DE202007003784U1

DE202007003784U1 - Vorrichtung zur Reinigung von Biomolekülen

Info

Publication number: DE202007003784U1
Application number: DE202007003784U
Authority: DE
Original assignee: Sartorius Biotech GmbH
Current assignee: Sartorius Stedim Biotech GmbH
Priority date: 2006-04-06
Filing date: 2007-03-14
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2017-03-15

Abstract

Vorrichtung zur Reinigung von Biomolekülen durch adsorptive Stofftrennung in einem ein flächiges Adsorbens (6) aufweisenden Chromatographiemodul (2), dessen Gehäuse (3) mindestens einen Zulauf (4) und mindestens einen Ablauf (5) für flüssiges Medium (9) aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass eine Ultraschalleinrichtung (7) vorgesehen ist, mit der das flächige Adsorbens (6) mit Ultraschall beaufschlagbar ist.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur Reinigung von Biomolekülen durch adsorptive Stofftrennung tographiemodul, dessen Gehäuse mindestens einen Zulauf und mindestens einen Ablauf für flüssiges Medium aufweist.
Ein mit der Erfindung betreibbares Verfahren zur Reinigung von Biomolekülen durch adsorptive Stofftrennung umfaßt folgende Schritte:

a) optionales Äquilibrieren des Adsorbens mit einem flüssigen Medium,
b) kontinuierliches Inkontaktbringen des Adsorbens mit flüssigem Medium, welches mindestens einen Adsorbenden enthält,
c) Waschen des Adsorbens mit dem adsorbierten Adsorbenden,
d) Elution des Adsorbenden mit einem Eluens und
e) Auffangen des den Adsorbenden enthaltenden Eluats.

Die adsorptive Stofftrennung wird im Rahmen der Chromatographie zur Reinigung von Biomolekülen eingesetzt.
So ist beispielsweise aus der DE 102 36 664 A1 eine Vorrichtung und ein Verfahren zur adsorptiven Stofftrennung in flüssigen Medien, bei welchem ein flächiges Adsorbens mit einem Adsorbenden beladen wird, in dem das dem Adsorbenden enthaltende Medium mit der gesamten adsorptiv wirksamen äußeren Oberflächen des Adsorbens in Kontakt gebracht wird, bekannt. Die aus dieser Druckschrift bekannte Vorrichtung weist ein Chromatographiemodul bzw. einen Adsorber auf, der ein Gehäuse mit mindestens einem Zulauf und mindestens einem Ablauf für flüssiges Medium umfasst und ein flächiges Adsorbens mit mindestens einer adsorptiv wirksamen Oberflächenseite, welches zur Bindung mindestens eines Adsorbenden ausgelegt und im Gehäuse ortsgebunden angeordnet ist, wobei das Medium die gesamte adsorptiv wirksame äußere Oberfläche des Adsorbens über- bzw. umströmt wird.
Derartige Vorrichtungen und Verfahren, die sich grundsätzlich bewährt haben, weisen den Nachteil auf, dass es zu einer unspezifischen Wechselwirkung von unerwünschten Molekülspezies mit dem Adsorbens kommen kann. Dieses kann dann wiederum in den nachfolgenden Elutionsschritten zu einer Verringerung der Reinheit und der Ausbeute des oder der Zielmoleküle führen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die bekannte Vorrichtung so zu verbessern, dass bei einem mit ihr durchführbares Verfahren unspezifisch gebundene Proteine verringert bzw. entfernt werden.
Diese Aufgabe wird bezüglich der Vorrichtung in Verbindung mit dem Oberbegriff des Anspruches 1 dadurch gelöst, dass eine Ultraschalleinrichtung vorgesehen ist, mit der ein flächiges Adsorbens mit Ultraschall beaufschlagbar ist.
Es wurde überraschender Weise gefunden, dass die Beaufschlagung des flächigen Adsorbens mit Ultraschall in einem Flüssigkeitsbad ermöglicht, unspezifisch gebundene Proteine praktisch vollständig zu entfernen, was zu einer starken Steigerung der Reinheit des bzw. der Zielmoleküle führt.
Durch eine Ultraschalleinrichtung lässt sich die Wirkung der bekannten Vorrichtungen somit erheblich verbessern.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Adsorbens aus dem Chromatographiemodul in eine mit Flüssigkeit gefüllte Ultraschallwanne einer Ultraschalleinrichtung einbringbar.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Gehäuse des Chromatographiemoduls als Teil der Ultraschalleinrichtung ausgebildet. Dies hat den Vorteil, dass sich ein Entfernen des Adsorbens aus dem Chromatographiemodul vermeiden lässt, da dessen Gehäuse als Teil der Ultraschalleinrichtung bzw. als Ultraschallwanne ausgebildet ist.
Das Chromatographiemodul kann dabei auch partikuläres Chromatographiematerial als Adsorbens enthalten. Das Adsorbens kann aber auch als ein Membranadsorber ausgebildet sein. Der Membranadsorber kann dabei tangential angeströmt, umströmt oder soweit es sich um poröses Membranadsorbermaterial handelt auch durchströmt werden. Die Adsorber weisen für die abzutrennenden Stoffe eine selektive oder spezifische Adsorptionsfähigkeit auf. Das Adsorbens bzw. der Membranadsorber kann auch als eine Affinitäts- oder Ionenaustauschermatrix ausgebildet sein.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Adsorbens als eine Matrix mit

