DE2028134B2

DE2028134B2 - Verfahren zur gewinnung carbonsaeurereicher zuckersirupe

Info

Publication number: DE2028134B2
Application number: DE19702028134
Authority: DE
Inventors: Toshio; Sato Yoshinori; Okayama Miyake (Japan)
Original assignee: Hayashibara Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Co Ltd
Priority date: 1969-06-06
Filing date: 1970-06-08
Publication date: 1978-01-12
Also published as: BE751525A; GB1320165A; DE2028134C3; JPS5533862B1; FR2049969A5; NO140679B; NL7008095A; CA951666A; ZA703745B; NO132237B; SE368564B; NO140679C; NO740302L; DE2028134A1; CH525252A; NO132237C

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung karbonsäurereicher Zuckersirupe, wobei man in Form von viskosen Zuckerlösungen vorliegende Stärkehydrolysate, die Gemische von Mono- und Oligosacchariden, hautpsächlich Glukose und/oder Maltose und Maltotriose, sowie Dextrine enthalten, zwecks Oxidierung der Saccharide zu den Aldonsäuregemischen, vorzugsweise zu Giukonsäure und/oder Maltobion- und Maltotrionsäure, während oder nach beendeter Stärkeverzuckerung mit Mikroorganismen behandelt, die Glukosedehydrogenase bilden.

Bekanntlich werden als Bestandteile von Nahrungsmitteln organische Säuren, wie Zitronen-, Malon- und Fumarsäure verwendet und mit Stärkesirup, Glukose, Rohrzucker u. dgl. gemischt bzw. gestreckt. Durch diese getrennte Einverleibung der sauren und 4(1 süßen Bestandteile wird zwar der Wert der Nahrungsmittel erhöht, jedoch werden gleichzeitig auch die Kosten beträchtlich vergrößert.

Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht in einer technisch und wirtschaftlich vereinfachten Gewinnung von für Nahrungsmittel als Zusatzstoffe geeigneten Rohstoffen, in denen die sauren und süßen Bestandteile bereits in der gewünschten Weise miteinander kombiniert sind.

Zur Lösung dieser Aufgabe dient ein Verfahren der eingangs angegebenen Art, das erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet ist, daß man als GIukose-Dehydrogenase bildende Mikroorganismen die Stämme Pseudomonas taetrolens (IFO 3460) und Pseudomonas fragii (IFO 3458) anwendet.

Der Stamm Pseudomonas taetrolens (IFO 3460) ist unter der gleichen Registriernummer früher auch als Pseudomonas graveolens bezeichnet worden.

Die nach dem Verfahren der Erfindung erhaltenen Stärkesirupe mit hohem Gehalt an Karbonsäure, d. h. von Sirupen, die Gemische einerseits von Mono- und Oligosacchariden, hauptsächlich Glukose und/oder Maltose und Maltotriose, sowie Dextrine, andererseits Aldonsäuren wie Glukon-, Maltobion- und Maltotrionsäure enthalten, sind durch diese Zusammensetzung vorzüglich als sauer-süße genießbare Nährmittelzusatzstoffe anwendbar.

Das ältere deutsche Patent 2023997 hat ein Verfahren zur Herstellung von modifiziertem, mindestem partiell hydrolisiertem höhermolekularen Saccharid material, das eine Kombination von Zuckeralkohol und Glukonsäureeinheiten enthält, mm Gegenstand das durch die Kombination folgender Maßnahmer gekennzeichnet ist: partielle Hydrolyse einer wäßrigen Aufschlämmung von Stärke, insbesondere Kar toffel- oder Maisstärke, zu einem DE-Wert von 5 bi; 60%, vorzugsweise bis zu 50%, durch saure und/odei enzymatische Hydrolyse unter Bildung von Mono-Di- und höheren Oligosacchariden und von Dextrinen partielle spezifische Oxidation der reduzierten Glukoseeinheiten des hydrolysierten Produktes zu Glukonsäureeinheiten in einem Ausmaß von 20 bis 70% vollständige oder teilweise Hydrierung der vorhandenen reduzierten Glukoseeinheiten. Als bevorzugte) Weg zur Durchführung der spezifischen Oxidation isi der mikrobiologische Weg angegeben, z. B. mit Hilfe von Pilzen, wie Aspergillus niger, oder von Essigsäurebakterien, wie Acetobacter spboxidans.

