DE2038110B - Verfahren zur Gewinnung von Hellebrin - Google Patents

Description

In den Wurzeln von Helleborus-Arten ist das herzwirksame Glykosid Hellebrin enthalten, dem wegen Seiner Mittelstellung zwischen Strophanthus- und Scillaglykosiden erhöhtes therapeutisches Interesse zukommt.

Es ist bekannt, daß man aus Helleborus niger ein digitalisähnlich wirkendes Glykosid gewinnen kann, indem man wäßrige Helleborus-Auszüge mit Kohle behandelt, das Kohleadsorbat mit organischen Lösungsmitteln extrahiert und den erhaltenen Extrakt einer weiteren Reinigung unterwirft (deutsche Patentschrift 605 073). Der Kohlebehandlung kann auch eine Bleifällung vorausgehen, wobei das überschüssige Blei mit Phosphat (HeIv. Chim. Acta, 26, S. 1353 [1943]) oder mit Sulfat (Farmacia [Bukarest], S. 407 [1959]) entferht wird. Dieses Verfahren ist nicht befriedigend.

Die Nachteile der Adsorptivfällung sollen sich nach einem neueren Verfahren vermeiden lassen, wenn Helleborus-Extrakte sukzessiv mit verschiedenen Lösungsmitteln behandelt werden, (tschechoslowakische Patentschrift 101 577). Dieses Verfahren erfordert jedoch nicht nur einen großen Aufwand an Lösungsmitteln, sondern die Nacharbeitung hat ergeben, daß das Verfahren in der Regel nicht zu kristallisierbarem Hellebrin führt.

Auch eine chromatographische Reinigung von HeIIeborus-Extrakten an Aluminiumoxid in Verbindung mit einer vorhergehenden Bleifällung (Med. prom. SSR, 18, S. 12 [1964]) oder ohne eine solche (Planta med., 9, S. 64 [1961]) sind beschrieben worden. Die Hellebrinausbeute beträgt jedoch nur 0,04 °/₀.

Günstigere Ausbeuten lassen sich durch Chromatographie an Kieselgel erzielen (Z. Naturforschg., 20b, S. 707 [1965]); Acta Pharm. Jug., 17, S. 29 [1967]). Bei den bisher verwendeten Kieselgelen handelt es sich jedoch um feinkörnige Kieselgele (Korngröße 0,01 bis 0,04 mm), die nur mäßige Laufgeschwindigkeiten zulassen. Auch ist die Kapazität von Kieselgelsäulen im allgemeinen nur halb so groß wie die von Aluminiumoxidsäulen gleicher Größe. So ist diese Trennmethode bisher nur zur Gewinnung kleiner Hellebrinmengen geeignet.

Bei dem bekannten Reinigungsverfahren unter Verwendung von Kieselgel müssen daher große Mengen Kieselgel eingesetzt werden. Wie sich aus den angeführten Literaturstellen ergibt, ist beispielsweise die 50- bis lOOOfache Menge Kieselgel, bezogen auf 1 Teil vorgereinigten Extrakt, erforderlich. Trotzdem ist das so erhaltene Hellebrin noch nicht genügend rein, und es muß häufig eine zusätzliche Reinigung durch präparative Dünnschichtchromat&fpaphie angeschlossen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Hellebrin durch Chromatographie von hellebrinhaltigen Extrakten an Kieselgel und ist dadurch gekennzeichnet, daß ein grobkörniges Kieselgel mit einer Körnung vun 0,15 bis 10 mm verwendet wird.

Nuch dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, bezogen auf 1 Teil in gleicher Weise vorgereinigten Extrakt, nur etwa die 5- bis lOfache Menge Kieselgel erforderlich. Außerdem ist das erhaltene Produkt bereits so

ίο rein, daß eine zusätzliche dünnschichtchromatographische Reinigung nicht mehr notwendig ist.

Diese bessere Trennwirkung von grobkörnigem Kieselgel bei hellebrinhaltigen Extrakten, ist in hohem Maße überraschend, denn auf Grund der wesentlich geringeren Oberfläche des grobgekörnten Kieselgels

war ein erheblich schlechterer Trenneffekt zu erwarten.

