DE2213134B2

DE2213134B2 - Enzympräparat und dessen Verwendung zur stereospezifischen Bestimmung von D(-)-4-Hydroxy-3-methoxymandelsäure

Info

Publication number: DE2213134B2
Application number: DE2213134A
Authority: DE
Inventors: George L. Dr. Tiburon Ellman; George D. Dr. Berkeley Hegeman
Original assignee: University of California Berkeley
Current assignee: University of California Berkeley
Priority date: 1971-03-19
Filing date: 1972-03-17
Publication date: 1979-08-02
Also published as: CH572620A5; AU3966472A; DE2213134C3; BE780875A; FR2129774A5; DE2213134A1; AU466864B2; IL38896A0; JPS5432358B1; ZA721859B; IT994032B; US3749643A; SE399475B; GB1380443A; IL38896A; NL7203558A; CA960948A

Description

4-Hydroxy-3-methoxymandelsäure, nachstehend als HMS bezeichnet, ist ein Hauptmetabolit von Epinephrin und Norepinephrin bei Menschen. Abnorme Werte von HMS im Urin stellen wichtige Hinweise auf bestimmte Krankheitszustände, wie auf Schizophrenie und auf ein Pheochromocytom, dar. Hohe HMS-Werte werden unter zahlreichen anderen Bedingungen gefunden, die zur verstärkten Umwandlung der in Ganglinienzellen vorkommenden Vorläufer Epinephrin und Norepinephrin führen. Es wurden gezeigt, daß die HMS-Ausscheidung unter einer Vielzahl von Streßbedingungen ansteigt, da HMS ein Hauptmetabolit der Catecholamine ist. Die Messung der Änderung der HMS-Ausscheidung ist als Methode zur Untersuchung der vorgenannten Hormone von beträchtlichem Interesse.

Nur die D(-)-HMS ist ein Metabolit der vorgenannten Verbindungen. Im menschlichen Urin kann jedoch auch L(-)-HMS enthalten sein. Das L-lsomere wird gewöhnlich mit der Aufnahme von Nahrung in den Körper eingeführt. Deshalb muß jedes Verfahren zur Bestimmung von D( —)-HMS stereospezifisch für das D-Isomere sein, um physiologische Rückschlüsse zu erlauben.

Aus Clin. Chemistry, Bd. 10 (1964), S. 675 bis 677, ist ein Verfahren zur Bestimmung von Vanillylmandelsäure (4-Hydroxy-3-methoxymandelsäure) bekannt Dabei wird eine aus Pseudomonas Puorescens A 312 erhaltene L-Mandelsäuredehydrogenase verwendet Dieses Verfahren ist somit L-spezifisch und zur Bestimmung von D( -)-HMS nicht geeignet

Bei früheren Versuchen zur Bestimmung der Konzentration von D( —)-HMS im menschlichen Urin war die

ίο Anwendung von Extraktions- oder Reinigungsmethoden, wie der Säulenchromatographie, erforderlich. Die Durchführung dieser Verfahren erfordert einen beträchtlichen Zeitaufwand und eine Vielzahl von Reagentien, und die Versuchsergebnisse sind mit beträchtlichen Fehlern behaftet.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Enzympräparat zur Verfügung zu stellen, das eine genaue, rasche und einfache stereospezifische Bestimmung von D( -)-HMS in biologischen Flüssigkeiten ermöglicht.

Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert.

Zur Bestimmung von D(—)-4-Hydroxy-3-methoxymandelsäure in biologischen Flüssigkeiten, wird erfindungsgemäß in die biologische Flüssigkeit das erfindungsgemäße D(-)-Mandelsäuredehydrogenase Präparat eingebracht, das Gemisch so lange inkubiert, bis eine zur Messung ausreichende Menge von D( —)-4-Hydroxy-3-methoxymandelsäure umgewandelt ist, und anschließend die Menge des Umwandlungsproduktes bestimmt.