Gegenüber dem Verfahren des älteren deutscher Patentes unterscheidet sich die vorliegende Erfindung durch die Verwendung der angegebenen Mikroorganismenstämme.

Im übrigen ist über die Oxidation einzelner Mono-. Di- und Trisaccharide wenig veröffentlicht worden. Seit langem bekannt ist die elektrolytische und biochemische oder enzymatische Oxidation von Glukose zu Giukonsäure. Die Oxidation von Maltose mit Brom ist wegen der geringen Ausbeute und sekundärer Zersetzung unwirtschaftlich. Die von F. H. Stodola und Mitarb, beschriebene Gewinnung von Maltobionsäure durch Vergärung von Maltose mit Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas (siehe »Journ. Biolog. Chemistry«, 171, 213-221) gibt nur leidliche Ausbeuten.

Die Untersuchung der Oxydationswirkungen der beanspruchten Pseudomonas-Bakterien auf die in Stärkesirupen vorliegenden Gemische von Di- und Trisacchariden ergab überraschenderweise eine befriedigende Oxydation derselben zu Bion- und Trionsäuren auch im technischen Maßstäbe. Desgleichen wurde festgestellt, daß zu dem gleichen Zweck ebenfalls die enzymatische Oxydation unter Anwendung der aus den beanspruchten Pseudomonas-Bakterien erhaltenen Enzyme anwendbar ist, daß die gleichen Ergebnisse auch bei Zugabe der Enzyme während der Gewinnung der Stärkesirupe in wirtschaftlich befriedigender Weise erhältlich sind, daß man durch Wahl der Zusammensetzung und des durch Enzym- oder Säureeinwirkung regelbaren Abbaugrades der Ausgangssirupe bzw. deren nichtverzuckerten Zwischenprodukte verschiedenartig zusammengesetzte Kombinationen von Aldonsäure- und Saccharid-Gemischen in Form unterschiedlich viskoser Sirupe erhält und daß die Gewinnung derartiger Endprodukte lediglich etwa ein Zwanzigstel der Unkosten für die Herstellung der bisher üblichen Einzelprodukte benötigt und zudem im großtechnischen Maßstab durchgeführt werden kann.

In den erfindungsgemäßen Fertigprodukten ist die Sauerkeit organischer Säuren mit der Süßigkeit und dem Geschmack von Oligosacchariden sowie der durch die anwesenden Dextrine bewirkten Viskosität in mannigfaltiger Weise miteinander kombinierbar, wobei der »Körper«, die »Rundung« und die »Milde« der Sirupe je nach Wunsch in weiten Grenzen eingestellt werden kann. Die Endprodukte verleihen Nähr-

mitteln die gewünschte Viskosität, verbessern deren Beschaffenheit und Gefüge sowie erteilen ihnen ein zusätzliches Gewicht und Volumen.

Das erfindungsgemäße Kombinationsverfahren hat den zur Anwendung für einen wirtschaftlich durchführbaren industriellen Prozeß ausschlaggebenden Vorteil, daß für den Oxydationsvorgang wahlweise Ferment- oder Enzymmethoden und daß enzymatische Methoden gleichzeitig mit den für den Stärkeabbau anwendbaren hydrolytischen Enzymen benutzt werden können, wobei von besonderem industriellen Vorteil ist, daß bei Wahl der enzymatischen Methode einerseits die Zuckerkonzentration im Bereich von 20 bis 30% liegen kann, andererseits für die Oxydation eine Belüftung mit Luft oder Sauerstoff ausreicht und der übliche Zusatz eines Wasserstoff-Akzeptors unnötig ist.

