DE2116264A1

DE2116264A1 - Verfahren zum Herstellen von Gemischen natürlicher Aminosäuren

Info

Publication number: DE2116264A1
Application number: DE19712116264
Authority: DE
Inventors: Gianni; Ivrea Mondino. Angelo; Bongiovanni (Italien). M
Original assignee: Istituto di Ricerche Biomediche, Antoine Marxer S.p.A., Loranze dlvrea, Turin (Italien)
Priority date: 1970-04-04
Filing date: 1971-04-02
Publication date: 1971-12-30
Also published as: GB1293508A; CH542180A; IL36482A0; FR2085840A1; FR2085840B1; NL7104345A; ES389894A1

Description

D^!pl.-!ng. W. PAAP g MÖNCHEN 22,

Öipl.-Ing. H. MITSCHERLICH s.*,,***,,,*w

K. GUNSCHMANN ^ ^|m"»

Dr. r.r. nal. W. KÖRIEÄ . 2. April 1971

PATENTANWÄLTE

INSTITUTO DI RICERCHE BIOMEDICHE ANTOINE MARXER S.p.A.

Loranze d'Ivrea (Turin) Italien

Patentanme!dung

Verfahren zum Herstellen von Gemischen natürlicher Aminosäuren

Die Erfindung betrifft die Herstellung von Gemischen natürlicher Aminosäuren aus Proteinmaterial, insbeson dere, jedoch nicht ausschließlich» aus Proteinen tierischen Ursprungs, durch Säurehydrolyse dieses Materi als in einem wäßrigen, ein« Mineralsäure als Hydrolyseagens enthaltenden Medium.

Ein ZwecH der Erfindung ist die Angab« eines industriell ausführbaren Verfahrene, das von verschiedenen, stlndig verfügbaren Proteinatoffen ausgeht, vor alle» von Stoffen,

die anderenfalls unverwertbar wären (beispielsweise die zahlreichen Nebenprodukte oder Abfälle der Fisch- und Fleischindustrie u. dgl.), um aus ihnen Gemische natürlicher Aminosäuren in L-Konfiguration herzustellen, die z.B, als Zusatzfutter für Zuchttiere oder für beliebige andere industrielle Zwecke verwertbar sind. Ein weiterer Zweck der Erfindung ist die Angabe eines Verfahrens, mit dem als Endprodukt ein Gemisch von L-Aminosäuren erhältlich ist, das so weit wie möglich die Verhältnisse der Bedeutung der einzelnen in dem Originalmaterial enthaltenen einzelnen Aminosäuren bewahrt, so daß zum Beispiel dieses Gemisch anschliessend ganz von dem Tier, dem es verabreicht wird, aufgenommen werden kann» Weiter« Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung·

Erfindungsgemäß wird das filtrierte, die zur Hydrolyse benutzte Mineralsäure und die Aminosäuren enthaltende

Hydrolysat mit Wasser verdünnt und ohne weitere

Trennung und, Neutralisierung der Mineralsäure einem Ionenaustauschvorgang mit einem Kationenaustauscherharz vom Typ der Bulfonsäure unterworfen wird, worauf die an dem Harz festgehaltenen Aminosäuren mittels einer wäßrigen Ammoniaklösung, deren Konzentration höchstens 2,5S Gewichtsprozent NH₃ (oder NH^OH 1,5 HJ beträgt, eluiert werden und das Eluiat durch Verdampfen bei niedrigem Druck von Ammoniak befreit wird. Die so erhaltene wäßrige Lösung von Aminosäuren wird dann ihrem jeweiligen Verwendungszweck entsprechend weiterbehandelt· D* Tryptophan durch die Sturehydrolyse atrstört wird ι muft diese Aminosäure dem Gemisch der gewonnenen Aminosäuren bieder zugefügt werden (wenn die wesentlichen Verhältnisse beibehalten werden müssen).