Erfindungsgemäß wird nur D(-)-HMS enzymatisch in Vanillylglyoxylat umgewandelt. Ein Teil des so entstandenen Vanillylglyoxylat wird weiter in Vanillin überführt. Die Menge der bei der enzymatischen Reaktion entstandenen Umwandlungsprodukte, die der in der Urinprobe ursprünglich vorhandenen HMS-Menge direkt proportional ist, kann mittels üblicher spektrophotometrischer Methoden, wie der UV-Absorption und der Fluoreszenzanalyse, rasch bestimmt werden. Die Umwandlungsprodukte können auch in andere Verbindungen überführt werden, die dann quantitativ bestimmt werden können.

Erfindungsgemäß wird D(-)-HMS in Gegenwart eines Enzympräparats gemäß der Erfindung, das D(-)-MandeIsäure-(Akzeptor)-oxidoreduktase, in der vorliegenden Beschreibung als D( —)-Mandelsäuredehydrogenase bezeichnet, enthält, in Vanillylglyoxylat und weiter in Vanillin gemäß dem nachstehenden Reaktionsschema umgewandelt:

Oxydation

OCH₃

CO₂

OCH,

OH Vanillylglyoxylat

T OCH₃

OH

Vanillin

Bei Durchführung der nachstehend beschriebenen Bestimmung mit Hilfe der Fluorimetrie oder der UV-Absorption ist eine Auftrennung der Umwandlungsprodukte nicht erforderlich, da ihre gemessenen spektrophotometrischen Eigenschaften praktisch gleich sind. Die gemessenen Werte sind die Summe der von jedem Umwandlungsprodukt herrührenden Beiträge.

Die Geschwindigkeit der Bildung von Vanillylglyoxylat unter Verwendung eines Enzympräparats mit gleichbleibender Aktivität ist eine Funktion der

Enzymkonzentration in der Urinprobe. Um innerhalb vernünftiger Zeiträume meßbare Mengen von Vanillylglyoxylat und Vanillin zu erhalten, ist es erforderlich, daß jede Probe mit einer ausreichenden Enzymmenge versetzt wird. Es wurde festgestellt, daß das Substrat bei einem pH-Wert des Reaktionssystems von 6,5 mit optimaler Geschwindigkeit oxydiert wird. Dieser pH-Wert ist deshalb bevorzugt Bei höheren oder niedrigeren pH-Werten ist die Bildungsgeschwindigkeit des Vanillylglyoxylats geringer.

Die in einer bestimmten Urinprobe enthaltene Menge von D( —)-HMS wird dadurch bestimmt, daß man Vanillylglyoxylat und Vanillin quantitativ mißt und diese Werte mit den Werten vergleicht, die für unter identischen Bedingungen umgesetzte Proben mit bekannter D(—)-HMS-Konzentration erhalten werden.

Bei Bestimmung des Umwandlungsproduktes mit Hilfe der UV-Absorption wird der Wert der Extinktion einer bestimmten Urinprobe gemessen, die mit D(-)-Mandelsäuredehydrogenase behandelt wurde. Die Menge des gebildeten Umwandlungsproduktes wird durch Vergleich der Extinktion der unbehandelten Probe mit der Extinktion der mit dem Enzympräparat umgesetzten Proben bestimmt.

Vanillylglyoxylat und Vanillin zeigen bei hohen pH-Werten eine charakteristische Absorption im ultravioletten Spektralbereich bei 345 nm.

Bei Bestimmung der Umwandlungsprodukte mit Hilfe der Fluoreszenzanalyse wird das nach der enzymatischen Reaktion erhaltene Reaktionsgemisch mit einer gepufferen Lösung einer Verbindung vermischt, die mit Jen Umwandlungsprodukten der Enzymreaktion fluoreszierende Verbindungen bildet. Man kann auch das iTnzym und die zur Herstellung fluoreszierender Verbindur·' en eingesetzte Verbindung miteinander vermischen und die ν rinprobe direkt dem so erhaltenen C ;misch einverleiben. In diesem Falle wird Vanillylglyoxylat und Vanillin sofort nach der Bildung in die entsprechende fluoreszierende Verbindung überführt