Die Stärkezuckersirupe

Anwendbar sind Ausgangssirupe verschiedener Dextroseäquivalentwerte (D.E.), erhältlich durch saure und/oder enzymatische Umwandlung verschiedener Stärken ober- oder unterirdischen Ursprungs, z. B. von Mais, wachsartigem Mais, Amylomais, Weizen, klebrigem Reis, Sago, Tapioka, Weiß- und Süßkartoffel. Zwecks Gewinnung von als Aldonsäuren, hauptsächlich Bion- und Trionsäuren enthaltenden Sirupen geht man von stark maltosehaltigen Sirupen aus, die mittels α-, β-, Gluko- oder Isoamylasen bzw. «-1,6-Glukosidasen bereitet sind.

Der Abbaugrad bzw. der D.E.-Wert und die Zukkerzusammensetzung der als Ausgangsstoffe benutzten Stärkesirupe richtet sich weitgehend nach der beabsichtigten Verwendung, und diese hängt ihrerseits von der Sauerkeit der Endprodukte ab. Beispielsweise sind Sirupe mit hohem D.E.-Wert und starkem Gehalt an niedermolekularen Zuckern für Anwendungen geeignet, bei denen eine starke Säuerlichkeit benötigt wird. Ist ein besonders hoher Säuregehalt erwünscht, so geht man von einem stark glukosehaltigen Sirup von hohem D.E.-Wert oder von einem mit Säuren gewonnenen Sirup von hohem Zuckergehalt aus. Ist der Geschmack der Endprodukte ein hauptsächliches Erfordernis, so sind stark maltosehaitige Sirupe mit hohem Di- und Trisaccharidgehalt vorzuziehen.

Sirupe mit über 60% Maltose und Maltotriose, aber unter 10% Glukose, stellt man leicht durch Verflüssigung einer Stärkeauf schlämmung mit einer Säure oder a-Amylase und anschließende Verzuckerung mit aus Wejzenkleie bereiteten reinen /3-Amylase (vgl. GB-PS 1130398) her. Sirupe mit 70 bis 98% Maltose und Maltotriose sind gewinnbar durch Hochtemperatur- ' gelatinierung verschiedener Stärkeaufschlämmungen (z.B. nach Patentanmeldung P 1916741.0) oder durch Verflüssigung mit einem Verflüssigungsenzym wie a-Amylase bis zu einem niedrigen D.E.-Wert und anschließende Verzuckerung mit einer Kombination von /3-Amylase und einer a-l,6-GIukosidase (Isoamylase), wobei der Maitosegehalt weitgehend sowohl durch die Reaktionszeit wie auch die zugesetzte /3-Amylase-Menge regelbar ist. Als j3-Amylase dient z. B. die in Weizenkleie, Sojabohnen und Süßkartoffeln vorliegende.

Der Oxydationsvorgang

Als Oxydationsenzyme erwiesen sich von den untersuchten Stämmen der Pseudomonas-Gattung P. taetrolens (IFO 3460) und P. fragii (IFO 3458) als besonders geeignet. Mit diesen Enzymen werden die reduzierenden Zucker fast vollständig oxydiert; es verbleiben Restzucker in Mengen zwischen 0,5 und 0,1%.

Die Pseudomonas-Stämme kultivierte man bei einer Zuckerkonzentration von 5 bis 15% auf einem Maisquellflüssigkeit, Harnstoff, KH₂PO₄ und MgSO₄ enthaltenden Medium 40 bis 50 Stunden bei 25 bis 30° C, nachdem die Lösung mit CaCO₃ neutralisiert war. Die Kulturflüssigkeit wird sodann geschleudert, wobei man die Zellen sammelt, falls sie als Enzymquelle wiederverwendbar sind.