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In voller Vollständigkeit läßt sich das Verfahren folgendermaßen beschreiben:

(I) · Säurehydrolyse

(II) . - Filtration

(III) - Verdünnen

(IV) - Ionenauetauech

(V) - Eluierung

(VI) - Entfärben

(VII) - Filtration

(VIII) - Entfernen von NH. und Konzentrierung CIX) - Zerstäbungstrocknung

Das der Säurehydrolyse zu unterwerfende Material kann ganz beliebig sein, kann beispielsweise umfassen: Soja* mehl, Sojaprotein, getrocknetes Blutmehl, getrocknetes Fleischmehl, Leber und/oder allgeaein tierische Organe, frischer Abfall, frische Fischreste, Frischfisch, ge»" trocknetes Horn« und Klauenmehl, Federn, Eieralbumin, MilchalbUBin usw..

Die Hydrolyse wird vorzugsweise mit verdünnter Schwefelsäure ausgeführt, nn kann aber auch mit verdünnter Salzsäure arbeiten. Die Wasseraenge in der Hydrolysesubstanz (einschließlich des in dem Ausgangsmaterial enthaltenen Wassers) wird vorzugsweise so groß gewählt, daß die Säurekonzentration(auf HjSO^bezogen)» zwischen 10 und *»Q Gewichtsprozent, vorzugsweise zwischen 20 und HO Gewichtsprozent liegt. Wird unter erhöhtem Druck gearbeitet, so kann die Säurekonzentration bis auf 5 Ge* wichtsprozent gesenkt werden. Dauer, Säurekonzentration und Temperatur der Hydrolyse hängt von der Art der zu hydrolysierenden Proteinkette ab, und die Parameter ;^;^ : werden so gewählt, daÄ in dem filtrierten Hydrolysat

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ein Verhältnis nicht kleiner als 0,85 zwischen dem Amino-Stickstoff (nach Sörensen) und dem Gesamt-Stickstoff (nach Kjeldahl) besteht.

Beispiel 1

60 1 Wasser, 20 1 H₂SO^ vom spezifischen Gewicht 1,84 (96 %) und 30kg Fischmehl mit folgenden typischen Gewichtsanteilen:

Feuchtigkeitsgehalt 5 - 7 %

Protein 63 - 72 %

Lipide 5 - 12 %

Asche 10 - 23 %

stickstoffreie Extrake 3 - 4 %

Rohfaser 0 %

wurden in einen elektrisch beheizten Glaskolben von 200 1 Inhalt gegeben; der Kolben besaß ein Rührwerk, Schwerkraftkühler, Einfüllöffnung und am Boden einen Ablaßhahn.

Das Gemisch wird 20 bis 2U Std. lang im Kochen (109⁰C) gehalten. Hach dem Abkühlen wird das Hydrolysat unter Vakuum in einem Kassettenfilter gefiltert, und es werden ungefähr 80 1 Säurefiltrat gewonnen.

Die Hydrolyse kann auch in einem mit Rührwerk versehenen emaillierten Autoklaven vorgenommen werden. Bei einem Druck von 1,8 bis 2 at (Siedetemperatur 130 bis 133°C) beträgt die für die Hydrolyse erforderlicne Zeit etwa 3 Stunden.

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wie erwähnt, tfird das gefilterte Säurehydrolysat dem Ionenaustausch onne vorherige Entfernung oder Neutralisierung der für die Hydrolyse verwendeten Mineralsäure zugefünrt. Das Hydrolysat wird jedoch ausreichend mit entionisiertem Wasser verdünnt, entweder um die Dichte unter die des Ionenaustauscherharzes herabzusetzen, oder um bestimmte Austauschbedingungen herzustellen, wie weiter unten beschrieben wird. Allgemein gesagt wird bei dem Ionenaustauschvorgang eine optimale Ausbeute erzielt, wenn, ausgehend von einer üblichen Konzentration der Säure (20 bis 40 %) in dem Hydrolysemedium, das filtrierte Hydrolysat mit dem 2- bis 20-fachen seines Anfangsvolumens verdünnt wird.