Eine besonders bevorzugte Verbindung zur Herstellung fluoreszierender Verbindungen ist 1,2-Diaminonaphthalin. Die Umwandlungsprodukte der Enzymreaktion können in gleicher Weise mit 2,3-Diaminonaphthalin zu fluoreszierenden Verbindungen umgesetzt werden. Diese Verbindungen zeigen jedoch nicht die intensive Fluoreszenz, die den bei der Umsetzung mit 1,2-Diaminonaphthalin erhaltenen Produkten eigen ist. Zur Herstellung fluoreszierender Derivate von Vanillylglyoxylat und Vanillin kann auch Diaminobenzoesäure und Diaminobenzol verwendet werden.

Es wurde festgestellt, daß die Fluoreszenzanalyse etwa 20- bis 40mäl empfindlicher ist als die UV-Absorptionsanalyse. Die Fluoreszenzanalyse erlaubt somit die Bestimmung niedrigerer Konzentrationen von D(-)-HMS als die UV-Absorptionsanalyse. Kombinierte Vanillylglyoxylat-Vanillin-Werte können mit Hilfe der Fluoreszenzanalyse bis zu einer unteren Konzentrationsgrenze von 9,4xl0-⁸m bestimmt werden, während mit Hilfe der UV-Absorptionsanalyse lediglich Konzentrationen bis zu einer unteren Grenze von 4xl0-⁶m nachgewiesen werden können. Demgemäß werden bei der Durchführung der Bestimmung mit Hilfe der Fluoreszenzanalyse geringere Enzymmengen benötigt als bei der UV-Absorptionsanalyse. Die zu untersuchende Probe muß jedoch mit einer ausreichenden Menge des Enzympräparats versetzt werden, um sicherzustellen, daß innerhalb der gewählten Zeit zumindest die geringste nachweisbare Menge von Vanillylglyoxylat und Vanillin gebildet wird. Da die Umwandlungsgeschwindigkeit von D(—)-HMS in erster Linie eine Funktion der Enzymkonzentration ist, :; wird bei niedrigeren Enzymkonzentrationen weniger HMS in Vanillylglyoxylat und Vanillin umgewandelt Zur Bestimmung der in einer bestimmten Urinprobe ursprünglich vorhandenen D(—)-HMS-Konzentration wird die Fluoreszenz der Umwandlungsprodukte

κι gemessen und mit den bei ähnlichen Proben mit bekannten D(—)-HMS-Konzentrationen erhaltenen Werten verglichen, wobei die zuletzt genannten Proben mit derselben Enzymmenge während derselben Zeit umgesetzt wurden. Bei Verwendung geringerer Enzymmengen werden die Kosten des erfindungsgemäßen Verfahrens herabgesetzt, und die Genauigkeit der Bestimmungen nimmt zu, da die durch Trübung der Probe verursachte Störung abnimmt

Die erfindungsgemäß eingesetzte D(—)-Mandelsäuredehydrogenase stammt aus dem Bakterienstamm MB-15 von K. Hosakawa. Dieser Stamm wurde aus der Erde mit Hilfe der Benzoatanreicherung isoliert und als Stamm von Pseudomonas putida A identifiziert Dieser Stamm wurde bei der American Type Culture

25· Collection unter der Nr. ATCC 17 426 hinterlegt. Der vorgenannte Stamm nimmt, soweit bekannt unter den zahlreichen Stämmen "von Pseudomonas putida eine besondere Stellung ein, da er ein sehr stabiles Enzym mit hoher Aktivität bezüglich der erfindungsgemäßen

3d Umwandlung von D(-)-HMS enthält So zeigt z.B.