Die Enzymaktivität dieser Zellen bestimmte man zweckmäßig folgendermaßen: Eine Mischung von 200 μ MoI Phosphat-Pufferlösung vom pH 5,6, 20 μ MoI Maltose und 0,5 μ Mol 2,6-Dichlor-indophenoI-Natrium wurde unter Zusatz einer mit Ultraschall behandelten Zellsuspension bis zu einem Gesamtvolumen von 6,0 ml 10 min bei 30" C behandelt und anschließend der Extinktionskoeffizient des Reaktionsproduktes mit Licht der Wellenlänge von 590 μ gemessen, wobei die Wirksamkeit an der Stelle, an welcher die Abnahme des Koeffizienten 0,10 erreicht, mit 10 Einheiten bewertet wurde; auf dieser Grundlage betrug die Aktivität zwischen 130 und 150 Einheiten je mg trockener Zellen.

Die enzymatische Oxydation der Stärkezucker wird erfindungsgemäß vorzugsweise wie folgt durchgeführt:

Ein 10- bis 30%iger Stärkesirup wurde auf pH 5 bis 8 und die Zellsuspension auf pH 6,5 eingestellt, worauf man auf je 1 g des Stärkezuckers im Sirup 15 bis 25 mg Suspension, trocken gerechnet, zumischte und das Gemisch unter Belüftung bei etwa 30° C unter starkem Rühren oxydierte. Während der Neutralisation mit CaCO₃, NaOH od. dergl. wurde beim pH 5 bis 8 die Umsetzung fortgesetzt. Nach 20-bis 40stündiger Reaktion bei 30 bis 40° C war der Restzucker fast abgebaut. Es wurde gefunden, daß zu diesem Zeitpunkt der Zusatz eines Färbemittels od. dgl. als Wasserstoffakzeptor, wie sie in der Literatur genannt sind, für den Reaktionsablauf unwesentlich ist. Obwohl für die Kultur eine Zuckerkonzentration von etwa 10% am wirksamsten ist, kann eine Erhöhung der Konzentration auf 20 bis 30% im Falle der enzymatischen Umsetzung vom industriellen Standpunkt günstig sein.

Oxydierte man in der oben angegebenen Weise einerseits Maltotriose, die durch Zersetzung von Pullulan mit Pullulanase (a-l,6-Glukosidase) erhalten war, und trennte dann die Probe papierchromatographisch, oxydierte man andererseits eine Sirupprobe durch Kultivieren oder enzymatisch und behandelte sie mit einem Kationaustauschharz, so zeigten die erhaltenen Säuregemische, daß Glukose und Maltose des Stärkesirups vollständig zu Glukon- und Maltobionsäure, die reine Maltotriose und diejenige im Stärkezuckersirup dagegen größtenteils zu Trionsäure oxydiert war. Die papierchromatographische Prüfung ergab, daß im Oxydationsprodukt von Maltotriose nur eine zu vernachlässigende Zuckermenge übrigblieb, während im oxydierten Stärkesirup keine Spuren von Restzucker wie Glukose oder Maltose mehr vorlagen; dies zeigt, daß fast die ganze Triose und die niederen Zucker oxydiert waren. Die entweder kultivierte oder oxydierte Zuckerlösung wurde mit Kationaustauschharz entionisiert, dann mit Aktivkohle entfärbt und schließlich unter vermindertem Druck zu einem färb-

losen transparenten Produkt konzentriert.

Eine Verkürzung der Gesamtverfahrensdauer und einen wirtschaftlichen Vorteil bewirkt die gleichzeitige Durchführung des Stärkeabbaues und der Oxydation, wie dies nachstehend beispielsweise an der Gewinnung eines maltosereichen Stärkesirups beschrieben wird:

Eine Stärkelösung, die mit einer Verflü-.sigungsamylase bis zu einem niedrigen D.E.-Wert verflüssigt und zwecks Viskositätsherabsetzung der Einwirkung ^!(l von ß-Amylase unterworfen war, wurde 15 bis 20 Stunden mit einer bei niedrigem pH stabilen, rt-1,6-Glukosidase bei 45° C behandelt und die über 70% Maltose enthaltende Lösung von 35 bis 40° C nach Zusatz eines oxydierenden Enzyms unter Belüftung und Rühren etwa 20 Stunden kultiviert. In einer Gesamtzeit von 30 bis 40 Stunden fand die Bildung eines maltosereichen Stärkesirups und gleichzeitig deren Oxydation zu Glukon-, Maltobion- und Maltotrionsäurcn statt. Die papierchromatographische Analyse -<> zeigte, daß die Trisaccharide und die niederen Saccharide sowohl im erhaltenen Sirup wie auch in dem Zweistufenverfahren der Verzuckerung und der Oxydation unterworfenen Produkte fast gänzlich oxydiert waren. Gab man das oxydierende Enzym während einer ausreichenden Erzeugung von Maltose zu, so wurde ein geradkettige Aldonsäuren, wie Maltobion- und Maltotrionsäuren, enthaltendes Produkt gewonnen. Aus 70 bis 95% Maltose enthaltenden Stärkesirupen gewann man in hoher Ausbeute i" Oxydationsprodukte mit nur '/-,„ der Unkosten der bisherigen Herstellungsverfahren.

Da der Säuregehalt und der Geschmack der erhaltenen Stärkesirupe durch Regelung des Gehalts an Maltose und Maltotriose mittels der enzymatischen r> Einwirkung während des Verzuckerungsvorganges einstellbar ist, kann man den gewünschten Geschmack durch Regelung des Gehalts an geschmackbildenden Bion- und Trionsäuren wie auch der Sauerkeit des Sirups als Ganzes erzielen. Demzufolge gibt ein mal- -40 tosereicher Stärkesirup ein 50 bis 95% Bion- und Trionsäuren enthaltendes Produkt, ein üblicher zukkerreicher Stärkesirup dagegen über 50% eines Gemisches von Glukon- mit Bion- und Trionsäuren.

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Beispiel 1
Biochemische Maltoseoxydation

Eine 25%ige Aufschlämmung gereinigter Maisstärke wurde bei pH 5,0 und 160° C unter Rühren zu einer homogenen, viskosen, gelatinierten Lösung 3d vom D.E. 20 erhitzt, diese dann schnell auf 50° C abgekühlt, 1 Stunde mit 25 Einheiten einer «-1,6-Glukosidase unter Rühren behandelt urd hierauf auf 45° C gekühlt. Nach Zusatz von 20 Einheiten/g Stärke (nachfolgend mit »E/g St« abgekürzt) /3-Amyläse wurde 40 Stunden beim pH 6,0 behandelt, die erhaltene Flüssigkeit gereinigt und entfärbt.

Gleichartige Lösungen erhielt man beim Zusetzen von /3-Amylase und «-1,6-Glukosidase in anderer Reihenfolge oder gleichzeitig. Beim Kombinieren der wi Enzyme mit einer Säure, «-Amylase oder einem anderen Verflüssigungsmittel wurden zahlreiche, verschieden zusammengesetzte Stärkesirupe gewonnen, wie dies z. B. in der Patentanmeldung P 1 916726.1 beschrieben ist. b5

Die vorstehend erhaltene verzuckerte Lösung versetzte man auf je 100 g Zucker des Trockengewichtes mit einem auf 1000 ml mit Wasser verdünnten Gemisch von

10 ml Maiseinweichflüssigkeit

0,6 g KH₁PO₄

0.25 g MgSO₄ · 7 H₂O,

sterilisierte die Lösung durch 10 min langes Erhitzen bei 120³ C, mischte ihr dann aseptisch 10 m! einer vorsterilisierten 20%igen Harnstofflösung und 25 g durch dreimaliges Trockenerliitzen sterilisiertes CaCO₃ zu, inokulierte sie hierauf mit Pseudomonas taetrolens (IFO 3460) und kultivierte 70 Stunden bei 30° C unter Belüftung und Rühren mit 400 U/min. Als Entschäumer wurde Sojabohnenöl benutzt. Nach beendeter Kultivierung schleuderte man die Zellen ab, die weiterhin als Enzymquelle verwendet wurden; je Trockengewicht gewann man etwa 2 g Zellen, deren Aktivität 150 Einheiten/mg betrug. Die überstehende Flüssigkeit enthielt höchstens 0,1% reduzierenden Zucker; die Oxydation war somit vollständig. Die Kulturflüssigkeit, die ein End-pH von 6,7 und einen Trübungsgrad von 0,275 aufwies, wurde mit Aktivkohle entfärbt, mittels eines stark sauren Ionenaustauschharzes von Kationen und mittels eines schwach basischen Austauschharzes von Anionen befreit und dann unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene Sirup war leicht gelb, die Feststoffausbeute betrug 93%; das Produkt hatte eine schwache erfrischende Sauerkeit.