Als Kationenaustauscherharz wird vorisugsweise ein Polystyrols ulfonat-Harζ mit ungefähr 8 % verknüpfenden Divinylbenzol-ßindungen, zum Beispiel Amberlite IR 120, Kastei C 300 oder Walcite HCR, verwendet, im allgemeinen in einer Perkolatorsäule. Die Prozentzahl der verknüpfenden Bindungen in dem Harz kann gegenüber dem genannten Wert variiert werden, um während der Perkolationsphase mit dem verdünnten Hydrolysat den "Verlust" spezieller Aminosäuren zu fördern oder zu hindern, was erwünscht sein kann, um das Endresultat der Zusammensetzung des Aminosäuregemischs einzustellen. Weiter unten wird gezeigt, daß das Harz stark sauer sein (mit HCl regeneriert) oder aber in Ammoniuniform vorliegen muß. Unabhängig von dem Verdünnungsgrad wird die Perkola tionsrate auf einem Wert zwischen 0,6 und 1,0 1 verdünnten filtrierten Hydrolysats je Stunde und Liter Harz gehalten. Vorzugsweise wird in der Säule 1 Liter Harz zum Halten von 100 bis 150 g freien Aminosäuren im Hydrolysat benutzt.

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Bei den Verfahrensbedingungen werden Schwefelsäure und (während der Hydrolyse gebildete) Desaminierungsprodukte von dem Harz nicht zurückgehalten, während andererseits durch Dekarboxylierung (auch während der Hydrolyse) entstandene Abbauprodukte und Ausgangsprodukte von dem Harz zusammen mit den Aminosäuren festgehalten, jedoch nicht notwendigerweise daraus eluiert werden, wenn die Konzentration des Ammoniumeluats unter 2,55 Gewichtsprozent NH « liegt. Vorzugsweise liegt diese Konzentration jedoch nicht unter 1,7 Gewichtsprozent NH₃.

Beispiel 2

Es wird eine Säule mit einem Innendurchmesser von 32 cm und einer Höhe von 3 m benutzt, die 160 1 Harz in Säureform enthält; das Harzbett ist 2 m hoch. 80 1 Hydrolysat nach Beispiel 1 werden mit entionisiertem Wasser auf 1600 1.verdünnt (Verdünnung 1 : 20) und mit einem Durchsatz von 2 l/min, durch die Säule gegeben (entspricht 1,75 1/Std. je Liter Harz). Nach 800 Minuten wird 50 Min. lang mit einem Durchsatz von 2 l/min entionisiertes Wasser durch die Säule gepumpt, um das in der Säule verbliebene Hydrolysat zu entfernen. Schließlich werden 100 1 entionisiertes Wasser in der entgegengesetzten Richtung durch die Säule geleitet (Durchsatz 2 l/min), um jede Spur bestimmter, an der Spitze des Harzbettes festgehaltener Substanz zu entfernen oder das Bett selbst absitzen zu lassen, denn das Bett könnte durch Aufquellen der Harzkörnchen während des lonenaustauschs mit dem Hydrolysat gestört sein.

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Beispiel 3

Der Verfahrensablauf ist der gleiche wie nach Beispiel 2, jedoch werden dO 1 Hydrolysat benutzt, die durch Verdünnung im Verhältnis 1 : 2 mit entionisier· tem Wasser auf 160 1 vermehrt werden.

Beispiel

Hierbei wird die in Beispiel 2 angegebene Apparatur benutzt, jedoch wird das Harz in Ammoniumform verwendet. Das Verfahren läuft nach Beispiel 3 ab.

Bei jedem der drei beschriebenen Beispiele werden die L-Aminosäuren von dem benutzten Kationenaustauscherharz festgehalten, abgesehen von einem (kaum zu vermeidenden) Verlust, der einige Prozent bei den Beispielen 3 und H ausmacht und einen etwas grösseren Wert (6 bis 7 %) bei dem Beispiel 2 erreicht (wo das Hydrolysat stark verdünnt wurde). Eine besondere Neigung zu Verlusten wurde im Beispiel 2 bei Glutamin- und bei Asparaginsäure festgestellt, möglicherweise wegen ihrer stärkeren Acid ität im Vergleich zu den anderen, im Hydrolysat enthaltenen Aminosäuren. Es scheint sich daher zu empfehlen, mit nur massiger Verdünnung, die nicht über etwa 10 : 1 hinausgeht, zu arbeiten, ausser wenn ein gewisser Verlust der beiden genannten Säuren erwünscht sein sollte, um das endgültige Gemisch der zu gewinnenden Aminosäuren abzugleichen. Wegen der Art des eingesetzten Proteinmaterials, das Substanzen enthalten oder während der Hydrolyse erzeugen kann, die so sehr an dem Harz haften, daß zwischen jeweils zwei Arbeitszyklen eine Regeneration erfolgen muß, kann es offen-

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sichtlich erforderlich werden, auf die in den Beispielen 2 und 3 beschriebenen Verfahren zurückzugreifen, die eine Säureregeneration zwischen zwei aufeinanderfolgenden Arbeitszyklen vorsehen.

