DE2022311A1

DE2022311A1 - Negamycin

Info

Publication number: DE2022311A1
Application number: DE19702022311
Authority: DE
Inventors: Masa Hamada; Shinichi Kondo; Kenji Maeda; Tomio Takeuchi; Hamao Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1969-05-08
Filing date: 1970-05-06
Publication date: 1971-11-04
Also published as: CS178856B2; DE2022311B2; IL34423A0; AU1491870A; NL156751B; NL7006698A; BE750096A; PL80573B1; US3679742A; GB1315551A; NO132240B; FR2070068B1; CA926329A; NO132240C; FR2070068A1; DK127931B; SE360885B; CH544808A; IL34423A

Description

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Sen/Gl M 2281

ΖΔΠΙΑΝ HOJIH BIS&IBÜTSÜ KAGAKÜ KEHOT KAI₉ SoJqro /Japan

Hegamycin

Die Erfindung betrifft ein neues wertvolles das als Kegamyoin 'bezeiclmet wird, ferner fällt in den Bahmen der Erfindung ein Verfahren S3U seiner Herstellung. Insbesondere befasst sieb, die Erfindung mit einem Yerfahren aur Herstellung dieses Antibiotikums duroh öMxung sowie mit Metaoden zur Abtrennung und Reinigung derselben. In den Kanmen der Erfindung fallen ferner die Salze dieses Antibiotikums in verdünnten Lösungen, ausserdem das Antibiotikum in ^ona von Hohkonsentraten, Eohfeststoffen und als reiner Peststoff. Diese Substanz vermag in wirksamer Weise Pseudpmonas_t Salmo-

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nella, Klebsiella und Staphylococei su inhibieren. Sie besitzt eine geringe Toxiaität und übt eine therapeutische Wirkung auf Infektionen von 3?seudomonas und anderen ansprechbaren Organismen in Mäusen aus. Diese Substanz eignet eich aur Heilung von Infektionen von Pseudomonas sowie anderen ansprechbaren Organismen in Menschen und Sieren.

Durch die Erfindung wird eine neue antibiotische Substanz (sowie deren Salze) aur Verfügung gestellt, welche Pseudomonas, Salmonella, Klebsiella und Staphylooocci zu inhibieren vermag. Dieses Antibiotikum ist ia Wasser löslich und in Methanol, Äthanol, Butanol, Butylacetat, Äthylacetat» Chloroform und Benzol praktisch unlöslich. Sie zeigt keine maximale Absorption von UV-Licht sswischen 220 und 400 mu und liefert auf Ninhydriaa, rotes SetrazoXium und Kydoa-ßmith-Reagens positive Reaktionen» während die Reaktionen gegenüber Sakaguchi und Molisch negativ verlaufen„ Die Substanz weist in dem Infrarotteil des Spektrums Absorptionsbanden auf ₇ vieim sie mit Ealiumbromid in pelletisierter Porm untersucht wird» Die

Absorptlosateaien treten bei folgenden Wellenaahlen in cm aufs 3430, 3200, 3050, 2950, 166O₉ 1590, H05_fi 1320. 1140_s 1050,970, 890, 820 und 720, Ferner ist die Substanz optisch aktiv ([tt]j^ E +2,5® (c2,.H₂0)). Sie entspricht der formel ^ö9^H20^N4°4 ^^{214 Bei}e* ^drei pK-Werte von 3,55_t 8,10 und 9_f75» Ihre Struktur ist wie folgt:

m₂ oh M₂ ο ₅

Die beigefügte Figur 1 ist das Infrarotspektrum von Hegamy cin zusammen mit Kaliumbromid, während die IPigur 2 das SMR Spektrum von Negamycin in DgO wiedergibt.

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Ferner fällt in den Rahmen der Erfindung das Verfahren sur Herstellung dieses Antibiotikums UegSBjycixi, welcheo darin besteht, einen Stamm von S. purpeofuscus in einem Hährmediura unter aeroben Bedingungen solange zu züchten_s bis eine merkliche Menge an Hegamycin in der lösung angereichert worden ist.

Kegamycin ist ein neues Antibioticum, Der Organismus, welcher das erfindungsgemässe Antibiotikum erseugt, wurde ebenfalls sum ersten Male aufgefunden und aus einer Bodenprobe isoliert» die bei liyogisan» Gunma im Jahre 1964 (August) gesammelt worden ist. Dieser Stamm wurde mit der Laboratoriums-Huramer M89O-C2 versehen. Megamycin konnte ferner von swei anderen Stämmen isoliert werden, welche die Laboratoriuma-Nuramsrn MA91-M1 und MA1Q4-M1 tragen. Der Stamm MA91-M1 wurde von einer Bodenprobe isoliert, die bei Nojiriko, Nagano, im Jahre 1965 (Januar) gesammelt worden ist. Der Stamm MA1O4-M1 wurde von einer Bodenprobe isoliert, die bei Sakoraachi, £okushima Oity im Jahro 1965 (Februar) gesammelt worden ist. Diese Stämme haben viele gemeinsame Eigenschaften mit dem Stamm M890-02 soitfie ferner mit Streptomyces purpeofuscus. Obwohl einige kleinere Unterschiede zwischen diesen Stämmen bestehen, wurden diese Stämme als Streptomyces purpeofuscus klassifiziert. Darüber hinaus wurde gefunden, dass eine Sypkultur von S. purpeofuscus (S. purpeofuscus Yamaguchi und Sabury, ISP 5285, wobei XSP dia Abkürzung für "International Streptomyces Projectⁿist} Megamycin erssugt. Der Stamm Nr. M890-02 warde am 6. Mai 1969 uater der Hummer 506 in Kogyogijutsuin Hakko Kenkyujo hinterlegt. Er vmrde ferner in der American 35,'pe Culture Collection unter der Nr, ATCG 21470 hinterlegt.

Der Stamm Nr. MÖ90-C2 besitzt folgende Eigenschaften: Unter dem Mikroskop entwickelt ein verzweigtes Substratmyzelium

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gerade bis gebogene Luftayzeln ohne eine Wirtelverzweigung noch eine Spiralenbildung. Die Oberfläche der Sporen ist glatt.

Die charakteristischen Eigenschaften in verschiedenen Medien (die Bezeichnung der Earbe wird in [3 geraäss dem "Color Harmony Manual" der Container Corporation of America beschrieben) sind wie folgt:

1. Auf einem (KLyzerin-Czapek-Agarmedium, inkubiert bei 27⁰C: Hellgelbes bis dunkelgelblich-braunes [Spice brown 4 al] Wachstum bildet in überreichem Ausmaß Luftmyaeln mit einer hellgrauen Farbe. Es wird ein bräunliches bis hellrötlichbraunes lösliches Pigment erzeugt.

