DE2057401B2

DE2057401B2 - Verfahren zur isolierung von nativem, hochgereinigtem plasminogen

Info

Publication number: DE2057401B2
Application number: DE19702057401
Authority: DE
Priority date: 1970-11-21
Filing date: 1970-11-21
Publication date: 1977-04-21
Also published as: GB1305504A; CA988421A; DE2057401A1

Description

Es sind bereits Verfahren bekannt, mit denen man Plasminogen durch Alkoholfällung des Serums und Extraktion des Niederschlages mit Mineralsäuren isolieren kann. Dabei ist auch schon die Chromatographie an Carboxymethylcellulose als Verfahrensschritt angewandt worden. Diese Verfahren sind jedoch zeitraubend, umständlich und teuer. Wegen der schlechten Ausbeuten sind sie für eine gewerbliche Anwendung ungeeignet.

Es ist aⁿ.ch schon bekannt, daß ε-Aminocapronsäure, p-Aminomethylbenzoesäure und 4-Aminomethyl-cyclohexancarbonsäure-(l) eine antifibrinolytische Aktivität besitzen, weil sie die Aktivierung des Plasminogen durch Streptokinase oder Urokinase hemmen.

Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist ein Verfahren zur Isolierung von nativem hochgereinigtem Plasminogen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Plasminogen aus Plasma oder Serum oder einer Plasminogen enthaltenden Plasma- oder Serumfraktion an einen wasserunlöslichen Träger, der eine Aminocarbonsäure mit einer in ε-Stellung zur Carboxylgruppe befindlichen Aminogruppe kovalent gewunden enthält, absorbiert, unspezifische Begleitproteine durch Wa- so sehen mit einer wäßrigen Pufferlösung vom pH 5,5 bis 6,5 und einer Molarität von 0,05 bis 0,15 entfernt, anschließend das Plasminogen mit einer Pufferlösung vom pH-Wert 2,0 bis 3,5 oder 9,0 bis 10,2 und einer Molarität von 0,05 bis 0,15, welche außerdem eine Aminocarbonsäure der oben beschriebenen Art in einer Molarität von 0,05 bis 0,1 enthält, elutiert und danach gegebenenfalls durch Ausfällen mit Ammopiumsulfat anreichert, anschließend in an sich bekannter Weise, zum Beispiel durch Dialysieren entsalzt und lyophil trocknet.

Als Ausgangsmaterial für das Plasminogen dient Plasma, Serum oder eine Plasminogen enthaltende Plasma- oder Serumfraktion menschlichen oder tierischen Ursprungs.

Als wasserunlöslichen Träger verwendet man ein Kopolymerisat aus Styrol oder Äthylen oder Butylen oder vorzugsweise Propylen und Maleinsäureanhydrid im Verhältnis 1 :1. welches in Gegenwart einer Aminocarbonsäure mit einem ahphaischen oder aromatischen Diamin, beispielsweise Pentamethylendiamin, Hexamethylendiamin oder o-Phenyldiamin, querver netzt ist Im Falle des Styrols kann mit Divmylbenzol vernetzt werden. _

Die Umsetzung der Ammocarbonsaure mit dem Träger erfolgt über die Reaktion eines- Aminogruppe mit%weils einem Maleinsäureanhydridrest, wobei eine neptidartige Bindung entsteht Unter »Aminocarbonsäuren« sind dabei solche zu verstehen, die eine Aminogruppe in ε-Stellung zur Carboxylgruppe enthalten wie dies beispielsweise bei der ε-Aminocapronsäure der4-Aminomethyl-benzoesäure oder der 4-Aminomethyl-cyclohexancarbonsäure der Fall ist; ebenso kommen natürlich auch andere Aminocarbonsäuren in Frage bei denen der sterische Abstand zwischen der Aminogruppe und der Carboxylgruppe ein ähnlicher ist wie bei den obengenannten. Am besten geeignet sind jedoch bei den obengenannten. Am besten geeignet sind jedoch Aminocarbonsäuren, die außer der Aminogruppe noch eine weitere reaktionsfähige Gruppe, die für die Bindung an die als Adsorbens vorgesehene Verbindung geeignet ist beispielsweise eine Amino- oder Hydroxylgruppe in α-, β-, Y- oder ό-Stellung der aliphatischen Kette bzw. in ortho- oder meta-Stellung des Ringes enthalten. Dieser Fall liegt beispielsweise beim Lysin vor Ein unter Verwendung einer solchen Aminocarbonsäure hergestellter Träger enthält sowohl freie Carboxyl- als auch freie Amino- bzw. Hydroxylgruppen; die mit seiner Hilfe erzielten Ausbeuten an Plasminogen sind höher und die Spezifität ist größer.

