DE2023738A1

DE2023738A1 - Verfahren zur Herstellung eines Proteaseinhibitors

Info

Publication number: DE2023738A1
Application number: DE19702023738
Authority: DE
Inventors: Viktor Dipl Ing Padr Zdenek Dr Prag P Mansfeld
Original assignee: Spofa, Vereinigte Pharmazeutische Werke, Prag
Priority date: 1969-05-19
Filing date: 1970-05-14
Publication date: 1971-01-07
Also published as: CH535584A; NL7007240A; FR2051541A1; DK125367B; BE750587A; US3670075A; ES379761A1; SE391648B; CA927762A; FR2051541B1; GB1269163A

Description

Patentanwälte Dlpl.-Ing. R. DEETZ «en. Dlpl-Ing. K. LAMPRECHT

Dr.-Ing. R. B E E T Z Jr.
8 München 22, Steintdorf.tr. 10 23>15.692P 14.5. 1970

SPOPA Vereinigte Pharmazeutische Werke PRAO (Tschechoslowakei)

Verfahren zur Herstellung eines Proteaseinhibitors

(Beanspruchte Priorität vom 19«, Mai 1969/Tschechoslowakei)

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Proteaseinhibitors aus tierischem, insbesondere Rinderoder Sohweinepankreasschrot nach vorheriger Extrak- | tion des Insulins mit einer verdünnten Mineralsäure, insbesondere Phosphorsäure.

¥ie bekannt ist, kommen natürliche Proteaseinhibitoren in Organismen sowohl pflanzlicher als auch tierischer Herkunft vor. Vom therapeutischen Standpunkt aus sind bloß die Inhibitoren tierischen Ursprungs von Bedeutung. Es ist gelungen, dieselben in verschiedenen Organen nachzuweisen und aus diesen zu isolieren, beispielsweise aus

233-(s 6434)-Tp-r

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Pankreas, Lunge, Parotis₉ Leber,, Mils u« ähnl„ oder aus Kb'rperflüseigkeiten, wie BlUt₉ Harn oder. Milch«, Es gibt mehrere Typen "von Proteaseinhibitoren^ und! "sie umtsrachel» den sich voneinander in ihrem ©heimischen. Eigenschaften,, ihrer Molekülgröße oder Stabilität und insbesondere in ihrer spezifischen Aktivität gegenüber proteoiytischen Enzymen,, Trypsin, Chymotrypsin₉ Kaliikrein^ Thrombin oder Plasmin.

In der Mehrzahl wird zur Herst©llung vom bekannten„ therapeutisch anwendbar©!! Proteaseimhibitorpirllparaten als Atasgangamaterial Leb©r_B Pankreas ©dor Parotis bentatst® Der Rohstoff wird in der Segel nit li©tlaanol extrahiert,, und die Mohfralction_f welsüie d©m Inhibitor enthält, wird mit Aceton gefällt« Die iiöiaermolekiialaren Eiweißstoff© werden mit Sulfoealizyleluare land dies© mit Hilf© von loiienaus» tausehern entfernt ₉ ?#onachL di© aktiv© K©mpom®2ffite durch Fällen mit Aceton isoliert wird«,

Aufgab© vorliQg©rad©s° Effffiimdiamg ist di© vorteilhafte Ausbildung eine« Terfsitaeimo d©2? ©imgasigs genasiHiton Art₉ insbesondere nach Ex-ferakttoza des Iiasialiias mit 7©prozenti°- k gem Äthanol, das mit ainas· BliEi©ralsäiar©_f imsb©sond©-re

Phosphorsäure auf ©iiaesa pH-Wert von 2₉O bis 3s5 amge3äiia<= art ist» Unter diesem Bedingungen wird der Inhibitor nicht gleichzeitig «it Insulin extrahiert,. somdern bleibt in dem Paniere as β chro't zarfieko Mach der Erfindtang soll sich der Inhibitor "aus diesem H©fos.toff in maximaler ÄUBh@ut@_B in hohem Seisiheits·= aiad Äktivitätsgrad gewisinen lasseiio