2. Auf einem Krainsky-GO-ueose-Asparagin-Agarmedium, inkubiert bei 27°Ci Ein gelblich-braunes [luggage Tan 4 ne] bis dunkelgelblich-braunes [Clove Brown 3 ni] Wachstum erzeugt latftmyzeln mit einem gelblich-weissen bis leichtbräunlich-grauen Parbton. Das lösliche Pigment ist schwach braun.

5. Auf einem Caleiummalat-Agarmedium, inkubiert bei 27°C: Ein gräulich-braunes Wachstum [Pawn 4 ig] erzeugt gräulichweis se bis hellgraue Luftmyzeln. Es wird kein lösliches Pigment festgestellt. Das Calcluramalat-Wachstuia wird stark nach 3-tägiger Inkubation eolubillslert.

4. In einer Peptonlösung, die 1,0 # Natriumnitrat enthält und bei 27°C inkubiert worden ist: Farbloses bis hellgelbliohbraunes Wachstum ohne luftmyzein. Kein lösliches Pigment oder leichtbraunes Pigment. Es wird eine schwache Nitratreduktion festgestellt.

5. Auf einem bei 27°C inkubierten Kartoffeistttck:. Gerunzeltes

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hellgelblich-braunes [Lt Gold 2 ic] bis gelblich-braunes [Xellow Maple 3 ng], später dunkelgelblich-braunes [Clove Brown 3 pi] bis schwarzes Wachstum , EeineLuftmyzeln* Scliwacli-bräunliches lösliches Pigment.

β. Auf einer Stärke-Agarplatte, inkubiert bei Zl⁰Qi Bin hellgelblich-braunes bis gelblich-braunes [Spice Brown 4 nij Wachstum erseugt Xuftmyaeln mit einer gelblich-welssen bis leicht grauen Farbe, Bräunlich Ms hellrötlich-braunes lösliohes Pigment. Positive Hydrolyse von Stärke.

7. Auf einem KMhrmittel-Agarmedium, inlcubiert bei 37⁰O: Kein Wachstum innerhalb einer Inkubation von 14 Sagen.

S. Auf einem Nähr-Agarmedium, inkttbiert bei 27°C: Sin hellrötlich-braunes [Brick Sed 6 1/2 ng] Wachstum erzeugt keine Iniftmysseln, jedoch ein hellrötlich-braunes lösliches Pigment.

9. Auf einem koagulierten Iioeffler-Serummedium, inkubiert bei 37⁰GJ £ein Wachstum innerhalb einer 14-tägigen Inkubation. ; ; ; .' ; - ^: : ^{: :} "^{: :} '■■■'.'■' ' ' -^{: :}

10. Auf einem bei 20°0 gezüchteten Gelatinetumpf; Bin farbloses bis hellgelblich-braunes Wachstum erzeugt keine üuftmyzeln, jedoch ein lösliches Pigment mit einer braunen bis dunkelbraunen Parbe, Die Terfliissigung von Gelatine ist

..stark. ^: ■'_' ■ '.';■'.' - ■■■ .;■: /

_t11. Auf einer bei 37^0 inkubierten entrahmten Milchs Ein farbloses Wachstum erzeugt keine Iuftmyzeln und auch kein lösliches Pigment, Nach einer vollständigen Eoagulierung der Miloh bei einer 4-tägigen Inkubation erfolgt eine langsame Peptonisierung.

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12. Auf einem "bei 27°C inkubierten lyrosin-Agarmedium: Ein farbloses oder graues bis dunkelbraunes Wachstum erzeugt dünne Luftmy2eln mit einer weiseen bis gräulich-weissen Farbe«, Die Bestimmung der ülyroslnaseaktivltät ist schwierig, und zwar infolge einer schwärzlichen Pigiaentierung eines löslichen Pigments.

13. Auf Zellulose (Filterpapier), inkubiert bei 27⁰O: Geringes Wachstum ohne Zersetzung von Zellulose.

14. Verwendung von Kohlehydraten auf einem Pridham-Gottlieb-Basalmedium, inkubiert bei 27°0? Positives Wachstum mit Stärke, Dextrin, Glyzerin, Galaktose, Glukose, Bohrzucker, Kaitose und Mannose. Negatives Wachstum mit Inosit, Laktose, Mannit, Haffinose, Hhamnose, Inulin, Sorbit, 3?ruktose, Xylose, Arabinose, Salicin und Dulcit.

Die charakteristischen Eigenschaften des Stammes Nr. ^T390~G2 können wie folgt zusammengefasst werden: Er gehört zu dem Genus Streptsnnyces und besitzt Luftmyzeln, die weder Spiralen noch Wirtein bilden. Die Oberfläche der Sporen ist glatt. Auf verschiedenen Medien bildet er ein dunkelgelblich-braunes Wachstum mit grauen oder leicht grauen bis leicht bräunlichgrauen Luftmyzeln. Br bildet kein lösliches Pigment oder nur in geringem Ausmaße ein leicht rötlich-braunes lösliches Pigment. Die Umkehr des Wachstums schlägt in Schwarz während der ÜEage der Inkubation über. Auf einem Hähragar bei 27°C bildet dieser Stamm ein rötlich-braunes Wachstum sowie ein rötlich-braunes lösliches Pigment* Br bildet ein Melaminpigment, hydrolysiert Stärke und besitzt eine relativ starke proteolytisehe Aktivität. Diese Eigenschaften stimmen mit denjenigen von Streptomyces purpeofuscus Yamaguchi und Saburi

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(beschrieben im International Journal of Systematic Microbiology, 18_e 364, 1968) ttberein» Jedoch verbraucht der Stamm M890-02 keine laktose und Xylose, die von S. purpeof uscus verbraucht werden. Andererseits verbraucht der Stamm Hr. MA1O4-M1 Xylose. Obwohl die erfindungsgemäss isolierten Stämme, welche Megamycin erzeugen, geringfügig von der bekannten Spesies von S, purpeofuscus abweichen, wurden sie dennoch als S. purpeofuscus bezeichnet. Darüber hinaus erzeugt die Typkultur von S. purpeofuscus (ISP 5283) Negamycin. Hinsichtlich der Herstellung von Antibiotika durch S. purpeofuaous Yainaguchi und Saburi gibt es nur eine einzige Veröffentlichung (J. of General and Applied Microbiology, 1, 201 ~ 234, 1955). Darin wird angegeben, dass das KuIturfiltrat gegenüber >Trichomonas, grampositiven Bakterien sowie säurebeständigen Bakterien eine inhibierende Wirkung zeigt. Man findet keinen Hinweis auf die Erzeugung von Antibiotika die gegenüber gramnegativen Bakterien wirksam sind. Daher steht fest, dass bisher noch niemals beobachtet wurde, dass Negamycin hergestellt werden kann, obwohl S. purpeofuscus ©ine bekannte Spezies ist.