Mit Hilfe des beschriebenen wasserunlöslichen Trägers läßt sich Plasminogen aus wäßrigen Lösungen vom pH-Wert 5,0 bis 7,8 in guten Ausbeuten adsorbieren. Die Adsorption wird vorzugsweise im Batch-Verfahren durchgeführt jedoch kommt auch das Säulenverfahren in Betracht.

Zur Entfernung unspezifischer Proteine verwendet man beispielsweise Dinatriumhydrogenphosphat-citronensäurepuffer, Phosphatpuffer oder Citratpuffer.

Als saure Eluentien für die Elution des Plasminogen eignen sich beispielsweise die Puffergemische Glycin-Salzsäure und Natriumcitrat-Salzsäure; verwendet man ein alkalisches Elutionsmittel, so kommen beispielsweise Ammoniaklösung, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanlösung oder Dinatriumhydrogenphosphatlösung in Frage. Die Molarität der Elutionsmittel liegt im allgemeinen bei 0,05 bis 0,15 und vorzugsweise bei 0,1; höhere Konzentrationen lassen sich zwar ebenfalls verwenden, doch ist dies nicht sinnvoll, da die Eluentien anschließend wieder entfernt werden müssen. Als Verdrängungsmittel enthalten die Eluentien außerdem eine der obengenannten Aminocarbonsäuren, vorzugsweise Lysin, und zwar in einer Molarität von 0,05 bis 0.1.

Das Plasminogen enthaltende Eluat wird vor der Aufarbeitung vorteilhafter Weise einer Vorkonzentration unterzogen. Dazu stellt man es neutral und fällt das Plasminogen mit Ammonsulfat, vorzugsweise durch Dialyse gegen eine gesättigte Ammonsulfatlösung. Durch eine nachfolgende Dialyse gegen eine Salzlösung vom pH-Wert 8-9 und der Molarität 0,1 vorzugsweise Dinatriumhydrogenphosphatlösung, lassen sich die bei der Elution verwendeten Aminocarbonsäuren entfernen. Abschließend wird die so gereinigte Plasminogenlösung durch Dialyse gegen eine physiologische Lösung, beispielsweise 0,9%ige Natriumchloridlösung, Ringerlösung oder Natriumphosphatlösung, vom pH-Wert 6,5

bis 7,5 und einer Molarität von etwa 0,05 bis 0,15 auf physiologische Bedingungen eingestellt

Das erfinöungsgemäße Verfahren ermöglicht eine reitsparende Herstellung von Plasminogen in guten Ausbeuten. Das derart gewonnene Plasminogen ist rein, wie in der Immunelektrophorese nachgewiesen wurde. Die Wirksamkeit wird in Christensen-Einheiten (Chr-E) gemessen (vgL J. din. Invest 28,1963 (1949).

Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet es, ausgehend von einem nicht vorgereinigten Plasminogen oder sogar von einer Plasminogen enthaltenden Plasmaoder Serumfraktion ein reines natives (d. h. unverändertes) Plasminogen zu erhalten. Die Verwendung eines vorgereinigten Ausgangsmaterials ist nicht erforderlich.

Beispiel 1

100 mg Copolymerisat aus Propylen und Maleinsäureanhydrid werden in 0,15-m Kaliumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 angeteigt und mit 0,15-m Kaliumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 in einem Gesamtvolumen vom 5 ml fein suspendiert. Dann setzt man unter Rühren 10 mg Hexamethylendiamin zu, die in 1 ml des oben angegebenen Phosphatpuffers gelöst werden. Anschließend werden 5 ml einer 2,5%igen Kaliumphosphatgepufferten Lysinlösung vom pH 7,5 dazu pipettiert und der Ansatz 24 Stunden lang bei +4⁰C gerührt. Dann wird das unlösöiche Vernetzungsprodukt durch Zentrifugation gewonnen, mit physiologischer Kochsalzlösung Lysinfrei gewaschen, mit destilliertem Wasser gespült und lyophil getrocknet.