Das Papierchromatogramm des verzuckerten Ausgangstoffes zeigte die Zusammensetzung
90,0% Maltose

5,5% Maltotriose

2,7% andere Oligosaccharide

1,8% Glukose;

das Papierchromatogramm des Endproduktes erhielt man in folgender Weise: 1 g Tupfen des Sirups auf Trockengrundlage berechnet, wurden mit drei Schichten eines 6:4: 3-Gemisches von Butanol, Pyridin und Wasser bei 25° C nach der steigenden Methode verdünnt. Zur Zuckerbestimmung benutzte man Anilinhydrogenphthalat als Farbentwickler; die Reaktionslösung war praktisch frei von Maltose, Maltotriose und Glukose und hatte nur geringe Reste an Oligosacchariden.

Zur Bestimmung der Carbonsäuren verwendete man eine 0,05 %ige Äthanollösung von Bromphenolblau; die Probetupfen zeigten einen geringen Gehalt an Glukonsäure, dagegen ein Überwiegen von Bionsäuren mit unterliegendem Anteil an Trionsäuren. Diese Ergebnisse ließen vermuten, daß die Zukker nicht hydrolysiert waren und lediglich eine Oxydation der Zucker stattgefunden hatte; die Endprodukte waren somit Mischungen geradkettiger Aldonsäuren, die hauptsächlich aus Bion- und Trionsäuren bestanden.

Beispiel 2
Enzymatische Maltoseoxydation

Eine 25 %ige Aufschlämmung gereinigter Süßkartoffelstärke wurde beim pH 6,0 mit 0,2% (vom Stärkegewicht) eines geeigneten Verflüssigungsenzyms bei 90° C bis zum D.E. 1,5 verflüssigt, die erhaltene Lösung schnell auf 60° C abgekühlt und nach Zusatz von 20 E/g St einer aus Weizenkleie extrahierten ß-Amylase (vgl. GB-PS 1130398) 1 Stunde lang gerührt. Nachdem die Viskosität der Lösung herabgesetzt war, gab man 25 E/g St einer «-1,6-Glukosidase zu und ließ die Lösung unter 35stündigem Rühren auf 45° C abkühlen. Die erhaltene Zuckerlösung der

Zusammensetzung
90 % Maltose

5,6% Maltotriose

1,8% Glukose

wurde entfärbt, gereinigt und auf einen Zuckergehalt ' von 30% eingedampft.

Diese Lösung setzte man zwecks Oxydation mit 20 mg je g Maltose der nach Beispiel 1 erhaltenen Mikrobenzellen unter 30stündigem starkem Schütteln bei 30° C um. Da die Säurebildung von einem pH- ^l(l Abfall begleitet war, wurden 0,2 gCaCO₃ je g Maltose zugesetzt. Den Reaktionsverlauf regelte man in der Weise, daß in Proben jeweils die Menge des restlichen reduzierenden Zuckers und des Gesamtzuckers bestimmt und die Umsetzung als beendet angesehen ^|r» wurde, sobald die Menge an reduzierendem Zucker auf 0,3% erniedrigt war. Anschließend wurde die Lösung gemäß Beispiel 1 gereinigt, mit Aktivkohle und Ionenaustauschharz entsalzt und auf 75% eingedampft. Ausbeute des farblosen klaren Sirups betrug -° 95% der Theorie.