Wie bekannt, ist Streptomyces im allgemeinen nicht stabil und liefert leicht Mutanten und Varianten, und zwar sowohl auf künstlichem als auch auf natürlichem Wege. Erfindungsgemäss umfasst Streptomyces purpeofuscus alle diese Mutanten und Varianten, welche Megamycin erzeugen, d.h. auch diejenigen, die nicht absolut von S. purpeofuscus unterschieden werden können und Negamyoin erzeugen.

Methode zur Bestimmung der Negamyeinmenge:

Diese Menge wird durch eine übliche Zylinderplattenmethode bestimmt, wobei reines Negamyein als Standard verwendet wird.

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Als anfälliger Organismus wird beispielsweise E. coli K12, Pseudomonas aeruginoea oder dergleichen verwendet, ι

Wird S. purpeofuscus unter geeigneten Bedingungen gezüchtet, dann wird Negamycin erzeugt. Bine GärungabrUhe, die Negamyein enthält, wird in der Weise hergestellt, dass Sporen oder Myzeln des Negamyoin-erzeugenden Organismus auf ein geeignetes Medium aufgeimpft werden, worauf unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird. Zur Erzeugung von Negamycin ist eine Züchtung auf einem festen Medium möglich. Zur Erzeugung grösserer Mengen wird jedoch eine Züchtung in einem flüssigen Medium bevorzugt· Jede Gärungstemperatur kann dabei eingehalten werden„ und zwar innerhalb des Bereiches, in welchem der Negaiayein-erzeugende Organismus wachsen und Negamycin erzeugen kann. Ein Bereich von 25 - 32°0 wird bevorzugt. Medien, die aus bekannten Nähr~ quellen für Schimmelpilz bestehen, eignen sich zur Erzeugung von Megamycin, Beispielsweise eignen sich als Stickstoffquelle Pepton, Fleischextrakt, N-Z-AmIn, Kasein, Sojabohnenmehl, Maisflüssigkelt, Erdnussmehl, Baumwollsamenmehl, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat sowie andere stickstoffhaltige Materialien, wie beispielsweise Weizenkleie, ReIskleie oder dergleichen. Als Kohlenstoffquelle kommen beispielsweise Glukose, Glyzerin, Stärke, Maltose, Dextrin, Hohrzucker, Laktose, Sojabohnenöle oder andere Kohlehydrate oder andere Fette in reinem oder rohem Zustand in Frage. Natriumchlorid, Natriumoder Kaliumphosphat, Calciumcarbonat oder dergleichen können . ebenfalls verwendet werden. Gegebenenfalls können Spuren an Metallsalzen zugesetzt werden* Jeder Bestandteil, der von den Negamycin-erzeugenden Organismen unter Gewinnung von Negamycin verbraucht wird, ist geeignet.

Die Gärung wird solange fortgesetzt, bis eich eine erhebliche Negamycinmenge angereichert hat. Beispielsweise können Sporen

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und Mysein auf einer Schrägkultur von S. purpeofuseus auf ein Medium auf geimpft v/erden, das aus 2₈0 f° Glukose, 2,0 # Stärke, 2,0 # Sojabohnenmehl, 0,5 f> Hefeextrakt, 0,25 # Kaliumchlorid, 0,35 $> Galoiumcarbonat, 0,0005 # OuSO..5HgO, 0,0005 # MnCl₂.7H₂O und 0,005 # ZnSO₄.7HgO (eingestellt auf einen pH von 7_t0) besteht. Dann erfolgt ein Züchten unter Schütteln bei 27°C. Man stellt eine Anreicherung von Hegamyein während einer Zeitspanne von 3-8 Sagen fest, beispielsweise in einer Menge von 20 p.g/ml nach 3 Tagen, 108 ug/ml (pH 7,4} am 6. 3?ag₉ 185 ^g/ral (pH 7,6} am 7. Sag und 122 ug/ml (pH 7,8) am 8. £ag.

Megamycin ist in seiner wässrigen Lösung relativ stabil. Nach einem Erhitzen von 5 mg/ml einer Negamycinlösung mit wechselnden pH-Werten (d.h.1,8, 7*2 und 9,2) bei 6O⁰C während einer Zeitspanne von 30 Minuten verbleiben 91 $ ohne Zersetzung. Werden £iegamycinlo*sungen mit 2 mg/ml bei verschiedenen pH-Werten bei 21°0 während einer Zeitspanne von 1 Woche gehalten, dann werden die folgenden Prozentsätze an Negamyoin in unzersetzter Form festgestellt: 86 $ bei einem pH von 2,25» 80 ^cfi bei einem pH von 4»90, 76 $ bei einem pH von 7»15# 89 # bei eisern pH von 9_f0 und 79 ί> bei einem pH von 10,2.

Durch, die Erfindung werden ferner Methoden zur Extraktion und Reinigwag von Hegamyoin zur Verfügung gestellt. Negamyoin ist in Wasser löslich und liegt hauptsächlich in dem flüssigen Seil der därungsbrühe vor. Megamycin in der Brühe wird nicht aus der Brühe in organische. Lösungsmittel übertragen, beispielsweise in Butanol, JLthylaoetat, Äther, Chloroform oder Benzol.

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Bei Verwendung von Adsorptionsmittel« kann Megamycin aus der Gärbrtthe oder aus seiner wässrigen Lösung abgetrennt werden. Aktivkohle ist eines der bevorzugten Msorbentien. An Aktivkohle adsorbiertes Negamyein kann in wirksamer Weise durch wässriges Methanol, wässriges Butanol oder wässriges Aceton eluiert werden. Die Bluierung erfolgt noch leichter, falls die Eluierung in saurem Medium unter Verwendung von Chlorwasserstoff säure erfolgt. Wenn auch Negamycia eine Garbonsäuregruppe aufweist, so ist das Molekül dennoch durch das Vorhandensein von zwei basischen Gruppen basisch und lässt sich von einem Kationenaustauscherharz adsorbieren. Bin Kationenaustauecherhara eignet sich am besten zur Extraktion von Megamycin aus der Kulturbrtthe oder aus seiner wässrigen Lösung. Alle Arten von Harzen mit Carbonsäuregruppen oder Sulfonsäuregruppen sind geeignet. Diese Harze können in der H-Form_f in der Hatriumform, in der Kaliumform oder in der Ammoniumform oder in gemischten Formen verwendet werden. An dem Kationenaustausoherharz adsorbiertes Megamycin kann mit einer Säure eluiert werden, beispielsweise mit Chlorwasserstoff säure, Schwefelsäure oder dergleichen, wobei jedoch in bevorzugter Weise wässriges Ammoniak verwendet wird. Ne gamyein, das eine Carbonsäuregruppe aufweist, kann ebenfalls von einem Anionenaustauscherharz adsorbiert werden. Beispielsweise adsorbiert Dowex 1X2 (Warenzeichen der Dow Chemical Co», TJSA) in der OH-lform Megamycin· Das adsorbierte Hegamyoin kann mit verdünnter Chlorwasserstoff säure eluiert werden. Anionenaustauscherharze mit schwach basischen Gruppen, wie beispielsweise Amfcerlite JBA3 (Warenzeichen der Firma Rohm & Haas Co., USA) in der OH-Fortn können s~or Neutralisierung einer sauren ifegarayoinlöaung verwendet werden, ohne dass dabei merkliche Mengen dieses Antibiotikums adsorbiert werden.