B±©s© Arafgalb© wird ®rfiradiaKigsgemäß dadurch gelöst ₀ daß sasi άοη als ABsgsuagsaafcsrial dienendem betriobsfeticli-

eit 60= bis 70proseinitigem tiäßrigem

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Äthanol mit einem pH-Wert von 10,0 bis 13,0 extrahiert» aus dem Extrakt durch Verdampfen unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von höchstens kO C des Äthanol entlernt, aus dem konzentrierten Extrakt durch Abkühlen Lipoide ausscheidet und abtrennt und aus dem auf diese Weise vorgereinigten wäßrigen Extrakt mit einem löslichen anorganischen Salz, vorzugsweise Ammonium- oder Magnesiumsulfat i in Form eines Niederschlages einen Eiweißkomplex- ausscheidet, den man nach Isolierung in eine wäßrige Suspension mit einem pH-Wert von 5»5 - 7t5 überführt, aus welcher man bei einer -Temperatur von 50 bis 80 C durch Einwirkung von Trichioressig- oder SuIfosalizylsäure in einer Konzentration von 2-3 Gew.-^ und durch nachfolgendes Abkühlen auf eine Temperatur von 15 - 20 °C die Ballasteiweißstoffe in Form eines Niederschlages, der weiterhin nicht verarbeitet wird, abscheidet, worauf man das FiItrat, weiches den freigesetzten Inhibitor enthält, auf einen pH-Wert von 7,0 - 7»5 einstellt, mit Natriumchlorid in einer Menge von 25-3Og auf 100 ml sättigt und «sit Chlorwasserstoff säure auf einen pH-Wert von 1,0 bis 3,0 ansäuert, wodurch sich der den gesamten freien Inhibitor enthaltende Niederschlag ausscheidet, aus dem man nach Abtrennen den mit dem Inhibitor angereicherten Anteil durch sukzessives Auflösen mit einer gepufferten Natritimchloridlösung, deren pH-Wert kon$inuielich von 1,7 - 9,0 steigt, isoliert, wobei man die im pH-Bereich von 3t0 - 6,0 gewonnene Fraktion nach Entionisierung in an sich bekannter Weise durch Gefriertrocknung oder Fällen zum reinen Inhibitor aufarbeitet.

Zur Einstellung des pH-Wertes des wäßrigen Äthanols, das man zur Extraktion des als Ausgangsmaterial dienenden Pankreasschroteβ verwendet, auf 10,0 - 13,0 dient der Zusatz eines Alkalimetallhydroxide oder des Ammoniumhydroxids.

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Als eine gepuffert® eine 22= bis 25p2P©zentige Phosphorsäure verwenden_p durch Zusatz von '. wird.

Natriumchlorid! ösusig kann man Hatritamclil QrIdIo sung in O₀OI M

pH=¥®rt der Lösung kontinuierlich erhöht

Das Verfahren zur Herstellung aines Proteaseinhibitors gemäß des· Erfindung wurde unter Berücksichtigung der Eigenschaften der Rohstoff© sowie atach einselner Zwischen» produkte mit dam Ziel atosg©arbeitet_f die höchste Ausbeute zu erreichen und das möglichst reine Endprodukt zu gewinnen» Wie experimentell bewiesen M!rd@_s ist ©s zweckmäßig$ . bei der ersten Operation die Konzentration das Esstrak-» tionsmittels in dem (angegebenen Bereich. einsianalten_o Bei niedrigerer Konzentration des Äthanols als 6o fo gmhcn in den Extrakt zu viel Ballaststoff© über_e was für die darauffolgende Aufarbeitung nachteilig ist«, Bei höherer Kon- . zentration als 70 $ wird der Proteaseinhibltor überhaupt nicht extrahiert« Buren Verdampfen von Äthanol erhält man eine wäßrige Lösung₈ aus der man Lipoldstoffe am besten durch Abkühle» entfernt« Ans dieser vorgereinigten wäßrigen Lösung isoliert man danach durch Aussalzen in Form eines Niederschlages ©iaen Eiweißkomplexj, der bereits den Inhibitor enthält₉ allesrdiags noch In gebundener Form« Die Freisetzung des Inhibitors ©rfolgt in der nachfolgen-den Operationf wo iaan dea Diwsißkoiaplex »bei einem pH-Wert von 6,0 ·' 7j»0 disreli B'tnwlrkmng vom Tricliloresslg« oder Sulfoe&iissylaaus*®. Tbei aäßig ©3?li5lat©r Tenapoa'atiiaS' BBifepaltet· Diese Operation ist ame des ganzen Hex>e4;@21.1ungeverfahren die wichtigete^ da nuv bei Einhaltung von optimalen Bedingungen günstige Es'gebiaiss© zn eräzielea simdo Na©h dieser Operation wntrdem aiaeln die Maste vom Ballaoteiweiö» stoffen entfernt· Im weltefera wird das FIltrat a«fg®arbei-