Pseudomonas putida A Stamm A3.12, ATCC 12 633, nicht diese vorteilhaften Eigenschaften. Pseudomonas putida A ATCC 17 426 wird bei 3O⁰C unter starker Belüftung in einem Mineralienmedium gezüchtet, das ein Gemisch anorganischer Salze, wie Natrium- und Kaliumphosphate, Calciumchlorid und Magnesiumsulfat, und verschiedene organische Verbindungen als einzige Kohlenstoff- und Energiequellen enthält. Das verwendete Mineralienmedium ist in der Arbeit von Hegeman, »Synthesis of the Enzymes of the Mandelate Pathway by Pseudomonas Putida«, Journal of Bacteriology, Band 91 (1966), Seite 1140 bis 1154, beschrieben.

Für die Herstellung des Enzympräparats ist es von Wichtigkeit, daß die Zellen des Mikroorganismus in einem mandelathaltigen Medium gezüchtet werden. Das Mandelat wird üblicherweise in Form eines Gemisches der D- und L-Isomeren eingesetzt. Wenn als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle das Racemat der Mandelsäure eingesetzt wird, wird nur das D-Isomere oxydiert. Das nichtoxydierte L-Mandelat, das zur Herstellung verschiedener Arzneimittel und organischer Verbindungen verwendet wird, stellt ein wichtiges Nebenprodukt dar, das nach üblichen Methoden in einfacher Weise gewonnen werden kann.

Die Züchtung des Mikroorganismus wird so lange durchgeführt, bis kein feststellbarer Anstieg der Trübung der Kluturbrühe mehr eintritt. Auf diese Weise wird sichergestellt, daß die Zellen während der spaten exponentiellen Wachstumsphase geerntet werden. Zur Freisetzung des Enzyms werden dann die Zellwände der geernteten Zellen aufgebrochen. Nach Entfernung der Zellwände wird das Enzym als Suspension in einer rosafarbenen Paste von Zellprotoplasma isoliert. Diese Paste kann ohne einen nachweisbaren Aktivitätsverlust bis zu einem Jahr bei 0°C aufbewahrt werden.

Nach einem bevorzugten Verfahren werden die Zellen in einem Puffer, wie in einem wäßrigen 0,1 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-HCl-Puffer (pH

8,0), suspendiert Die Zellwände werden durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen. Anschließend werden die restlichen ganzen Zellen und die Zelltrümmer bei niedriger Geschwindigkeit z. B. bei 3000 g abzentrifugiert Die überstehende Flüssigkeit wird dann bei hoher Geschwindigkeit z. B. bei 105 000 g, zentrifugiert wobei die Membranfraktion sedimentiert Dieses Sediment das eine geringe Menge lösliches Material enthält wird unter starkem Schütteln wieder in 0,1 m Puffer suspendiert, der zusätzlich 40 Volumprozent Äthylenglycol enthält Die so erhaltene gleichmäßige, rosa bis braun gefärbte Suspension enthält D( — )-Mandelsäuredehydrogenase und dient erfindungsgemäß als analytisches Reagenz. Die D(—)-Mandelsäuredehydrogenase ist genügend aktiv, um die quantitative Umwandlung von D(—)-HMS in die entsprechende Ketosäure bei einer annehmbaren Geschwindigkeit durchzuführen.

Die Bestimmung der bei der enzymatischen Umwandlung gebildeten Menge von Vanillylglyoxylat und Vanillin kann auch mit Hilfe anderer Methoden durchgeführt werden, wenn diese auch komplizierter und zeitraubender sind als die vorstehend beschriebenen Methoden der UV-Absorptionsanalyse und der Fluoreszenzanalyse. Die Reaktionsprodukte können zum Beispiel aus der Mutterlauge durch Papierchromatographie, Dünnschichtchromatographie, Gas-Flüssigkeits-Säulenchromatographie oder Flüssigkeits-Fest-Chromatographie mit hoher Geschwindigkeit oder durch Chromatographie an Ionenaustauschern abgetrennt werden. Die Abtrennung kann auch durch vorhergehende Flüssig-Flüssig-Extraktion, fraktionierte Sublimation oder Destillation, Elektrophorese oder Gegenstromverteilung erfolgen. Wenn Vanillylglyoxylat und Vanillin aus dem Reaktionsgemisch isoliert sind, können diese Verbindungen quantitativ z. B. mit Hilfe der Isotopen-Verdünnungsmethode unter Verwendung eines radioaktiv markierten Produktes und nachfolgender Reinigung und Messung bestimmt werden. Ferner können aus den Umwandlungsprodukten oder deren Derivaten Verbindungen hergestellt werden, die gaschromatographisch bestimmt werden können. Das gebildete Vanillylglyoxylat kann auch weiter gereinigt werden, und die gereinigten Umwandlungsprodukte können mit einer Diazoniumverbindung zu gefärbten Verbindungen umgesetzt werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