Die Myzeln in der Gärbrühe können durch Filtrieren oder Zen-

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trifugieren entfernt werden. Die Myzeln-enthaltende GärbrÜhe lcann ferner direkt auf eine Harskoloane aufgebracht werden, ohne dass dabei vorher die Myzeln entfernt werden, sofern grosse teilchen, welche ein Durohfliessen durch die Kolonne verhindern, durch Durchschicken durch ein Metallnetz entfernt werden. Kachfolgend wird eine Methode angegeben, die sich zur Isolierung von Negamycin aus der GärbrÜhe von S. purpeofuecus eignet: Die GärbrÜhe wird filtriert oder zentrifugiert, worauf das FiItrat oder die überstehende Flüssigkeit durch eine Kationenaustauscherharz-Kolonne (70 # in der NH^-Form) geschickt wird. Nachdem die Kolonne mit Wasser gewaschen worden ist, wird das adsorbierte Negamyein mit 2,0 jS.igem BH₄OH in Wasser eluiert. Das Negamycin-enthaltende Eluat wird unter vermindertem Druck zur Entfernung von Ammoniak konzentriert. Die konzentrierte lösung wird durch eine Säule aus Dowex 1X2 in der OH-Form geschickt. Nach, einem Waschen mit Wasser wird das Megamycin auf dem Harz mit 0,5n HOl eluiert. Das Eluat, das Megamycin enthält, wird mit IR 45-Harz in der OH-Form neutralisiert und unter vermindertem Druck zur Srockne eingedampft. Dabei wird ein rohes Pulver aus Eegaraycin-Hydrochlorid erhalten. Das rohe Pulver des Hydrochloride wird ixt Wasser gelöst und durch ein Harz geschickt, beispielsweise durch AmberIite OGr-50 (Warenzeichen der Rohm und Haas Company, USA) in der HHv-Porm, worauf eine chromatographische Entwicklung mit Wasser oder 0,1 ^igem UH^OH erfolgt. Die Fraktionen, welche Megamycin enthalten, werden unter Yakuum eingedampft. Dabei wird ein weisses Pulver aus reinem Megamycin erhalten. Ist die Reinheit nicht ausreichend, dann wird die Chromatographie wiederholt. Ferner kann Megamycin durch Zugabe einer wasserunlöslichen Säure, beispielsweise Pi er In säure, p-Hydroacyazobenzol-p⁹-aulfonßäure oder dergleichen, ausgefällt werden. Kegamyein kristallisiert als Salz von p-Hydroxyazobensol-p'-Bulfonsäure aus. Dad in diesen wasserunlöslichen Salzen enthaltene Nega-

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mycin kann von den Säuren nach bekannten Methoden zur Abtrennung einer Base von einem wasserunlöslichen Salz abgetrennt werden. Beispielsweise wird Negamycin-p-hydroxyazobenzol-p'-sulfonat »it HCl in Äthanol behandelt, wobei Hegamycin-Hydrochlorid ausgefällt wird. Eine, in Wasser unlösliche Säure, wie beispielsweise Targitol 4, Sargitol 7 (union Carbide and Carbon Chemical Co.) sowie Hatriumlaurylsulfonat können ebenfalls zur Ausfällung von Hegamycin verwendet werden. .

Nach einer der vorstehend beschriebenen methoden gereinigtes Negamycin liegt in Form eines weissen Pulvers vor. Es ist in Wasser löslich und in Methanol, Äthanol, Estern sowie in Benzol unlöslich, Negamycin in der wässrigen Lösung zeigt eine Bndabsorption, jedoch keine maximale Absorption von UV-Licht zwischen 220 und 400 mu. Es ist amphoter und zeigt stark basische und schwach saure Eigenschaften. Unter einer Spannung von 3500 V sowie bei einem pH von 1,8 (Puffer) (Ameisensäure/Essigsäure/ Wasser, 25:75:900, bezogen auf das Volumen)bewegt sich Sfegamycin um 12 cm an die Kathode. Setzt man die Beweglichkeit von Alanin gleich 1,0, dann ist die Beweglichkeit von Negamyοin 1,4. Es bildet Säureadditionssalze mit Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, p-Hydroxyazobenzol-p*-sulfonsäuren Picrinsäure oder dergleichen. Das eine Oarboxygruppe aufweisende Megamycin bildet ferner Metallsalze und -ester. Es liefert positive Reaktionen auf Ninhydrin, Rydon-Smith-Reagens und negative Reaktionen auf Anthron und Sakaguohi-Reagens. Erhitzt man es auf 105⁰G in 6n HOl während einer Zeitspanne von 6 Stunden, dann zeigt das Hydrolysat mehr als 3 Ninhydrin-Produkte (die Hauptprodukte bestehen aus drei Produkten). Die drei Haupthydrolyse-Produkte sindsT-Hydroxy-ß-lysin, N, IP-Dime thy 1-hydrazin und Methylamin. Saroosin sowie 1-Methylhydraginoesaigsäure werden als in kleineren Mengen anfallende Hydrolyse-Produkte erhalten.

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Hochreines Megamycin schmilzt allmählich beginnend bei und zersetst sich unter Schäumen bei 110 - 120'°C. Die Elementaranalyse liefert folgende Werte:

Berechnet für C₉H₂₀Ef₄O₄,2HgOs 0 30,02,, H 8,5V N 19,7t, 0 53,77 Gefunden; C 37,78, H 8,62, Ii 18,94, 0 31,70.