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tet, aus dem man durch Aussalzen mit Natriumchlorid und Ansäuern mit Chlorwasserstoffsäure einen Niederschlag, der den gesamten freien Inhibitor enthält, gewinnt« Diesen Niederschlag kann man zum Endprodukt entweder so verarbeiten, daß man dessen wäßrige Lösung einer fraktionierten Fällung mit Chlorwasserstoffsäure in Gegenwart von Natriumchlorid unterwirft, oder so, daß man den in eine Säule eines geeigneten neutralen Stoffes, beispielsweise Kieselgur, gebrachten Niederschlag mit einer Natriumchloridlösung in verdünnter Phosphorsäure elulert, deren pH-Wert von 3,0 - 9,0 kontinuierlich erhöht wird. In beiden Fällen werden Fraktionen im pH-Bereich von 3,0 - 6,0 gesammelt, die man nach Entionisierung zur reinen Inhibitorsubstanz auf einem der bekannten Wege aufarbeitet, beispielsweise durch Gefriertrocknung oder Fällen mit Aceton· Die erhaltene Substanz wird schließlich zur ausgewählten Arzneimittelform verarbeitet, beispielsweise zu sublingualen Tabletten oder Injektionslösungen·

Der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene pankreatische Proteaseinhibitor wies bei der pharmakologisehen Auswertung bedeutende spezifische Wirkungen auf, Aus einer Serie der Inhibitoren ist dieses Präparat der relativ wirksamste Fibrinolysehemmer, und zwar sow-ohl in vitro als auch in vivo. In vitro wurde dieser Effekt einerseits unter Anwendung der thromboelastographischen Bewertung der Kaninchenplasmafibrinolyse nach vorheriger Aktivierung mit Streptokinase, andererseits in einem künstlichen Fibrinogen-Thrombin-Fibrinolysinsystem bewiesen. In beiden Testen zeigte das erfindungsgemäße Präparat die höchste Aktivität unter den bekannten Inhibitoren und übte keine blutgerinnungshemmende Wirkung, wie z. B. der aus Sojabohnen isolierte Inhibitor aus« In vivo

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wurde die Bewertung wiederum muter Heranziehung des Thromboelastographs an mit Streptokinase vorbehandelten Kaninchen durchgeführt«, In weiteren ¥©rsuchen in vivo wurde der Zeitverlauf der Inhibitorwirkung verfolgt,, und zwar nach, verschiedenen intravenös oder subcutan verabreichten Dosen, wobei ebenfalls eine hohe Aktivität nachgewiesen ' . wurde«

Auch weitere pharmakologische Eigenschaften des Präparates sind günstige Di© Toxieität ist niedrig, .therapeutische Dosen beeinflussen weder dan Blutdruck noch die Atmung der -Versuohs tiere,, und der holt© Heinheitsgrad dieses Stoffes vom Charakter ©ines niedermolekularen Peptide schließt die Möglichkeit einer Sensibilieierang aus» . -

Der nach dem erfindus&gsgemäßen Verfahren gewonnene Froteaseinhitoitor ist therapeutisch auf verschiedenen Indikationsgebieten anwendbar» Es handelt--sieh vor allem um Zustande, welch® dtareia das gestört© Gleichgewicht des fi» brinolytischen. Systems charakterisiert sindj, beispielsweise in der gynäkologischem Praxis _t bei verschiedenen postoperativen Zuständen, fo@i Pankreaserkrankungen und ähnl« Er wird entweder oral (in Form von Smblingualtabletten) oder parenteral verabreicht, in erster Linie intravenös, insbesondere bei akuten Zuständen^ bei denen es erforderlich ist, eine rasche Erhöhung des Proteaseinhibitorspiegels im Organismus zu erzielen.