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Beispiel 1

A. Herstellung einer Zellpaste von Pseudomonas
putidaA,ATCC17 426

Pseudomonas putida A, ATCC 17 426, wird in 2,7 Liter fassenden Kolben mit 500 ml Medium gezüchtet. Zwei solche Kulturen werden zum Beimpfen von 11 Liter mineralischem Kulturmedium verwendet, das 0,02 m Ammonium-D,L-Mandelat als einzige Kohlenstoffquelle enthält. Die Fermentation wird in 3 Fermentern durchgeführt. Die Generationszeit beträgt bei 30° C 60 Minuten. Die Züchtung wird unter starker Belüftung und schnellem Rühren so lange fortgesetzt, bis die Trübung einen Wert von 250 Einheiten Kolorimeter, versehen mit einem Filter Nr. 66, erreicht. Dann werden etwa 75 Prozent der Kulturbrühe aus den b5 Fermentern entfernt, und die Zellen werden in einer Durchlaufzentrifuge geerrttet. Die Fermenter werden dann mit 8 Liter unsterilem, frischem und vorgewärmtem Kulturmedium gefüllt und die Züchtung der Zellen wird fortgesetzt Dieses Verfahren wird zweimal wiederholt und ergibt insgesamt 250 g feuchte Zellen. Ein Teil der so erhaltenen Zellpaste wird bei — 2C°C tingefroren. Unter diesen Bedingungen kann die Zellpaste lange Zeit ohne nachweisbaren Aktivitätsverlust aufbewahrt werden.

B. Herstellung von D( — )-Mandclsäuredehydrogenase

Die Zellpaste wird in 4 Gewichtsteilen 0,1 m Na₂HPO₄-KH₂PO4-Puffer (pH 6,8) unter heftigem Schütteln suspendiert Die Suspension wird dann in 50-ml-Portionen 20 Minuten in einem 10-kHz-Ultraschallgerät bei maximaler Leistung behandelt Diese Ultraschallbehandlung zur Zerstörung der Zellen wird bei 0 bis 4°C durchgeführt Nach dieser Behandlung wird die Suspension 10 Minuten bei 5000 g zur Entfernung von Zelltrümmern und nichtzerstörten Zellen zentrifugiert Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert und das zurückbleibende Sediment wird verworfen. Die überstehende Flüssigkeit wird dann 90 Minuten in einer Zentrifuge bei 29 000 UpM (etwa 105 000 g) zentrifugiert wobei aus dem Rohextrakt eine Partikelfraktion sedimentiert. Das Sediment wird in kaltem 0,05 in Phosphatpuffer (pH 6,8) suspendiert, und die Surpension wird erneut zentrifugiert. Das so erhaltene Sediment wird in einer geringen Puffermenge suspendiert. Die Suspension wird dann mit einer solchen Menge von Äthylenglycol versetzt, daß dessen Konzentration 40 Volumprozent beträgt.

C. Durchführung der Bestimmung mit Hilfe der
UV-Absorptionsanalyse

Es wird das folgende Puffer-Enzym-Gemisch hergestellt: Die Pufferlösung enthält 0,25 m Citronensäure; der pH-Wert wird mit konzentrierter Natronlauge auf 6,5 eingestellt. Die Enzymlösung ist ein Gemisch von 10 ml des unter B hergestellten Enzympräparats, 15 ml Äthylenglycol und 75 ml Wasser.