Beispiel 3
Biochemische Oxydation eines maltosereichen

Stärkesirups 2>

Man verdünnte einen
77 % Maltose
10,1% Maltotriose

1,1% Glukose

enthaltenden Sirup auf 10%, inokulierte die Lösung s" mit 1 % Impfbakterien von Pseudomonas taetroiens (IFO 3460) und kultivierte unter den Bedingungen des Beispiels 1 24 Stunden bei 30° C unter Belüftung. Nach 40 Stunden erreichte die Restzuckermenge 0,3 %. Nach Abschleudern der Zellen wurde die überstehende Flüssigkeit, wie vorbeschrieben, zu einem fast farblosen Sirup aufbereitet. Die Ausbeute betrug 91%, auf Trockenstoff berechnet.

Das Papierchromatogramm zeigte, daß im erhaltenen viskosen Sirup keine Glukose und Maltose, jedoch etwas Triose und andere Oligosaccharide verblieben waren; Glukon- sowie Maltobion- und Maltotrionsäuren lagen in entsprechenden Mengen vor. Hieraus war zu schließen, daß der Sirup ein Gemisch von niedermolekularen Oligosacchariden und AIc onsäuren enthielt. Durch Titrieren ermittelte man eine Gesamtsäureausbeute von 90% der theoretischen Mengen von Glukose, Maltose und Maltotriose im Ausgangsmaterial.

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Beispiel 4
Enzymatische Oxydation amylolysierter Stärke

Eine 20%ige Aufschlämmung einer Süßkartoffelstärke vom pH 6,0 verflüssigte man mit 0,2% eines Verflüssigungsenzyms bei 90° C bis zum D.E. 20, kühlte die homogene Lösung auf 50° C, stellte sie auf pH 6,0 ein und rührte sie nach Zusatz von 5 E/g St einer aus Weizenkleie bereiteten /3-Amylase bis zum Abfall der Viskosität. Alsdann versetzte man die Lösung mit 7 E/g St «-1,6-Glukosidase und mit 5 E/g ω St Verflüssigungsenzym und setzte sie 18 Stunden bei 45 bis 50° C bis zu einem Maltosegehalt von 74% um.

Der erhaltenen verzuckerten Lösung wurde gemäß Heispiel 3 20 mg je g Stärke Pseudomonas taetroiens (IFO 3460) sowie 2 g CaCO₃ zugegeben und die Mischung bei 35 bis 40" C unter Belüftung gerührt; nach liS bis 20 Stunden war der reduzierende Zucker fast ganz oxydiert. Nach Abschleudern der Mikrobenzellen bereitete man die Lösung in der vorbeschriebener Weise.

Das Papierchromatogramm und die alkalische Titration hatten praktisch die gleichen Ergebnisse wie im Beispiel 3; die Menge an Maltobionsäure betrug 75% und an Trionsäure 8% der Ausgangsstärke. Be: Berücksichtigung der Zuckerverluste während dei Reinigung war anzunehmen, daß der Maltosegehall durch den Verzuckerungsvorgang auf 77 bis 78% gebracht und zu Bionsäure oxydiert war.

Der erhaltene schwach viskose Sirup hatte eine genießbare Säuerlichkeit und war als Zusatz zu Nährmitteln sehr geeignet.

Beispiel 5

Enzymatische Oxydation eines maltosereichen
Stärkesirups

Ein handelsmäßiger maltosereicher Stärkesirup enthaltend
49% Maltose
13% Maltotriose
6% Glukose
33% Dextrin

wurde auf 15% verdünnt, mit 25 mg je g Zucker ar Zellen eines der beanspruchten Pseudomonas-Stämme versetzt und bei 30° C 21 Tage unter Belüftung und partiellem Neutralisieren des pH mit CaCO kräftig gerührt. Nach üblicher Aufbereitung erhieli man einen wenig viskosen und schwach süßen 50%igen Sirup mit 61 % Bionsäuren (Ausbeute 95%) auf Trockenstoff berechnet.