Die folgenden Beispiele 2a, 3a und 4-a bilden eine Weiterentwicklung der zugeordneten Beispiele 2, 3 und

Beispiele 2a und 3a

Zum Eluieren der Aminosäuren aus der Säule wird eine wäßrige Lösung von NH^OH 1,5 N (2,55 Gewichtsprozent NH-) vorbereitet, indem gasförmiges Ammoniak in Blasen durch entionisiertes Wasser in einem mit Rührer versehenen Behälter aus rostfreiem Stahl oder Polyesterharz geleitet wird. Die Konzentration der Lösung wird acidimetrisch überwacht.

Die Ammoniaklösung wird der Säule in einer Menge von 2 l/min zugegeben. Die Reaktion verläuft exotherm, und die Wärmefront (die mit der Front der von dem Harz eluierten Aminosäuren zusammenfällt) erreicht eine Temperatur von etwa 45⁰C. 90 Min. nach Beginn des Eluirens beginnt das Eluat merkliche Mengen Aminosäuren zu enthalten und wird nun gesammelt. In der 165. Minute (entspricht 330 1 Ammoniaklösung) wird die Lösung durch entionisiertes Wasser ersetzt, und das Sammeln des Eluats wird bis zur 210. Minute (90 1 entionisertes Wasser) fortgesetzt. Die gesamte gesammelte Menge ammoniakalischen Aminosauren-Eluats beträgt 210 1.

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Dann wird die Säule im Gegenstrom mit entionisertem Wasser gewaschen. Nach dem Absitzen des Harzes erfolgt die Regenerierung durch Perkolieren mit 120 1 10 %iger Salzsäure (Durchsatz 2 l/min) und anschlieesendes Waschen mit 120 1 entionisertem Wasser (Durchsatz 2 l/min).

Beispiel

Das Verjähren gleicht dem nach den Beispielen 2a und 3a bis auf das Gegenstromwaschen in entionisertem Wasser. In diesem Augenblick ist die Säule (ohne Säureregeneration) fertig zur Benutzung in einem neuen Zyklus (Perkolation mit Hydrolysat).

In allen obenbeschriebenen Fällen erfordert das Ammoniakeluat üblicherweise eine Entfärbung, die durch Zugabe von Bleichkohle zu dem Eluat (240 1) herbeigeführt werden kann. So werden beispielsweise 3,85 kg Bleichkohle zugegeben, die Suspension mindestens eine halbe Stunde heftig gerührt und dann schnell filtriert. Die Rührzeit darf nicht zu lange ausgedehnt werden im Hinblick auf das Ausmaß, in dem die Kohle im allgemeinen die aromatischen Aminosäuren adsorbiert, weshalb es immer nützlich ist, es von Zeit zu Zeit je nach der Güte der verwendeten Kohle und dem Ausgangsmaterial für die Aminosäuren zu überprüfen.

Die Entfernung des Ammoniaks und das Konzentrieren des Eluats erfolgen am besten in einem unter Vakuum arbeitenden Zyklon-Konzentrator mit einer auf etwa 30 C erwärmten Windung. Aus dem Zyklon wird ein Brei

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mit einem Aminosäuregehalt von etwa 70 Gewichtsprozent ausgetragen. Der Brei kann in der anfallenden Form verwendet oder er kann getrocknet werden (vorzugsweise in einem Sehne11trockner), nachdem der Anteil der einzelnen Aminosäuren ermittelt worden ist und nach der möglichen Zugabe von Tryptophan und/oder weiteren Aminosäuren und/oder Aminosäuregemischen, die in der beschriebenen Weise, aber aus unterschiedlichen Proteinen gewonnen worden sind, je nach der Endzusammensetzung, die durch die beabsichtigte Verwendung des Gemische selbst bestimmt wird. Die Menge der bei jedem Zyklus des beschriebenen Verfahrens erhältlichen L-Aminosäuren beläuft sich auf etwa 50 bis 55 % der aus dem Ausgangsmaterial theoretisch zu gewinnenden Menge. Die nachstehende Tabelle erläutert die bei unterschiedlichem Ausgangsmaterial erzielbaren Resultate.

