Tris-(hydroxynielliyl)-antinomeihan-HCI-Puffer (pH

7? 13

8,0), suspendiert. Die Zellwände werden durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen. Anschließend werden die restlichen ganzen Zellen und die Zelltrümmer bei niedriger Geschwindigkeit, z. B. bei JOOOg abzentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird dann bei hoher Geschwindigkeit, z. B. bei 105 000 g, zentrifugiert, wobei die Membranfraktion sedimentiert. Dieses Sediment, das eine geringe Menge lösliches Material enthält, wird unter starkem Schütteln wieder in 0,1 m Puffer suspendiert, der zusätzlich 40 Volumprozent Äthylenglycol enthält. Die so erhaltene gleichmäßige, rosa bis braun gefärbte Suspension enthält D(-)-MandeIsäuredehydrogenase und dien; erfindungsgemäß als analytisches Reagenz. Die D(-)-Mandelsäuredehydrogenase ist genügend aktiv, um die quantitative Umwandlung von D( — )-HMS in die entsprechende Ketosäure bei einer annehmbaren Geschwindigkeit durchzuführen.

Die Bestimmung der bei der enzymatischen Umwandlung gebildeten Menge von Vanillylglyoxylat und Vanillin kann auch mn Hilfe anderer Methoden durchgeführt werden, wenn diese auch komplizierter und zeitraubender sind als die vorstehend, beschriebenen Methoden der UV-Absorptionsanalyse und der Fluoreszenzanalyse. Die Reaktionsprodukte können /um Beispiel aus der Mutterlauge durch Papierchroma lographie. Dünnschichtchromatographie, Gas-FIüssigkcits-Säulenehromatographie oder Flüssigkeits-Fest-Chroiiuitographie mit hoher Geschwindigkeit oder durch Chromatographie an Ionenaustauschern abgetrennt werden. Die Abtrennung kann auch durch vorhergehende FIüssig-Flüssig-Extraktion. fraktionierte Sublimation oder Destillation. Elektrophorese od^r Gegensiromverteüung erfolgen. Wenn Vanillylglyoxylat und Vanillin aus dem Reaktionsgemisch isoliert sind, können diese Verbindungen quantitativ z. B. mit Hilfe der Isotopen-Verdünnungsmethode unter Verwendung eines radioaktiv markierten Produktes und nachfolgender Reinigung und Messung bestimmt werden. Ferner können aus den Umwandlungsprodukten oder deren Derivate" Verbindungen hergestellt werden, die gaschromatographisch bestimmt werden können. Das gebildete Vanillylglyoxylat kann auch weiter gereinigt werden, und die gereinigten Umwandlungsprodukte können mit einer Diazoniumverbindung zu gefärbten Verbindungen umgesetzi werden.

Die Beispiele erläutern die Erfir lung.

Beispiel 1

A. I lerstellung einer Zellpasie von Pseudomonas
putida \, ATCC 17 42b

Pseudomonas putida A. ATCC 17 42b. wird in 2.7 Liter fassenden Kolben mit 500 ml Medium gezüchtet. Zwei solche Kulturen werden zum Beimpfen von 11 Liier mineralischem Kulturmedium verwendet, das 0.02 m Ammonium-D.l.-Mandelat als einzige Kohlenstoffquelle enthält. Die Fermentation wird in 3 f-ermentern durchgeführt. Die (ienerationszeil beträgl bei JO-C b0 Minuten. Die Züchtung wird unter starker Belüftung und schnellem Rühren so lange fortgesetzt, bis die Trübung einen Wert von 250 Einheiten Kolorimeter, versehen mit einem Filter Nr. 66, erreicht. Dann werden etwa 75 Prozent der Kulturbrühe aus den Fermentern entfernt, und die Zellen werden in einer Dtirchlaufzentrifugc peerntet. Die Fermenter werden dann mit 8 Liter unslürilcm, frischem und vorgewärmtem Kulturmedium gefüllt, und die Züchtung der Zellen wird fortgesetzt. Dieses Verfahren wird zweimal wiedernolt und ergibt insgesamt 250 g feuchte Zellen. Ein Teil der so erhaltenen Zellpaste wird bei -20 C eingefroren. Unter diesen Bedingungen kann die Zellpaste lange Zeit ohne nachweisbaren Aktivitätsverlust aufbewahrt werden.