Es wird ein 5!itrationsäg,uivalentvon 287 erhalten. liegamyein-phydroayaaobenaol-p^-sulfonat fällt in Form gelb-oranger Kristalle (3?. 180 - 182°C, Zersetzung) an. Diese Verbindung geigt eine antibakterielle Aktivität, die etwa 1/3 der Aktivität von legamyein entspricht. Die Analyse liefert folgende Ergebnissei

Berechnet für O₉H₂₀JSf₄O₄(C ₁₂Η-,Q^₂O₄S\2H₂O: 0 47,15, H 5,27, N 13,33, 0 26,64, S 7,63

Gefunden! C 47,09, H 5,16,, M 13_s2O, 0 25,53, S 8,0i/

Megamycin weist drei titrierbare pE-iierte auf, und zwar wie folgt: 3,55, 8,10 und 9,75. Im Infrarotspektrum von Megamycin_s das unter Verwenoitng von Kaliumbromid aufgenommen wird, werden Absorptionsbanden bei folgenden Wellenzahlen in ei"¹ beobachtet: 3430, 3200, 305O₁ .2950, 1660, 1590, 1405, 1320, 1140, Ί05Ο, 970, S9Q, 820 und 720« iregamycin-p-hydro2qyazobenzol-p'-sulfonat zeigt Absorptionsbanden bei folgenden Wellenzahlen in cm" : 3550, 3400, 3350, 3250, 3200, 3O5O_r 2950, 1730, 1690, I6OÖ, 1560, 1510, 1440, 1430, 1400, 1360, 1280-1100, 1060, 1030, 1010, 990, 960, 945, 9Q0, 880, 850, 800, 715 und 680, Bei diesem Salz tritt die Bande für die Garbonsäure bei 1730 em" "auf. Das Infrarotspektrum von Hegamycin-Methylester besitzt die Banden bei folgenden Wellenaahlen in our ¹S 3400, 3200, 3000, 2950, 1740, 1665, 1600, 1485, 1445, 1400, 1220, 1140, 1050, 1000, 960, 890 und 720, Die Bande für die Estergruppe liegt bei 1740 und 1220 cm""¹.

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Die bereits gezeigte Struktur wird aufgrund einer Massenspektrometrie vom WegamyciB~Me thy !ester und !Eriaoetyl-iTegamycin-Methylester sowie durch Bestimmung der Strukturen der Hydrolyse-Produkte nahegelegt.

Negamyein hemmt ei» Wachstum von gramnegativen und -positiven Organismen« Wird die antitoaktesräelie Wirkmng durch Agarstrichmethoden unter Verwendung von Pleisehextrakt/Pepton-Agar getestet, dann werden folgende Organismen bei den angegebenen Konzentrationen ishibiert (es wird eine Ib eine Schleife gehende Menge einer 20 Stunden altea Mtatatihenln&tur aufgestriehenj die Werte in den Klammern sind die Konzentrationen der jeweiligen Inhibieruügi Staphylococcus aiaeus 209p 50 ug/ml, Staphylococcus sureuß 195 12,5 ytg/mL (6,12 isg/ml), Staphylococcus aureus Smith 50 ug/ml, Sarcina lutea POI-ICK)I 12,5 }ig/ml (1/56 ug/ml), Bacillus subtilis 11HL-B558 25 Jig/ml (12,5 ng/ffll), S. coil KI2 3,12 jjg/ml (1,56 ng/ml)_s B. ooli HIHJ 12,5 ug/ml (3₈12 ug/ml), Shigella fleaoieri 12*5 jXß/tiL, Salmonella typhosa 3,12 ug/ml, KLetslella pneumoaiae POI 602 12,5 ug/ml (6,25 ug/ml), Seratla isarscescejsis 12,5 pg/aü. (6_S25 ug/ml), Proteus vulgaris, 0X19 6,25 ug/ml, Proteus rettgeri (GN311) 12,5 ug/ml (6,25 ug/ml)_f Pseudomonas aeruginosa (Hr. 2) 12,5 ug/ml, Pseudomonas aeruginosa Nr. 3 25 ttg/o£L (12,5 ug/ml), Pseudomonas fiuorescens 6,25 ^ig/ml (3,12 ug/ml), Mycobacterium smegiaatis 60? 100 ^ig/ml. Wird die 20 Stunden alte Nähxlbrühenkultur auf das 1000-fache verdiinnt und wird eine in eine Schleife gehende Menge aufgestrichen, dann wird die Wachstwmsinhibierung um die Hälfte der vorstehend angegebenen Inhibierung vermindert. Bei Verwendung eines aus 0,5 # Pepton bestehenden Ägar ist die inhibierende Wirkung stärker als im Palle des Fährmittelagars. Die nachstehend angegebenen Organismen werden bei den angegebenen Konzentrationen inhibiert: (Die Werte in den Klammern sind die Konzentrationen der jeweiligen Inhibierung):

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S₀ aureus 209p 1,56 ug/ml, S. lutea POI 1001 5,0 ug/ml (2,5 jHg/ml)· B. subtilis NBEL-B558 ,12,5 }ig/ml, E.coli K12 1,56 ug/ml_r E. coli HIHJ 1,56 ug/ml, S. flexneri 3,12 K. pneumoniae PCI 602 6,25 ug/ml (3,12 ug/ml), S. typhosa <CQ_t78 pg/ml, Er. rettgeri CN311 1,56 ug/ml, S. marscescens 12,5 ug/ml (3,12 ug/ml), Ps. aeruginosa Nr. 3 6,25 ug/ml, Ps. aeruginosa Nr. 46 3,12 ug/ml (1,56 ug/ml), M. segmatis 50 ug/ml. Die inhibierende Wirkung von Megamycin wird durch Serum nicht reduziert. Beispielsweise wird E. coli durch 3,12 ug/ml Negamycin in allen Medien inhibiert, die Serum in Mengen von 0, 5, 10, 20 und 40 $> enthalten, ifegamy.cin besitzt eine stärkere, .antibakterielle Wirkung im alkalischen Medium, beispielsweise sind die inhibierenden Konzentrationen gegen S. coli in 0,5 S& igem Pepton in Wasser bei verschiedenen pH-Werten wie folgts pH 5,0 12,5 ug/ral (3,12 ug/ml) pH 6,0 12,5 ug/ml (3,12 ug/ml), pH 7,0 3,12 ug/ml (1,56 ug/ml) pH 8,0 1,56 ug/ml (0,78 ug/ml), pH 9,0 1,56 ug/ml (0,78 ug/ml). Bei der IJurchführung einer Zylinderplattenmethode unter Verwendung eines aus 0,5 # Pepton bestehenden Agars und B. coli £12 zeigen 25 ug/ml Megamycin folgende inhibierende Durchmesser bei folgendem pH: pH 6,0 16 mm, pH 7,0 20 mm, pH 8,0 21 mm.