Der technische Fortschritt des erfinde';gsgemäßen

Verfahrens liegt in der Einsparung von Kieselgel und

der größeren Laufgeschwindigkeit. Weiterhin ist es im

Gegensatz zu dem bekannten Verfahren nun auch möglich, die Extrakte in konzentrierter oder sogar direkt in fester Form auf die Säule zu geben, ohne daß die Gefahr einer Verstopfung besteht, die Laufgeschwindigkeit nennenswert beeinträchtigt oder die Trennung verschlechtert wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren bedient sich der bekannten und üblichen adsorptiven Reinigungs- und Trennmethoden (z. B. Chromatographie), wobei ein Extrakt der Droge eingesetzt wird. Bei dem Extrakt kann es sich um einen Trockenextrakt, einen halbfesten Extrakt oder um einen flüssigen Extrakt handeln. Für den flüssigen Extrakt kommen als Lösungsmittel solche in Frage, in denen Hellebrin löslich ist, wie z. B. äthanolhaltiges Chloroform, Methanol, die üblichen Alkohole usw.

Die Herstellung des hellebrinhaltigen Extraktes, insbesondere eines Extraktes aus Helleborus-Arten erfolgt in der üblichen und bekannten Weise.

Es ist zweckmäßig, wenn der Extrakt wie üblich vorgereinigt wird. Eine solche Vorreinigung besteht im allgemeinen aus folgenden Schritten:

a) Die Entfettung kann erfolgen mit aliphatischen und aromatischen Kohlenwasserstoffen, aliphatischen Halogenkohlenwasserstoffen oder Äther, wie z. B. mit Benzol, Chloroform, Petroläther, Diäthyläther.

Es ist günstig, die Vorreinigung mit der Entfettung zu beginnen. Es ist aber auch möglich, die Ent- _₀ fettung nach dem Schritt b) vorzunehmen.

b) Extraktion mit Alkoholen oder Alkohol-Wasser-Gemischen, anschließende Entfernung des alkoholischen Lösungsmittels und Überführung in die wäßrige Phase.

c) Extraktion des Hellebrins aus der wäßrigen Phase mit einem organischen Mittel, beispielsweise aromatischen Kohlenwasserstoffen, Halogenkohlcnwasserstoff-Alkohol-Mischungen usw. Dieser fix*

, trakt wird dann ganz oder teilweise eingedampft.

Zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird beispielsweise ein in üblicher Weise vorgereinigter hellebrinhaltiger Extrakt in konzentrierter Form auf eine Säule mit grobkörnigem Kieselgel gegeben und es mit einer Halogenkohlenwasserstoff -Alkohol- Mischung entwickelt, wobei der größte Teil der Batlaststoffe mit höherem Rf-Wert als Hellebrin eluiert wird. Für die anschließende Eluierung der Hellebrinfraktion

ist es im allgemeinen zweckmäßig, die hydrophile Komponente des Eluierimgsgemisches (Alkohol) zu erhöhen bzw., falls vorher beispielsweise mit Halogenkohlenwasserstoffen eluiert wurde, nun eine hydrophile Komponente zuzusetzen.

Die Ballaststoffe mit niedrigerem Rf-Wert als HeIIebrin verbleiben auf der Säule.

Anstatt der Säulenchromatographie sind auch andere chromatographische Ausführungsformen, wie z. B. präparative Schichtchromatographie, möglich.

Als Eluierungsmittel kommen beispielsweise in Betracht: Aliphatische Halogenkohlenwasserstoffe, Mischungen aliphatischer Halogenkohlenwasserstoffe mit aliphatischen Alkoholen, Ester aliphatischer Säuren mit aliphatischen Alkoholen, Ester-Alkohol-Mischungen, Ester-Alkohol-Wasser-Mischungen, Benzol, Halogenbenzole, Alkylbenzole, Alkylbenzol-Alkohol-Mischungen, Ester-Pyridin-Mischungen, Halogenkohlenwasserstoff- Pyridin- Mischungen, Halogenkohlenwasserstoff - Alkohol - Pyridin - Mischungen, Ester-Pyridin-Wasser-Mischungen, Mischungen von Benzol, Halogenbenzolen und Alkylbenzolen mit Pyridin, aliphatische Ketone, Keton-Wasser-Mischungen, Keton-Benzol-Mischungen, Keton-Benzol-Eisessig-Mischungen. Selbstverständlich sind auch andere Mischungen aus den oben angegebenen Komponenten möglich. Das optimale Mischungsverhältnis der Komponenten ist dabei jeweils in einem gesonderten Vorversuch zu ermi' ήη.

Es handelt sich bei den Eluierungsmitteln um die bekannten flüssigen organischen Mittel, wobei die Kohlenstoffzahl der Halogenkohlenwasserstoffe sowie der einzelnen Alkylreste dieser Mittel vorzugsweise niedrig ist und z. B. zwischen 1 und 6 liegt.