100 mg des lyophilisierten Vernetzungsproduktes werden nach Anteigen mit einigen ml Humanplasma in 70 ml Humanplasma suspendiert, der pH-Wert mit verdünnter Salzsäure auf 7,0 eingestellt und der Ansatz 30 Minuten bei 37° C gerührt. Das Adsorbens wird dann in der Zentrifuge abgeschleudert und mit 0,15 m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 6,4 so lange gewaschen, bis die Waschwasser proteinfrei sind. Die Elution des Plasminogens erfolgt mit 25 ml einer 0,1-m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanlösung vom

pH-Wert 10,0, die 0,05 m Lysin enthält. Das Eluat wird mit normaler Salzsäure neutralisiert und unter Rühren gegen das gleiche Volumen gesättigter Ammonsulfatlösung dialysiert. Die Fällung wird abzentrifugiert, in 2—3 ml 0,1-m Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung aufgenommen, zweimal 12 Stunden gegen jeweils das lOOfache Volumen der gleichen Lösung und anschließend gegen 0,1-m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 dialysiert.

Als Endprodukt erhält man 3 ml einer 0,31%igen Plasminogenlösung mit 37 300 Christensen-Einheiten (Chr-E)/ml und 12 000 Chr-E/mg Protein. Das Ausgangsmaterial besitzt einen Plasminogentiter von 4000 Chr-E/ml und 53 Chr-E/mg Protein.

Insgesamt wird von 280 000 Chr-E/ml ausgegangen und es werden 112 000 Chr-E/ml zurückgewonnen, was einer Ausbeute von 40% entspricht.

Aus den angegebenen Zahlen ergibt sich eine Anreicherung um den Faktor 1 :200 durch das erfindungsgemäße Verfahren. Nach der Adsorption sind im Ausgangsplasma noch 99 Chr-E/ml enthalten, das sind 2,2% des Ausgangswertes.

Beispiel 2

4 Liter Humanplasma werden mit verdünnte-Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und mit 5,7 g eines lyophilisierten, nach Beispiel 1 hergestellten Copolymerisates aus Propylen und Maleinsäureanhydrid, das kovalent gebundenes Lysin enthält und mit Hexamethylendiamin vernetzt wurde, 30 Minuten lang unter Rühren bei 37° C inkubiert. Das plasminogenhaltige Adsorbens wird durch Zentrifugation abgetrennt, mit 0,15-m Natriumphosphatpuffer pH 6,4 proteinfrei gewaschen und anschließend mit 1100 ml einer 0,1-m Ammoniaklösung, die 0,05-m Lyson enthält, eluiert. Durch Neutralisation mit verdünnter Salzsäure, Konzentrieren des Eluates über eine 50% Ammonsulfatsättigung, Auflösung des Ammonsulfatrückstandes in 90 ml einer 0,1-m Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung, Dialysieren gegen die gleiche Lösung und anschließend gegen 0,15-m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 erhält man 100 ml einer 0,4%igen Plasminogenlösung mit 47 000 Chr-E/ml. Die Ausbeute beträgt 29%, bezogen auf 4 Liter Plasma mit einer Aktivität von 4000 E/ml. Die spezifische Aktivität des so isolierten Plasminogens beträgt 11 800 Chr-E/mg. Die Plasminogen-Aktivität des adsorbierten Plasmas beträgt 70

ίο 70 Chr-E/ml.

Beispiel 3

70 ml Rinderplasma werden unter Rühren bei 37° C mit 100 mg des nach Beispiel 1 hergestellten Lysin-vernetzten Copolymeren 30 Minuten lang inkubiert. Das durch Zentrifugation zurückgewonnene Adsorbens wird mit 0,15-m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 6,4 proteinfrei gewaschen und dann mit 25 ml einer 0,15-m Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung, die 0,05-m ε-Aminocapronsäure enthält, eluiert. Das Eluat wird gegen 0,1-molare Tris-Lösung und nach Entfernen der ε-Aminocapronsäure gegen 0,1-m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 dialysiert. Dabei werden 22 ml einer 0.1%igen Lösung gewonnen, die pro ml die dreifache Aktivität vom Rinderplasma hat, somit 94°'ü der Aktivität des eingesetzten Rinderplasmas enthält. Die vergleichende Aktivitätsbestimmung wurde nach optimaler Aktivierung ies Plasminogens durch Urokinase, eines Plasminogenaktivators aus menschlichem Harn, an plasminogenfreiem Rinderfibrinogen durchgeführt.

Beispiel 4

100 mg eines Copolymeren, aus Propylen und Maleinsäureanhydrid im Verhältnis 1 :1 werden in 5 ml 0,15-m Kaliumphosphatpuffer vom pH-Wert 7.5 fein suspendiert. Im Abstand von 2 Minuten werden 10 mg Hexamethylendiamin in 1 ml und 94 mg ε-Aminocapronsäure in 5 ml Kaliumphosphatpuffer dazupipettiert.