Negamycin besitzt eine geringe Xoxizität. Die intravenöse Injektion von 400 mg/kg verursacht den Tod von Mäusen. Keine toxische Wirkung wird beobachtet, wenn 200 mg/kg täglich intraperitoneal während einer Zeitspanne von 30 Sages in Mäuse injiziert werden. Negamycin besitzt auch keine verzögerte Toxiaität,

Die intramuskuläre Injektion von 50 mg/kg an Kaninchen ergibt eine hohe BIutkoneentration, beispielsweise 100 ug/ml 1 Stunde nach der Verabreichung, wobei 80 $ in den urin nach

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24 Stunden abgeschieden werden, wie eine hohe Urinkonzentration zeigt, beispielsweise 4480 ug/ral im Urin, der 1 Stunden nach der Injektion gelassen worden ist. Diese Ergebnisse zeigen die positive Wirkung auch in vivo. Megamycin ist wirksam gegen eine Infektion durch Pseudomonas aeruginosa Nr. 12, Klebsiella pneumoniae S-1802» Salmonella typhosa 63 und Staphylococcus aureus Sraith S-424 in Mäusen. Die GDRQ-Werte gegen diese Infektionen betragen 4,4, 5,0, 2,5 bzw. 12,5 mg/kg, falls 10 EDD intraperitoneal infiziert werden. Negamycin wird subkutan unmittelbar danach sowie 6 Stunden nach der Infizierung injiziert.

Wie vorstehend erwähnt, ist Negamycin eine antibakterielle Substanz mit einer geringen iCoxizität, die grampositive und -negative Bakterien einsohliesslich Pseudomonas zu inhibieren vermag. Dieses Antibiotikum lässt sich in einfacher Weise von bekannten Antibiotika aufgrund seiner Analyseergebnisse, seines Infrarotspektrums, seiner amphoteren Eigenschaften, seines Verhaltens bei einer Hochspannungs-Elektrophorese sowie seiner Struktur unterscheiden. Daher ist Megamycin definitiv ein neues Antibiotikum.

Wie aus der Struktur hervorgeht, liefert eine Hydrolyse von Negamycin 1-Methylhydrazino-Essigsäure, welche sich in N, N¹-Dimethylhydrazin umwandelt. 1-MethylhydraBino-Essigsäure vermag, wie erfindungsgemäss ermittelt wurde, eine (Jlutaminsäure-Pyruvat-Xransaminase zu inhibieren und Übt eine Lebertoxizität aus. Negamycin besitzt jedoch keine derartige Toxizität. Erwägt man jedoch eine mögliche Hydrolyse, dann sollte Negamycin zur Behandlung von empfindlichen Stellen nur kurzzeitig verabreicht werden. Negamycin lässt sich auch lokal zur Behandlung von Oberflächeninfektionen verwenden, beispielsweise von Infektionen der Haut und der Mucosamembran.

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Darüber hinaus eignet sich Negamyein zur Synthese von Negamycin-Analoga.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

125 ml eines Mediums, das 2 fo Glukose, 2 j£ Stärke, 2 ^ Sojabohnenmehl, 0,5 $> Hefeextrakt, 0,25 # 3JaOl, 0,35 # OaCO,, 0,0005 1» OuSO₄.5H₂O, 0,0005 $ MnGIg,7HgO und 0,0005 % ZnSO^.7HgO enthält, wird in einen Schüttelkolben mit einem Fassungsvermögen von 500 ml gegeben. Nach dem Einstellen des pH auf 7,0 wird das Medium bei 120⁰O während einer Zeitspanne von 20 Minuten sterilisiert. Auf dieses Medium werden 2,5 ml einer 2 Tage alten, geschüttelten Kulturbrühe des Stammes Nr. M890-02 aseptisch auf geimpft. Das Medium für die Impfkultür enthält 1 $ Glukose, 1 £ Stärke, 0,75 $ Fleischextrakt, 0,75 # Pepton, 0,3 ^ NaGl, 0,1 # MgSO₄₀7HgO, 0,0007 # OuSO₄.5H₂O, 0,0001 f FeSO₄^H₃O, 0,0008 £ MnCl₂.7H_g0 und 0,0002 ft ZnSO₄.7HgO. Das Schütteln erfolgt mit 130 Hin- und Herbewegungen pro Minute während der Gärungsperiode (5 Tage). Die Temperatur wird bei 27°0 gehalten. Diese KuIturbrühe wird zur Abtrennung von Myzein sentrifugiert. Man erhält 6000 ml eines Filtrats aus den 60 Kolben. Das FiItrat enthält 35 ug/ωΐ Negamyein. Das FiItrat wird durch eine Säule (Durchmesser 30 mm) geschickt, die 400 ml Amberlite IRO-50 (70 i> in der Na-Form) enthält. Nach einem Waschen mit Wasser wird Negamyein mit 20 tigern Ammoniak in Wasser eluiert. Die aktive Fraktion (600 ml) wird unter vermindertem Druck konzentriert. Man erhält 144 ml einer konzentrierten Lösung (pH 9,4, 800 pg/mL).

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Die konzentrierte Lösung wird durch eine Säule (Durchmesser 16 mm) geschickt, die 60 ml Dov/ex 1X2 (OH-Forra) enthält. Nach einem Waschen mit 200 ml Wasser wird Megamycin mit 0,5n HCl eluiert. Nach einer Neutralisation mit Amberllte HM-5 (OH-Form) wird die aktive Fraktion unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält ein Rohpulver aus Negamycin-Hydrochiorid in einer Menge von 300 mg (Reinheit 21 ^).

Beispiel 2

300 mg eines Rohpulvers von Negamycin-Hjydrochlorid, das gemäss Beispiel 1 erhalten worden ist, werden in 10 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule (Durchmesser 16 mm) geschickt, die 60 ml Amberlite CG-50 (NH^-Form) enthält. Anschliessend wird destilliertes Wasser durchgeschickt. Der Abfluss wird in 10 ml-Fraktionen eingeteilt. Der aktive Abfluss findet sich zwischen den Fraktionen 57 und 96. Aus den Fraktionen 57 - 74 erhält man 25 mg (Reinheit 68 ug/mg) eines leicht gelblichen Pulvers, das aus Negamyoin besteht. Aus den Fraktionen 75 - 85 erhält man 20 mg eines farblosen Pulvers aus reinem Negatoycin. Die Fraktionen 86 - 96 liefern 19 mg (Reinheit 910 jig/mg).