Die Einzelheiten des erfindungsgemäßen ¥©rfahrens sind in den nachfolgenden Beispielen angeführt«, Diese beschreiben bloß einige ÄusfüfarumgsmÖglichkeitenp ohne sie" -Jedoch, vollkommen zu erschöpfen« Im Beispiel 1 wird der.Inhibitor· durch fraktioniert©s Fällen isoliert„ im Beispiel- 2

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wird indessen sukzessives Auflösen angewendet, wodurch das Produkt in wesentlich gereinigter Form erhalten wird.

Beispiele

1. Der ausgepreßte Schweine- oder Rinderpankreasschrot, der nach der Extraktion von Insulin zurückbleibt» wird zerkleinert und mit zweifachem Volumen (bezogen auf die Gewichtsmenge) 66prozentigen wäßrigen Äthanols mit Zusatz von 0,5 $ einer 20prozentigen Natriumhydroxidlösung vermischt. Man extrahiert unter kräftigem Rühren 3 Stunden lang bei Zimmertemperatur. Nach dieser Zeit schleudert man den flüssigen Anteil ab und behandelt den Schrot auf dieselbe Weise und unter denselben Bedingungen noch einmal. Die äthanoliechen Extrakte werden vereinigt, filtriert und in s^J^em Vakuumverdampfer bei 35 bis kO °0 konzentriert. Den konzentrierten Extrakt läßt man einige Stunden bei Zimmertemperatur stehen, wodurch die Ausscheidung der Lipoidballastetoffe erfolgt. Nach Abtrennen wäscht man dieselben mit lauwarmem Wasser und setzt dieses Waschwasser dem konzentrierten Extrakt zu. Den Extrakt versetzt man langsam und unter Rühren mit festem Ammoniumsulfat in einer Menge von 550 g/l Extrakt. Den ausgeschiedenen Niederschlag isoliert man nach Zusatz von Kieselgur entweder durch Absaugen oder durch Abschleudern, wonach man ihn in einem fünffachen Volumen Wasser (bezogen auf das Gewicht des Niederschlages) suspendiert, verrührt und durch Einstellung des pH-Wertes auf 6,0 bis 7»0 mit Hilfe einer 20prozentigen Natriumhydroxidlösung zum Teil in Lösung bringt. Die auf diese Weise behandelte Suspension erwärmt man auf 50 ⁰C und versetzt sie unter kräftigem Rühren mit Trichloressigsäure in Form einer konzentrierten

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Lösung bis sviT Sndkonsentration von 2₉5 $>° Unter ständigem Rühren erwärmt man die Suspension auf 70 ⁰C und hält dies© Temperatur·" 5 Miawt©n konstant₀ Baaaeh kühlt man sie auf 15 bis 20 °C ab₀ läßt si© 1 bis 2 Stunden stehen und trennt den Ifi©d©z"Q<shla.g· durch Pütri©r©n ab₀ Das klare Filtrat stallt man mit ©iner 20pr©s©ntig©n HaOH=LBsung auf einen pH-tfsrt von 7 ο 5 ©i^ wad gibt fee tea Natriumchlo*= rid in Giner Meng© fön 28 g/100 rail hinsu₀ Di© mäßig g©~ trübte Flüssigkeit v©rs©tst manlangs&m unter Rühren mit 10prozentigs? GiilorwasseirstorfsMt&re bis sutn pH=iiert von 2jO_ffl Es scheidet sich ©in voluminös©r Wiederschlag aus, den man absaugt oder abschleudert und ©nttfedar in feuchtem· Zustand oder maeh Entwässerung rait einem organischen_p mit Wasser mischbaren Lösungsmittel₉ beispislsweise mit Aceton und Xther_s