B. Herstellung von D(-)-Mandelsäuredehydrogenase

Die Zellpaste wird in 4 Gewichtsteilen 0.1 m Na₃HPO₄-KH₃PO₄-Puffer (pH 6,8) unter heftigem Schütteln suspendiert. Die Suspension wird dann in 50-ml-Portionen 20 Minuten in einem 10-kHz-Ultraschallgerät bei maximaler Leistung behandelt. Diese Ultraschallbehandlung zur Zerstörung der Zellen wird bei 0 bis 4°C durchgeführt. Nach dieser Behandlung wird die Suspension 10 Minuten bei 5000 g zur Entfernung von Zelltrümmern und nichtzerstörten Zellen zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert, und das zurückbleibende Sediment wird verworfen. Die überstehende Flüsigkeit wird dann 90 Minuten in einer Zentrifuge bei 2VOOOUpM (etwa 105 000 g) zentrifugiert, wobei aus dem Rohextrakt eine Partikelfraktion sedimentiert. Das Sediment wird in kaltem 0,05 m Phosphatpuffer (pH 6,8) suspendiert, und die suspension wird erneut zentrifugiert. Das so erhaltene Sediment wird in einer geringen Puffermenge suspendiert. Die Suspension wird dann mit einer solchen Menge von Äthylenglycol versetzt, daß dessen Konzen tration 40 Volumprozent beträgt.

C. Durchführung der Bestimmung mit Hilfe der
U V-Absorptions;! nalyse

Es wird das folgende Puffer-Lnzym-Gemisch herge-

jj stellt: Die Pufferlösung enthält 0.25 m Citronensäure: der pH-Wert wird mit konzentrierter Natronlauge auf 6.5 eingestellt. Die Enzymlösung ist ein Gemisch von 10 ml des unter B hergestellten Enzympräparats. 15 ml Äthylenglycol und 75 ml Wasser.

Ein Gemisch von ! ml des Puffers und I ml der P.nzymlösung wird mit 1 ml einer Urinprobe versetzt, die eine unbekannte Menge von HMS enthält. Das Gemisch wird 2 Stunden bei 37⁰C in einrm Wasserbad inkubiert. Das erhaltene Gemisch wird djnn mit 2 ml einer 2 Prozent Natriurndodecylsulta' und 0.15 η NaOH enthaltenden Rcagenzlösung versetzt, um das Enzym zu inaktivieren und die Trübung zu verringern. Die so erhaltene Probe wird dann weitere 2 Stunden bei 37' C inkubiert.

Zur Herstellung eines Enzymleerwertes wird 1 ml desselben Urins, 1 ml Puffer und 1 ml eines Enzympräparats, das zur Zerstörung der Enzymaktivität vorher 1 Stunde auf 60° C erhitzt wurde, vermischt. Der Leerwert wnd 2 Stunden inkubiert, mit 2 ml der Reagenzlösung versetzt und dann weitere 2 Stunden inkubiert.

Die F.xtinktionswerte der zu bestimmenden Probe und des Leerweries werden in einem Speklrophotometer gemessen. Die Konzentration von HMS in der Probe wird nach der nichstehenden Gleichung berechnet:

In dieser Gleichung bedeutet C die Konzentration von HMS, K eire Absorptionskonstante, deren Wert aus Proben mit bekannten HMS-Konzentrationen bestimmt wird, E[A) die Extinktion der zu bestimmenden Probe, E[B) die Extinktion des Enzymleerwertes

und D den Vcrcliinniingsfiiktor.
folgende Extinktionen gemessen:

Bei 345 mn werden

Der Verdünnungsfiiktor hat einen VVerl von 5. und die aus einer Probe mit bekannter Vanillin-Konzentration berechnete Äbsorptionskonstanic beträgt 1/2,65XlO-¹. Aus diesen Werten errechnet sich eine D(-)-HMS-Kon/cntration von 0.193 χ 10 * Mol/Liter.

Beispiel 2

Durchführung der Bestimmung mit Hilfe der
Fluoreszenzanalyse

Gemäß Beispiel I wird eine zu bestimmende Probe und ein Enzymlcerwcrt für einen Urin mit unbekannter D(-)-HMS-Konzcniration wie nachstehend beschrieben hergestellt:

Zu bestimmende
Probe Λ

Enzymleerwert B

Urin
PulTer¹)
Enzymlösung²)
Inaktiviertes Enzym')

0.10 ml
0.10 ml
O.iO ml

0,10 ml
0,10 ml

OJO ml

')0.25 m Citronensäure, deren pli mit Natronlauge auf 6,5 eingestellt wurde, und die anschließend mit soviel Wasser versetzt wird, daß dieCitratkonzenlration insgesamt 0,15 m beträgt.

²) Gemisch von 10 ml des Enzympräparats gemäß Beispiel 1, 15 ml Äthylenglykol und 75 ml Wasser.

³) Die Erizymlösung wurde 1 Stunde auf 60⁰C erhitzt.