Beispiel 6

Enzymatische Oxydation eines mit Säure bereiteter Sirups

Man verdünnte einen handelsüblichen, mit Säure gewonnenen Sirup von D.E. 50 der Zusammensetzung

26% Glukose
16% Maltose
13% Maltotriose

auf 15%, setzte in gleicher Weise wie im Beispiel 2 22 mg je g Stärke an oxydierendem Enzym in Zellenform zu und rührte 21 Tage unter Belüftung bei 30° C bis zu einem Restgehalt an reduzierendem Zucker vor 0,5%. In dem nach der Reinigung erhaltenen farblosen, viskosen Sirup betrug der Bionsäuregehalt 76% und die Ausbeute 51%, auf Feststoff gerechnet. Die Sauerkeit harmonisierte im Sirup mit der Süßigkeii und auch mit einer geeigneten Viskosität.

Beispiel 7

Biochemische Oxydation eines Stärkesirups
von hohem D.E.

Einen mit Säure gewonnenen, handelsüblichen Si rup, der durch Ionenaustausch bis zum D.E. 70 gerei nigt war,
46% Glukose
22% Maltose
12% Maltotriose

enthielt und zu einer 10%igen Kohlenstoffquelle ver dünnt war, kultivierte man gemäß Beispiel 1 mi Pseudomonasfragii (IFO 3458) 50 Stunden unter Be lüftung bei 30° C bis zu einem Restzuckergehalt vor 1,5%. Die abgetrennte und, wie vorbeschrieben, zi einem Sirup aufbereitete überstehende Lösung enthielt 90% Feststoff in Form von Glukon-, Maltobion·

und Maltotrionsäuren sowie beträchtlichen Oligosaccharidmengen und wies eine angenehme Sauerkeit auf.

Beispiel 8

Enzymatische Oxydation eines Stärkesirups
von hohem D.E.

Man verdünnte einen geeigneten, zuckerreichen Handelssirup vom D.E. 70 auf 30%, versetzte die Lösung mit 25 mg je g Stärke der im Beispiel 7 abgetrennten Mikrobenzellen und rührte sie 21 Stunden unter Belüftung bei 30° C. Das partielle Neutralisieren erfolgte mit Natronlauge. Die zu einem farblosen Sirup aufbereitete Lösung enthielt die gleiche Feststoffzusammensetzung wie im Beispiel 7 in einer Ausbeute von 92%.

Die in dem Verfahrensprozeß eingesetzten «-1,6-Glucosidasen können aus folgenden Mikroorganismen gewonnen werden:
Escherichia intermedia
Pseudomonas amyloderamosa
Streptomyces diastatochromogenes
Actinomyces globisporus
Nocardia asteroides

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Micromonospora melanosporea Thermonospora viridis Actinoplanes phillippinensis Streptosporangium roseum Agrobacterium tumefaciens Azotobacter indicus Bacillus cereus Erwinia aroideae Micrococcus lysodeikticus Mycobacterium phlei Sarcina albida Serratia indica Staphylococcus aureus Lactobacillus brevis Leuconostoc citrovorum Pediococcus acidilactici Streptococcus faecalis Aerobacter aerogenes Corynebacterium sepedonicum Aeromonas hydrophila Flavobacterium esteroaromaticum Acetobacter suboxydans Vibrio metschnikovii Entirobacter aerogenes

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Gewinnung carbonsäurereicher Zuckersirupe, wobei man in Form von viskosen ^r> Zuckerlösungen vorliegende Stärkehydrolysate, die Gemische von Mcr.o- und Oligosacchariden, hauptsächlich Glukose und/oder Maltose und Maltotriose, sowie Dextrine enthalten, zwecks Oxidierung der Saccharide zu den Aldonsäurege- ι ο mischen, vorzugsweise zu Giukonsäure und/oder Maltobion- und Maltotrionsäure, während oder nach beendeter Stärkeverzuckerung mit Mirkoorganismen behandelt, die Glucose-Dehydrogenase büden, dadurch ge kennzeich net, daß man als Glucose-Dehydrogenase bildende Mikroorganismen die Stämme Pseudomonas taetrolens (IFO 3460) und Pseudomonas fragii (IFO 3458) anwendet.

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