Den Niederschlag;, welcher d©n gesamten freien Inhi·= bitor enthält,, reinigt raan tieiterhin so₉ daß" man ihn in Wasser bei einem pH-Wort von 7s5 s« ©iner 5pzOzent±g@n Lösunig löst, der mesi fest©© Natriumchlorid in- ©iner Menge von 25 g/100 ml. Lösung aussetzt₉ wobei ©in® schwache Trübung auftrittο Unter kräftigem- Hühron ^©rsstst man dieses Gemisch langsam tropfenweis© suit 10prosentig©r Chlorxiasaerstoffelurej wobei sofort di© Bildung eines Niedsrschiages erfolgt. NactadeüH der pH-¥©rt von 6_p0 erreicht ist₉ schleu« dert man den Niederschlag ab (Fraktion A) und setzt das Ansäuern bis auf einen pH~If©rt von h_o5 forte Eq bildet sich erneut ein Mied©r.selilag_e den man abschleudert (Frak= tion Β)β Nach weiterem Ansäuern auf ©inen pH°»¥©rt von 3_s0 trennt aan wieder einen Niederschlag (Fraktion C) ab und scheidet schließlich durch Einstellen des pH°fJ©rt©s auf 1,5 die gesarate Peptidfraktion (Fraktion D) auSo Die Fraktionen A und D besitzen nur ©ine schwache Hemmwirkung ge-

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genüber Trypsin. Am wirksamsten ist die Fraktion B, und einen aktiven Anteil des Inhibitors enthält auch die Fraktion C. Die von mehreren Ansätzen verbleibenden, wenig aktiven Fraktionen A und B werden gesammelt und vereinigt und gegebenenfalls später durch neue Fraktionierung ge~ reinigt.

Die aktive Fraktion B, gegebenenfalls vereinigt mit der Fraktion C, entsalzt man nach Losen in Wasser mit Hilfe von Ionenaustauschern, wonach man aus der .entsalzenden Lösung den Inhibitor entweder durch Gefriertrocknung oder durch Ausfällen mit Aceton und Entwässern des Niederschlages mit organischen} mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln isoliert. Die Aktivität des erhaltenen Inhibitorpräparates beträgt 2000 bis 5000 KIE/l mg (internationale Kaliikreineinheiten). Die Ausbeute ist 8 bis 10 Millionen KIE aus 100 kg des als Ausgangsiaaterial dienenden Panlqreasschrots»

2. Auf dieselbe Weise wie im Beispiel 1 führt maa die Xthanolextraktion, die Entfernung' der Lipoide und die Separation der höhermolekularen Eiweißanteile mit Trickloressigsäure durch. Die Weiterverarbeitung des aktiven Niederschlages, d. h. die Fraktionierung seiner NaCl enthaltenden Lösung mit Chlorwasserstoffsäure, ersetzt man durch Fraktionierung in einer Kieselgursäule, wodurch eine hochwirksame Reinigung und gleichzeitige Entfernung der farbigen Begleitetoffe erzielt wird.

Man verrührt Kieselgur in einer 0,01 M Phosphorsäure-

lösung, welche 22 bis 25 $ Natriumchlorid enthält und den pH-Wert von etwa 1,7 aufweist, und gießt diese Suspension