Die Proben werden 2 Stunden in einem Wasserbad von 37 C inkubiert. Anschließend werden die so erhaltenen Gemische mit 5 ml einer Reagenzlösung versetzt, die 1 ml 1.2-DiaminonaphthaIin (1 mg/ml in 95prozentigem Propanol). I ml einer lOprozcntigen wäßrigen Lösung von Natriumlaurylsulfonat und 48 ml einer Pufferlösung vom pH 3.0 (Citratkonzentration 0.05 m) enthält. Die so erhaltenen Gemische werden weitere 2 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wird die Fluoreszenz jeder Probe bei einer Anregung von etwa 330 nm mit einer erwarteten Emission von 400 nm mit einem Fluorimeter gemessen. Die D( —)-HMS-Kon-/enlralion der zu bestimmenden Probe wird nach der nachstehenden Gleichung berechnet:

ϊ In dieser Gleichung bedeute! ("die Konzentration. D den Verdünnungsfaiktor. L eine Umwandlungskonstante. Λ7 einen Meßfaktor des Fluorimeters. F[A) den bei der Messung der Lösung A erhaltenen, den Dunkelstrom übersteigenden numerischen Wert und F[B) den

ti) bei der Messung der Lösung B erhaltenen, den Dunkelstrom übersteigenden numerischen Wert. Der Wert für /. wird unter Verwendung einer Probe mit bekannter HMS-Kon/cniration zu |/|.l8xlO^b bestimmt. Der Wert für M beträgt 0.03 und für D 5.3/0.1.

υ Die gemessenen Werte für F[A) beziehungsweise F[R) betragen 40.9 beziehungsweise 26.4. Hieraus errechnet sich eine HMS-Konzentration von 0.196 χ 10 ⁴ Mol/Liter.

Bei beiden Experimenten wurde entsalztes Wasser

2h verwendet. Das Älhylcnglyko! wird dem Enzympräparat als Konservierungsmittel zugegeben, um das Wachstum von Bakterien, den Enzymabbau und das Zusammenklumpen während der Umsetzung zu verhindern. Bei dem fluorimetrischen Versuch wird als Enzymlecrwert erhitztes, nicht umgesetztes Enzym verwrndet. da eine geringe Trübung die Stärke der Fluoreszenz beträchtlich beeinflußt. Die Zugabe von Natriu»nlaurylsulfonat und Natriumdodecylsulfonat erfolgt deshalb, um den GroßteiJ des Enzyms während der

jo anschließenden weiteren 2stündigen Inkubation in Lösung zu bringen.

Die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Bestimmungsmethoden sind äußerst einfach und problemlos durchzuführen. Sie können mil relativ unkom-

ji pliziertem Gerät und von Personen ohne spezielle Vorkenntnisse durchgeführt werden. Diese Methoden lassen sich rasch an automatische Analysenverfahren anpassen und sind daher insbesondere für kinetische Untersuchungen, zur Bestimmung vieler Proben und für Screening-Untersuchungen geeignet, die mit den derzeit verfügbaren Methoden nicht oder nur auf

L/prn^H ν/^n η f* ti

Abgesehen von dem Enzympräparat wird lediglich eine geringe Anzahl üblicher Laboraioriumsreagenzien benötigt.

Es ist keine andere Methode bekannt, die es erlaubt, auf enzymatischem Wege in vitro D(-)-HMS mit der erfindungsgemäßen hohen Spezifität in die zu bestimmenden Umwandlungsprodukte zu überführen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist deshalb vollkommen frei von Störungen, mit denen kolorimetrische Methoden häufig behaftet sind.

Erfindungsgemäß kann auch D{ — )-HMS im Serum oder im Serum und im Urin bestimmt werden.

Claims (4)

1. Patentansprüche:

   !. Aktives Enzympräparat, das stereospezifisch D(-)-4-Hydroxy-3-methaxymandelsäure oxydiert hergestellt durch Züchten von Pseudomonas putida A ATCC 17 426 in einem Mandelat enthaltenden Medium, Aufbrechen der Zellen, Abtrennen der Zelllrümmerund Isolierendes Enzympräparats.
2. 2. Enzympräparat nach Anspruch 1, hergestellt durch Aufbrechen der Zellen mit Hilfe einer Ultraschallbehandlung.
3. 3. Enzympräparat nach Anspruch 1, hergestellt durch Aufbrechen der Zellen in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 8,0, Abzentrifugieren der Zelltrümmer, Isolieren einer Membranfraktion und Suspendieren dieser Fraktion in einem Gemisch einer Pufferlösung und Äthylenglykol.
4. 4. Verwendung des Enzympräparats nach Anspruch 1 zur stereospezifischen Bestimmung von D(-)-4-Hydroxy-3-methoxymandelsäure in biologischen Flüssigkeiten.