Beispiel 3

Es werden verschiedene Arten von Austauecherharzen zur Isolation von Negamyoin getestet. Das gemäss Beispiel 1 erhaltene Brtthefiltrat (200 ml) wird durch eine Säule geschickt (Durchmesser 10 mm), die 10 ml eines Harzes enthält. Die Säule wird mit 50 ml Wasser gewaschen und anschliessend in der nachstehend geschilderten Weise eluiert. In allen Fällen wird in den AbflUssen sowie in dem zum Waschen der Säule verwendeten Wasser keine Aktivität festgestellt. Es werden folgende Ergebnisse erhalten:

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Ionenaustauscher- Hars	T₃Tg	Eli	iierunj	HH₄OH	Gewinnung von
Amberlite IRO-50	H-IOrm	2 5	£ iges	HH₄OH	45 %
Amberlite IRG-50	70 i> Ha- Eorm	2 ?	S Iges		52 i>
Amberlite IRO-SO	70 % Ha- Porm	In	HOl	BH₄OH	29 $>
Amberlite IRO-50	70 $ HH₄-	2 ^ iges	HH₄OB	55 ^
Amberlite IR-!20	H-Porm	25	4	45 ^
iewatit SP-100	H-lorm	2 5		50 i>
Beispiel 4
δ iges
i iges

10 1 eines Mediuißs, das die gleichen Bestandteile wie. in Beispiel 1 angegeben enthält, wird in eine GlasgäaTungsvorrichtitog mit einem iassungsvermögen τοη 20 1 gegeben. Hach einer * Sterilisation werden 500 ml der geschüttelten Kttlturbrühe des Stammes Nr. H890-Ö3 aseptisch aufgeimpft. Die Gärung wird bei 27°0 während einer Zeitspanne von 90 Stunden unter Be-IUften und Rühren durchgeführt. Diese Kulturbrühe (pH 7,4) wird snpir Abtrennung von Myzein zentrifugiert. Man erhält 6460 ml (41 «g/nü.) eines Piltrats. Das^Piltrat wird durch eine Säule (Durchmesser 30 mm) geschickt, die 400 ml Amberlite IRO-50 (zu 70 f in der Ha-Porm) enthält. Hach einem Waschen mit 3000 ml Wasser wird Negamycin mit 2 tigern Ammoniak verdünnt, Das aktive Eluat (400 ml) wird unter verminder tem Druck getrocknet. Man erhält 685 mg (Reinheit 150 ug/rnl) eines bräunlichen Pulvers aus rohem Hegamycin,

Beispiel 5

Negamycin wird in einer Menge von 102 mg in 8 ml Wasser, das 15 i» ithylenglykolmonomethylather enthält, gelöst* Dieser

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Lösung werden 106 mg Hatrium-p-hydroxyaBobeneol-p'-sulfonat zugesetzt. Die Mischung wird auf 50⁰C sum Auflösen erwärmt, worauf 0,5 ml 1 η HCl zur Einstellung des pH auf 3 eugesetst werden. Nach einem Lagern in einem Kühlschrank erhält man 49 mg gelb-orange-gafärbter Kristalle. Diese Kristalle werden aus einem gemischten Lösungsmittel (4,5 ml Wasser und 0,5 nl Methanol) umkristallisiert. Man erhält 28 mg gelb-orangegefärbter Kristalle (F. 180 - 182°C, Zersetzung). Die Kristalle weisen 34 # der Aktivität von freiem Negamycln gegenüber E. coll KI2 auf.

Analyse: Berechnet für

ö 47,13, H 5,27, H 13,33, 0 26,64, S 7,63

Gefunden: C 47,09, H 5,16, K 13,20, 0 25,53, S 8,01. Beispiel 6

130 !eines Mediums, das 3 i> Glukose, 1 # Stärke, 2 $ SoJabohnenmehl, 0,5 i» getrocknete Hefe, 0,35 $> CaOO«, 0,0005 1° OuSO₄.5HgO, 0,0005 $ 161012.7H₂O und 0,0005 # ZnSO₄.7HgO ent* hält, werden in eine Gärungsvorrichtung aus rostfreiem Stahl mit einem fassungsvermögen von 200 1 gegeben. Bach einer Sterilisation bei 120⁰C während einer Zeltspanne von 30 Hinuten werden 1,2 1 einer Kulturbrühe des Stamms Kr. H890-C2 aseptlsoh auf geimpft. Das Rühren erfolgt mit 200 üpm, während unter Verwendung von 25 Liter Luft pro Minute belüftet wird. Die Gärungsseitepanne beträgt 113 Stunden. Die Temperatur wird auf 27°C gehalten. Die aus 110 1 bestehende Kulturbrtthe (pH 7,4, 63 ug/ml) wird unter Verwendung von 8 kg Diatomeenerde nach einem Einstellen des pH auf 4,9 unter Verwendung von 1 6n HOl filtriert. Eineohlieeslich des sum Waschen des Filtere verwendeten Wassers erhält man insgesamt 117 1 eines Filtrate. Das Piltrat wird durch eine Säule gesohiokt, die 6,5 ml Amber-

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lite XEO-^O (su 70 # In der HH^-Foria) enthält, Räch einem Waschen mit Wasser wird das Negamycin mit 0,5n Ammoniak eluiert. Das aus 3 1 bestehende aktive Bluat wird auf 495 ml (3520 ug/ml) unter vermindertem Druck konzentriert. Sas Können trat wird durch eine Säule geschickt, die Dowex 1X2 (OH-Tyρ) enthält. Nach einem Waschen mit 350 ml Wasser wird ffegamyoln mit 0,5n HCl eluiert. Das aktive Bluat (180 ml) wird mit 3n .Ammoniak neutralisiert. Man erhält 5,5 g eines gelblichbraunen Pulvere aus rohem Hegamvoin (fieinheit 294 ug/mg) nach dem Trocknen. Die Gesamtauebeute beträgt 23»4 £.

Beispiel 7

3t4 g des gemäße Beispiel 6 erhaltenen Pulvers mit einer Beinheit von 29»4 £ werden in 22 ml Wasser aufgelöst, worauf die Lösung auf einen pH von 8,8 eingestellt wird. Diese Lösung wird auf eine Säule mit einem Durchmesser von 26 mm aufgebracht, die mit 250 ml Amberlite 00-50 (in der HH^-Form) gefüllt ist. Nach einem Waschen mit 500 ml Wasser wird 0,1 $iges NH₄OH durch die Säule geschickt. Das Bluat wird in 20ml-Fraktionen eingeteilt. Das Begamyoin wird in den Fraktionen 69 - 81 gefunden. Aus den Fraktionen 69 - 73 erhält man 233 mg (Beinheit 90 £} eines hellgelblichen Negamyoin-Pulvera. Aus den Fraktionen 74 - 77 erhält »an 383 mg eines reinen Megamycin. Die Fraktionen 78 - 81 liefern 395 mg eines reinen Negamyeins,

In den Bahnen der Erfindung fallen neben dem Negamyein auch Säureadditlonssalee von Megamycin mit organischen und anorganischen Säuren, wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Zitronensäure, Maleinsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Abcorbinsäure, Essigsäure, Ficrinsäure,

109846/1911 BAD OR₁GINAL

p-Bydroxyazobenzol-p'-sulfonsäure, Pectinsäure, Livoplmarin-6,8a-ois-endobernsteinsäure, SuI famine Sure, Glykolsäure und Mandelsäure. Pur therapeutische Zwecke verwendet man Salze nloht-toxisoher Säuren, während Salze toxischer Säuren» beiepielswelse p-Bydroxyazobenzol-p'rsulfonsäiire-Salz, für Isolatlonszwecke geeignet sind« beispielsweise als Ausfällmittel aus wässrigen Lösungen, sowie für Desinfektion*- «wecke, bei denen eine Soxisität keine Bolle spielt.