Das erfindungsgemäß verwendete Kieselgel ist eine synthetisch hergestellte, hochporöse amorphe Kieselsäure in Form von harten Körnern mit einer Körnung von 0,¹5 bis 10 mm. Besonders günstig ist eine Körnung von 0,15 bis 0,30 mm. Der Wassergehalt kann beispielsweise bis zu 10°/₀ betragen. Die spezifische Oberfläche kann bis 650 m²/g betragen. Im allgemeinen liegt sie etwa bei 400 m²/g. Das Schüttgewicht kann bis 650 g/I betragen. Günstig ist ein Schüttgewicht von 450 bis 500 g/l.

Die Ermittlung der hellebrin-angereicherten Fraktionen erfolgt zweckmäßig dünnschichtchromatographisch.

Eine besonders günstige Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in folgendem:

Das Hellebrin-Eluat wird vom Lösungsmittel befreit und der Rückstand längere Zeit (z. B. mehrere Stunden) in Äthanol erhitzt. Die Erhitzungsdauer ist dabei abhängig von dem Hellebringehalt und der qualitativen Zusammensetzung der Begleitstoffe; sie liegt im allgemeinen etwa zwischen 15 Minuten und 5 Stunden. Der zweckmäßigste Temperaturbereich liegt beispielsweise zwischen 50 und 120°. Hierbei kristallisiert das Hellebrin spontan aus, Zweckmäßig wird die drei- bis

zehnfache Menge Alkohol, bezogen auf das Hellebrin, verwendet.

Gegebenenfalls noch anhaftende letzte Spuren von Verunreinigungen können durch einfaches I Jmkristallisieren des Hellebrins, beispielsweise aus Alkohol-

xo Wasser-Gemischen, entfernt werden.

Beispiel

100 kg getrocknete Helleborus-Wurzeln werden pulverisiert und mit Petroläther entfettet. Die entfettete Droge wird mit Methanol erschöpfend extrahiert. Der Rückstand des methanolischen Extraktes wird in Wasser gelöst und mit Chloroform-Äthanol (2:1) ausgezogen. Die Chloroformphase wird bis auf einen

ao Extraktivstoffgehalt von etwa 50 % eingedampft. Das Konzentrat wird auf eine Säule mit 50 kg Kieselgel gegeben (Korngröße 0,15 bis 0,30 mm, SiO₂-Gehalt 95 bis 96°/₀, Konstitutionswasser etwa A⁰I₀, spezifische Oberfläche etwa 400 m²/g, Porendurchmesser etwa 90 Angstrom, spezifische Wärme 0,22 cal/g/°C, Schüttgewicht 450 bis 500 g/l, wahres spezifisches Gewicht 2,3, Benetzungswärme mit Wasser etwa 18 cal/g, Porenvolumen 0,7 bis 0,8 ml/g). Mit Chloroform/Methanol (90:10) wird so lange eluiert, bis dünnschichtchroma-

tographisch Hellebrin im Eluat nachweisbar ist. Sodann wird die Hauptmenge des Hellebrins mit Chloroform/Methanol (85:15) von der Säule gelöst. Die hellebrinreichen Fraktionen werden vereinigt und zur Trockne gebracht. Der Rückstand wird einmal aus

Methanol/Äthylacetat kristallisiert. Der Hellebringehalt des erhaltenen Produktes ist 74,5% (Messung der Extinktion bei 300 Nanovkter). Auskochen mit Äthanol: Die vereinigten und zur Trockne gebrachten Hellebrinfraktionen werden ohne vorhergehende Umkristallisation mit tier fünffachen Menge absoluten Alkohols unter Rückfluß erhitzt, bis das Hellebrin in Form eines feinkristallinen Niederschlags ausfällt. Nach dem Erkalten wird das Rohhellebrin abgenutscht und aus Methanol-Wasser umkristallisiert. Messung der Extinktion bei 300 Nanometer zeigt, daß das so erhaltene Produkt zu 100°/₀ aus reinem Hellebrin besteht

Zum Vergleich wurde nach der gleichen Methode die Reinheit einer Hellebrinprobe bestimmt, die nach dem in Acta Pliarm. Jug., 17, S. 29 (1967), beschriebenen Verfahren (Chromatographie an feinkörnigem Kieselgel und einmalige Kristallisation aus Methanol/ Äthylacetat) gewonnen wurde. Das hiernach erhaltene Produkt bestand nur zu 42,5% aus Hellebrin.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gev 'nnung von HeUebrin durch adsorptive Reinigung von hellebrinhaltigen Extrakten an Kieselgel, dadurch gekennzeichnet, daß ein Kieselgel mit einer Körnung von 0,15 bis 10 mm verwendet wird.

2. Verfahren nach einem oder mehreren der vorangegangenen Ansprüche, dadurcn gekennzeichnet, daß der nach Entfernen des Eluierungsmittels erhaltene Rückstand längere Zeit mit Äthanol erhitzt wird.