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in eine Kolonne mit 35 ram Durchmesser ®±n₀ Es bildet sich eine etwa 210 aim hohe Kleselgursäual@_o Mach Absätzen trägt man in die Kolonne ein® Suspension eijn_D die raasa aus 2 g des aktiven Niederschlages dwrsh Vermischen mit 1/3 der Monge d©r uirsprüngli ehern anr Vorbereitung der Säule be=» aatsten Kieselgursiuispensiosi erhält₀ wodurch di© Säule in d®r Kolonne ©ttra rau 7© rasa QE¹IiOlSt ttfirdU Die lolomi® wäscht man mit 0,01 M Phospfeorsarare duE*ch Bad. beginnt sofort die Elution mi t d©® lime ear ©m Gradient _B d₀ U₀ mittels einer O₉OI M PhesphorsäiarelSsöBigo die 22 bis 25 $ Natriiamchlo» rid enthält (mit ©±h©ibj pH-¥©rt von 1 _ff7) d ^^@r iac zx-jecks koatiniaierliclier pH^Ifört^-Srliöfatasig eine' 0_B01 M Phosphoraeittralösisng· raiit 22 bis 25 ^ Hstr-iuamcijloridj; dsresi pH-Wert üsi'fe 1Opi,-oae2itig'0z° Natronlauge auf 9₉O ©imgsstellt wurde _p nach läiiad siaoh siasotsto Di© Biarchlau3Fg©schwindigk©it be-= trägt 2p5 bis 5_s0 ssal/l sniHo _D <^i® Fralstiosien ■wer'den je 25 ejI atogenojnnaeBe Während ύ®τ SIution, erhöht mais nach und nach don jpH»¥ert des SliitioEasaaittels bei konstanter Konzentration des Natriumchlorid©ο Bie Änfangsfraktion©Ji bis zum pH«»¥ei^ot ton J₉O sisrnd pralstissh inaktix^u und danach fließt die aktive Peptidfralstiom (Kontrolle mit Follin^Beagsiis) bis zum pH«= ¹H¹Qrt -worn 5ρQ ■= 5o^° öi© x-j©±1ä©r©n Anteile sind wieder weniger aktiVo Das E51uat_B welches die aktive Fraktion enthält^ arbeitet aan wie im Beispiel 1 aufo Di© Aktivität des erhalteaea Frodraktes beträgt 2000 bis 5000 KIE/l

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines Proteaseinhibitors aus tierischem, insbesondere Rinder- oder Schweinepankreasechrot nach vorheriger Extraktion des Insulins mit einer verdünnten Mineralsäure, insbesondere Phosphorsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man den als Ausgangsmaterial dienenden betriebsfeuchten Pankreasschrot mit 60- bis 70prozentigera wäßrigem Äthanol mit einem pH-wert von 10,0 bis 13t-0 extrahiert, aus dem Extrakt durch Verdampfen unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von höchstens kO °C des Äthanol entfernt, aus dem konzentrierten Extrakt durch Abkühlen Lipoide ausscheidet und abtrennt und aus dem auf diese Weise vorgereinigten wäßrigen Extrakt mit einem löslichen anorganischen Salz, vorzugsweise Ammonium- t ,.?*»** Magnesiumsulfat, in Form eines Niederschlages einen Eiweißkomplex ausscheidet, den man nach Isolierung in eine wäßrige Suspension mit einem pH-Wert von 5,5 bis 7,5 überführt, aus welcher man bei einer Temperatur von 50 bis 80 °C durch Einwirkung von Trichloressig- oder SuIf©salizylsäure in einer Konzentration von 2 bis 3 Gew.-^ und durch nachfolgendes Abkühlen auf eine Temperatur von 15 bis 20 ⁰C die Ballasteiweißstoffe in Form eines Niederschlages, der weiterhin nicht verarbeitet wird, abscheidet, worauf man das Filtrat, welches den freigesetzten Inhibitor enthält, auf einen pH-Wert von 7,0 bis 7,5 einstellt, mit Natriumchlorid in einer Menge von 25 bis 30 g auf 100 ml sättigt und mit Chlorwasserstoff säure auf einen pH-Wert von 1,0 bis 3|0 ansäuert, wodurch sich der den gesamten freien Inhibitor enthaltende Niederschlag ausscheidet, aus dem man nach Abtrennen den mit dem Inhibitor angereicherten Anteil durch sukzes-

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sives Lösen mit einer gepufferten Natriumchloridlösung, deren pH-Wert kontinuierlich von 1₉7 bis 9»O steigt, isoliert, wobei man die im pH-Bereich von 3»O bis 6,0 gewonnene Fraktion nach Entionisierung in an sich bekannter Weise durch Gefriertrocknung oder Fällen zum reinen Inhibitor aufarbeitet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet» daß man den pH-Wert des wäßrigen Äthanols, das man ?'Jir Extraktion des als Ausgangsmaterial dienenden Pankreasschrotes verwendet, durch Zusatz eines Alkalimetallhydroxide oder dos Ammoniumhydroxids auf 10,0 bis 13₉O einstellt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als eine gepufferte Natriumchloridlösung eine 22-bis 25prozentige Natriumchloridlösung in 0,01 M Phosphorsäure verwendet und den pH-Wert der Lösung durch Zusatz von Natriumhydroxid erhöht.

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