Tabelle:

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- li -

Der Hydrolyse unterworfenes Protein-Material

Zusammensetzung
des Aminosäuren-Gemischs (in %)

Herings- Eier- Fleisch- Leber- Soja

mehl Federn albumin mehl mehl mehl

A s par agin säure	8	,9	6	,8	10	8,1	7,1	Il	,1
Threonin	4	,0	4	,6	4,1	4,0	3,4	3	,4
Serin	3	,8	9	,1	5,9	6,7	3,6	4	,7
Glutaminsäure	13	,8	9	,5	13,7	15,1	13,0	17	»5
Prolin	4	,8	13	,9	4,1	11,8	7,4	5	,6
GIyζin	6	,9	8	,6	4,3	14,0	7,1	4	,8
Alanin	7	,-9	5	,1	7,6	8,6	7,6	4	,9
Cystein		/	8	,5	1,4	/	1,1		/
Valin	5	,5	9	,3	7,2	4,8	6,6	3	,7
Methionin	3	,9		/	4,6	1,8	3,1	1	,1
Isoleucin	4	,7	5	,9	5,7	3,1	5,2	3	,2
Leucin	9	,4	10	,2	10,1	7,4	12,0	7	,3
Tyrosin	2	,9	1	,6	2,6	1,4	1,2	1	,0
Phenylalanin	3	,7	2	,3	4,9	2,8	5,9	2	,7
Lysin	11	,7	1	,9	8,0	5,4	/	17	,4
Histidin	2	,8	0	,6	2,3	1,8	9,0	6	,7
Arginin	5	,1	1	,8	3,1	1,8	6,6	4	,9

Patentansprüche:

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Claims

- 12 -

Patentansprüche

. Verfahren zur Herstellung von Gemischen natürlicher Aminosäuren aus Proteinmaterial durch Säurehydrolyse dieses Materials in einem wäßrigen, eine Mineralsäure als Hydrolyseagens enthaltenden Medium und nacnfolgende Trennung des Aminosäuren-Gemischs von dem Hydrolysat,

dadurch gekennzeichnet, daß das filtrierte, die zur Hydrolyse benutzte Mineralsäure und die Aminosäuren enthaltende Hydrolysat mit .Wasser verdünnt und einem Ionenaustauschvorgang mit einem Kationenaustauscherharz vom Typ der Sulfosäure unterworfen wird, worauf die an dem Harz festgehaltenen Aminosäuren mittels einer wäßrigen Ammoniaklösung, deren Konzentration höchstens 2,55 Gewichtsprozent NH- beträgt, eluiert'werden und das Eluat durch Verdampfen bei niedrigem Druck von Ammoniak befreit wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dail das filtrierte Hydrolysat 2- bis 20-fach verdünnt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Kationenaustauscherharz aus ßiystyrolsulfonat mit etwa 8 % verknüpfenden Divinylbenzol-Bindungen besteht,

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4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrolyseine dium aus verdünnter Schwefelsäure besteht, deren Konzentration zwischen 10 und 40 Gewichtsprozent (auf H₂SO^ bezogen) liegt.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet ,daß das filtrierte und verdünnte iiydro-Iysat durch eine Säule des Austauscherharzes mit einem Durchsatz geleitet wird, der 0,6 bis 1,0 1 filtriertem, verdünntem Hydrolysat je Stunde und Liter Harz entspricht.
6, Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Austauscherharz in Säureform benutzt wird.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Austauscherharz in Ammoniumform benutzt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Austauscherharz nach der Elution ohne Regeneration zum Trennen weiterer Mengen Aminosäuren benutzt wird.

Der Patentanwalt

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