Nachdem der Ansatz 12 Stunden bei +4°C gerührt wurde, wird das unlösliche Gel abzentrifugiert, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, bis es keine ungebundene ε-Aminocaptonsäure mehr enthält, anschließend mit Wasser gewaschen und lyophilisiert.

100 mg des lyophilisierten ε-Aminocapronsäure-haltigen Copolymeren werden mit 70 ml Humanplasma bei einem pH-Wert von 7,0 und 37°C unter Rühren 30 Minuten lang inkubiert. Das plasminogenhaltige Copolymere wird durch Zentrifugation zurückgewonnen, mit

0,15-m Nalriumphosphatpuffer vom pH-Wert 6,4 proteinfrei gewaschen und das Plasminogen mit 25 ml einer 0,05-m Ammoniaklösung, die 0,05 m ε-Aminocapronsäure enthält, eluiert. Das neutralisierte Eluat wurde durch 50% Ammonsulfat-Sättigung konzentriert und gegen 0,1-m Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung dialysiert. Nach Entfernung der für die Elution verwendeten ε-Aminocapronsäure wird eine weitere Dialyse gegen 0,1-m Natriumphosphatpuffer vom

pH-Wert 7,5 angeschlossen. Auf diese Weise erhält man 3,5 ml einer 0,2%igen Plasminogenlösung mit 12 000 Chr-E/ml bzw. 6100 Chr-E/mg Substanz. Die Ausbeute beträgt 16%, bezogen auf das Aus^angsmaterial von 70 ml mit 3800 Chr-E/ml.

Beispiel 5

100 mg Copolymeres aus Propylen und Maleinsäureanhydrid werden in 5 ml 0,15-m Kaliumphosphatpuff«·, pH 7,5, fein suspendiert. Anschließend werden 1 ml einer l%igen Hexamethylendiaminlcsung und 2 bis 3 Minuten später 5 ml einer 2%igen Lösung 4-Aminomethylcyclohexancanbonsäure-(l) in die Suspension eingerührt Der Ansatz wird 12 Stunden bei +4⁰C gerührt und das entstandene Gel durch Zentrifugation isoliert, ij mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, bis es keine freie 4-AminomethyIcyclohexancarbonsäure-(l) mehr enthält, darauf mit Wasser salzfrei gespült und lyophilisiert

70 ml Humanplasma werden mit verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 5,5 titriert und mit 100 mg ties nach obiger Vorschrift hergestellten Adsorbens 30 Minuten lang bei 37° C unter Rühren inkubiert. Das Adsorbens wird anschließend abzentrifugiert und mit 0,15-m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 6,4 gewaschen, bis im Waschwasyer kein Protein mehr nachgewiesen werden kann. Dann wird das Plasminogen mit 25 ml einer 0,1-m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethanlösung, die 0,05-m Lysin enthält, eluiert. Das Lysin wird durch Dialyse gegen eine 0,1-m Tris-Lösung entfernt und danach die erhaltene Lösung gegen einen 0,1-m Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5, dialysiert. Als Endprodukt erhält man 20 ml einer 0,25%igen Lösung mit 6700 Chr-E/ml. Bezogen auf das Ausgangsplasma mit 4800 Chr-E/ml beträgt die Ausbeute 134 00ö Chr-E = 39%.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Isolierung von negativem hochgereinigtem Plasminogen, dadurch gekennzeichnet, daß man Plasminogen aus Plasma oder Serum oder einer Plasminogen enthaltenden Plasma- oder Serumfraktion an einen wasserunlöslichen Träger, der eine Aminocarbonsäure mit einer ε-Stellung zur Carboxylgruppe befindlichen Amino- ίο gruppe kovalent gebunden enthält absorbiert, unspezifische Begleitproteine durch Waschen mit einer wäßrigen Pufferlösung vom pH 5,5 bis 6,5 und einer Molarität von 0,05 bis 0,15 entfernt anschließend das Plasminogen mit einer Pufferlösung vom pH-Wert 2,0 bis 3,5 oder 9,0 bb 10,2 und einer Molarität von 0,05 bis 0,15, welche außerdem eine Aminocarbonsäure der oben beschriebenen Art in einer Molarität von 0,05 bis 0,1 enthält, eluiert und danach gegebenenfalls durch Ausfällen mit Ammoniumsulfat anreichert, anschließend in an sich bekannter Weise, zum Beispiel durch Dialysieren, entsalzt und lyophil trocknet.