Für beet !mate Zweoke sowie nur Br» ie lung einer pharmazeutischen Verträglichkeit können den erfindungsgenässen Verbindungen andere Medikamente zugemischt werden, beispielsweise Antihistanine, Sulfadrogen (beispielsweise SuIfadlazln, Sulfabenzamid, Sulfacetamid, Sulfanilanid, Sulfapyridin, Sulfathiazol, Sulfapyrasin, Sulfaguanidin, Sulfathalidin, Sulfasuxidin, Sulfisoxazpl, Sulfan^lon, Phthalylsulfacetamid, N'-3,4-Ιϋΐηθthylbenzoylsulfanilaioid, Bensylsulfanilamid und N^l-2-(2-Chlnoxalyl)-sulfanilaiiid» lipotrope Mittel (insbesondere Methionin, Cholin, Inosit und ß-Sitosterol sowie Mischungen davon), Stimulant lan für das zentrale Nervensystem (beispielsweise Aspirin, Salicylamid, Batriumgentisaty p-Aoetylaminophenol, Phenacetin oder Kodein), Loxativa (beispielsweise Phenolphthalein), Sedativ» (beispielsweise Barbiturate und Bromide), Salze τοη Penicillin (beispielsweise Kaliumpenicillin G₉ Protein, Penicillin G, 1-Ephenaminpenlcillin Q₉ Dibcnzylaminpenioillin G, wobei diese Kombinationen besonders geeignet sind* um Änderungen des Blutspiegels zu bewirken), Phenoxymethylpanicilllra und Salze davon, andere antiblotische Mittel (beispielsweise Streptomycin, Dihydrostreptomycin, Kanamyoin, Bacetraoin, Poly my οin, Tyrothricin, Erythromycin, Chlortetraoyölin, Oxytetracyclin, Tetracyclin, Oleandomycin, Chloramphenicol,

BAD QRfGfNAL

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Magnaaircln, »ovoblocin, Gyoloaerin, Neomycin oder dergleichen). Xd einigen Fällen vermögen derartige Kombinationen auf breiterer Front einem Organismenangriff zu widerstehen, wobei sie anseerdem synergistische Wirkungen oder eine verminderte Xoxizität bei gleicher Wirksamkeit zeigen können. Stigesetst werden können ferner Vitamine (beispielsweise die Titamine A₉ A₁, Bj₉ B^₉ Bg und B^₂ sowie Glieder dieser ftutLlie, Folsäure sowie Hitglieder dieser Familie, die Vitamine C, Dg, D, und B)₉ Hormone (beispielsweise Cortison» ^ydrocortiaon, 9-a-Fluorcortison, 9-a-Fluorhydrocortieon, Preduison sowie Prednisolon), anabollsohe Mittel (beispielsweise 1i₉17-Dihydroxy-9-a-flüor-17-a-methyl-4-androeten-3-on, IT-a-Äthyl-^-norteetonteron) sowie gegen Pilse wirksaae Mittel (beispielsweise Myconstatin).

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Claims

- 24 -BatentansprUc he

/1Λ Negamyein, dadurch gekennzeichnet, dass es Peeudomonas, (-Salmonella, Shigella, Klebsiella, E. coli 12nd Staphylococci su inhibieren vermag, wobei dieses Negamycin eine Subs tans ist, die in Wasser löslich ist, in Methanol, Äthanol, Butanöl_t Setern, Chloroform und Benaol unlöslioh ist, kein Absorptionsmaximum des ÜY-Lichtes zwischen 220 und 350 mn zeigt, positive Reaktionen auf Ninbydrin und das Bydon-Smith-Beagens sowie negative Reaktionen auf Anthron und Sakaguohi-Heagens liefert, amphoter ist, 3 pK-Werte bei 3,55, 8,10 und 9»75 zeigt, Säure« additionssalze bildet, beispielsweise ein Ηνβtochlorid, Sulfat und p-HyäroxyaBobenzol-p'-sulfonat, einen l-^iylester bildet, der optisch aktiv ist C«3^⁹ = +2.5° (c2, HgO) und der Formel GqHgO¹^ °4 entspricht, wobei Hegamyoin aus s er dem Absorptionsbanden in dem Infrarotbereich des Spektrums zeigt, wenn es in pelletißierter Form mit Kaliumbromid gemessen wird, und zwar bei folgenden Wellengahlen in cm""¹: 3450, 3200, 3050, 2950, 1660, 1590, 1405, 1320, 1140, 1050, 970, 890, 820 und 720, wobei Negamycin ausserdem folgende Strukturformel besitst:

₂ OH NH₂ 0 ₅
2. Verfahren sur Herstellung von Negamycin gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Stamm von Streptomyces purpeofuscus in einer wässrigen Kohlohydrat-löaung gezüchtet wird, die ein stickstoffhaltiges Nährmittel enthält, wobei das Züchten unter aeroben Bedingungen solange durchgeführt wird, bis die Lösung eine antibakterielle Aktivität besitzt, und anschliessend das Negamyoin von der Lösung abgetrennt wird·

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3. Verfahren nach, Ansprach 2, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Organismus aus Streptomyces purpeofuscus AXCC 21470 besteht.
4. Verfahren naoh Anspruch 2, dadurch gekennseichnet, dass das Antibiotikum Negamyoin von einer wässrigen Lösung durch Adsorption an einem Kationenaustauschcrhare und anschliessende Bluierung abgetrennt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Antibiotikum Negamyoin aus einer wässrigen Lösung durch Adsorption an Kohlenstoff und anschliessende Eluierung abgetrennt wird.
6. Verfahren naoh Anspruoh 2» daduroh gekennzeichnet, dass das Antibiotikum Negamyoin aus einer wässrigen Lösung duroh Adsorption an einem stark basischen Anionenaustauscherhara und anschliessende Eluierung abgetrennt wird.
7· Verfahren nach Anspruch 2, daduroh gekennzeichnet, dass das Antibiotikum Negamyoin aus einer wässrigen Lösung durch Ausfällung mit einer wasserunlöslichen Säure und ansohliessende Abtrennung von der Säure gewonnen wird.
8. Verfahren nach Anspruoh 3, daduroh gekennseichnet, dass Ammoniak *ur Bluierung des adsorbierten Antibiotikums verwendet wird.

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