Ein Gemisch von 1 ml des Puffers und 1 ml der Enzymlösung wird mit 1 ml einer Urinprobe versetzt, die eine unbekannte Menge von HMS enthält. Das Gemisch wird 2 Stunden bei 37° C in einem Wasserbad inkubiert. Das erhaltene Gemisch wird dann mit 2 ml einer 2 Prozent Natriumdodecylsulfat und 0.15 η NaOH enthaltenden Reagenzlösung versetzt, um das Enzym zu inaktivieren und die Trübung zu verringern. Die so erhaltene Probe wird dann weitere 2 Stunden bei 37° C inkubiert.

Zur Herstellung eines Enzymleerwertes wird 1 ml desselben Urins, 1 ml Puffer und 1 ml eines Enzympräparats, das zur Zerstörung der Enzymaktivität vorher 1 Stunde auf 60° C erhitzt wurde, vermischt. Der Leerwert wird 2 Stunden inkubiert mit 2 ml der Reagenzlösung versetzt und dann weitere 2 Stunden inkubiert.

Die Extinktionswerte der zu bestimmenden Probe und des Leerwertes werden in einem Spektrophotometer gemessen. Die Konzentration von HNiS in der Probe wird nach der nachstehenden Gleichung berechnet:

In dieser Gleichung bedeutet C die Konzentration von HMS, K eine Absorptionskonstante, deren Wert aus Proben mit bekannten HMS-Konzentrationen bestimmt wird, E[A) die Extinktion der zu bestimmenden Probe, £(B) die Extinktion des Enzymleerwertes

und D den Verdünnungsfaktor. Bei 345 nm werden folgende Extinktionen gemessen:

E[A) = 0,968; ^B) = 0,866

Der Verdünnungsfaktor hat einen Wert von 5, und die aus einer Probe mit bekannter Vanillin-Konzentration berechnete Absorptionskonstante beträgt 1/2,65x10⁴. Aus diesen Werten errechnet sich eine D( —)-HMS-Konzentration von 0,193 χ 10-⁴ Mol/Liter.

Beispiel 2

Durchführung der Bestimmung mit Hilfe der
Fluoreszenzanalyse

Gemäß Beispiel 1 wird eine zu bestimmende Probe und ein Enzymleerwert für einen Urin mit unbekannter D( —)-HMS-Konzentration wie nachstehend beschrieben hergestellt:

	Zu bestimmende	Enzymleer
	Probe A	wert B
Urin	0,10 ml	0,10 ml
Puffer¹)	0,10 ml	0,10 ml
Enzymlösung²)	0,10 ml	-
Inaktiviertes Enzym³)	—	0,iö mi

') 0,25 m Citronensäure, deren pH mit Natronlauge auf 6,5 eingestellt wurde, und die anschließend mit soviel Wasser versetzt wird, daß die Citratkonzentration insgesamt 0,15 m beträgt.

²) Gemisch von 10 ml des Enzympräparats gemäß Beispiel 1, 15 ml Äthylenglykol und 75 ml Wasser.

³) Die Enzymlösung wurde 1 Stunde auf 60⁰C erhitzt.

Die Proben werden 2 Stunden in einem Wasserbad von 37° C inkubiert. Anschließend werden die so erhaltenen Gemische mit 5 ml einer Reagenzlösung versetzt, die 1 ml 1,2-Diaminonaphthalin (1 mg/ml in 95prozentigem Propanol), 1 ml einer lOprozentigen wäßrigen Lösung von Natriumlaurylsulfonat und 48 ml einer Pufferlösung vom pH 3,0 (Citratkonzentration 0,05 m) enthält. Die so erhaltenen Gemische werden weitere 2 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wird die Fluoreszenz jeder Probe bei einer Anregung von etwa 330 mn mit einer erwarteten Emission von 400 nm mit einem Fluorimeter gemessen. Die D(—)-HMS-Konzentration der zu bestimmenden Probe wird nach der nachstehenden Gleichung berechnet:

C=L- M ■ D [F[A)-F[B)]

In dieser Gleichung bedeutet Cdie Konzentration, D den Verdünnungsfaktor, L eine Umwandlungskonstante, M einen Meßfaktor des Fluorimeters, F[A) den bei der Messung der Lösung A erhaltenen, den Dunkelstrom übersteigenden numerischen Wert und F[B) den

ίο bei der Messung der Lösung B erhaltenen, den Dunkelstrom übersteigenden numerischen Wert. Der Wert für L wird unter Verwendung einer Probe mit bekannter HMS-Konzentration zu 1/1,18 χ 10⁶ bestimmt. Der Wert für M beträgt 0,03 und für D 5,3/0,1.

Die gemessenen Werte für F[A) beziehungsweise F[B) betragen 40,9 beziehungsweise 26,4. Hieraus errechnet sich eine HMS-Konzentration von 0,196 χ 10~⁴ Mol/Liter.
Bei beiden Experimenten wurde entsalztes Wasser

verwendet. Das Äthylenglykol wird dem Enzympräparat als Konservierungsmittel zugegeben, um das Wachstum von Bakterien, den Enzymabbau und das Zusammenklumpen während der Umsetzung zu verhindern. Bei dem fluorimetrischen Versuch wird als Enzymleerwert erhitztes, nicht umgesetztes Enzym verwendet, da eine geringe Trübung die Stärke der Fluoreszenz beträchtlich beeinflußt. Die Zugabe von Natriumlaurylsulfonat und Natriumdodecylsulfonat erfolgt deshalb, um den Großteil des Enzyms während der anschließenden weiteren 2stündigen Inkubation in Lösung zu bringen.

Die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Bestimmungsmethoden sind äußerst einfach und problemlos durchzuführen. Sie können mit relativ unkomplaziertem Gerät und von Personen ohne spezielle Vorkenntnisse durchgeführt werden. Diese Methoden lassen sich rasch an automatische Analysenverfahren anpassen und sind daher insbesondere für kinetische Untersuchungen, zur Bestimmung vieler Proben und für Screening-Untersuchungen geeignet, die mit den derzeit verfügbaren Methoden nicht oder nur auf umständliche Weise durchgeführt werden können. Abgesehen von dem Enzympräparat wird lediglich eine geringe Anzahl üblicher Laboratoriumsreagenzien benötigt.

Es ist keine andere Methode bekannt, die es erlaubt, auf enzymatischem Wege in vitro D( —)-HMS mit der erfindungsgemäßen hohen Spezifität in die zu bestimmenden Umwandlungsprodukte zu überführen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist deshalb vollkommen frei von Störungen, mit denen kolorimetrische Methoden häufig behaftet sind.

Erfindungsgemäß kann auch D( —)-HMS im Serum oder im Serum und im Urin bestimmt werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Aktives Enzympräparat, das stereospezifisch D(—)-4-Hydroxy-3-metl«oxymandelsäure oxydiert hergestellt durch Züchten von Pseudomonas putida A ATCC 17 426 in einem Mandelat enthaltenden Medium, Aufbrechen der Zellen, Abtrennen der Zelltrümmer und Isolieren des Enzympräparats.

2. Enzympräparat nach Anspruch 1, hergestellt durch Aufbrechen der Zellen mit Hilfe einer Ultraschallbehandlung.

3. Enzympräparat nach Anspruch 1, hergestellt durch Aufbrechen der Zellen in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 8,0, Abzentrifugieren der ZeUtrümmer, Isolieren einer Membranfraktion und Suspendieren dieser Fraktion in einem Gemisch einer Pufferlösung und ÄthylenglykoL

4. Verwendung des Enzympräparats nach Anspruch 1 zur stereospezifischen Bestimmung von D( — )-4-Hydroxy-3-methoxymandelsäure in biologischen Flüssigkeiten.