– ionischer Wechselwirkung und/oder
– hydrophober Wechselwirkung und/oder
– van der Waals'scher Wechselwirkung und/oder
– Wasserstoffbrücken Wechselwirkung und/oder
– einer Kombination aus ionischer und hydrophober Wechselwirkung und/oder
– reversibler kovalenter Wechselwirkung und/oder
– gruppenspezifischer Wechselwirkung und/oder
– chelatbildender Wechselwirkung ausgebildet.

Vorzugsweise wird bei der Durchführung des Verfahrens mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung während des Schrittes c) das Adsorbens mit dem adsorbierten Adsorbenden mit Ultraschall beaufschlagt.
Wie oben bereits geschildert, wurde überraschender Weise gefunden, dass die Anwendung von Ultraschall dazu führt, dass insbesondere während des Waschens und während der Elution des Adsorbens bzw. des Membranadsorbers unspezifisch gebundene unerwünschte Molekülspezies, praktisch vollständig entfernt werden, was zu einer starken Steigerung der Reinheit des Zielmoleküls führt. Vorzugsweise wird während des Schrittes d) das Adsorbens mit dem adsorbierten Adsorbenden mit Ultraschall beaufschlagt. Dies führt zu einer weiteren Verbesserung.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden während der Schritte c) und d) unspezifisch gebundene Proteine im Ultraschallbad entfernt.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann beispielsweise genutzt werden, um Lysozym als Adsorbens aus Hühnereiweiß zu gewinnen. Es ist aber auch möglich, Trypsin aus Pancreatin, einem Homogenat und anschließender Gefriertrocknung des Rinderpankreasinhalts zu gewinnen. Es ist auch die Gewinnung von, in das Nährmedium ausgeschiedenen, His getaggten Proteinen aus Hefe- oder Bakteriensuspensionen (Kulturüberständen), möglich.
Besondere Anwendungsgebiete sind Medien, welche Fette in Form von Micellen oder Lipoprotein-Aggregaten enthalten, also Serum, Plasma und Zellkulturmedien Zusatz von z.B. fötalem Kälberserum.
Partikelhaltige Medien können direkt, das heißt ohne Vorbehandlung, behandelt werden.
Als partikelhaltige Medien kommen dabei Suspensionen von tierischen und/oder pflanzlichen Zellen,
Zellkulturüberstände solcher Zellen mit Zellresten und partikulären Zellinhaltsstoffen, Suspensionen von Mikroorganismen wie Bakterien- und Hefezellen und deren Autolysate, Protozoen, mehrzelligen, virenhaltigen Medien oder
Gewebshomogenate, Aufschlämmungen von getrockneten und/oder gefrorenem biologischen Material, subzelluläre Fraktionen, Press-Säfte von tierischen und pflanzlichen Zellen und/oder Geweben wie Kartoffelfruchtwasser, Maisquellwasser und Sojamilch, Schlempen und Melassen, oder
Homogenate biologischen Materials, Körperflüssigkeiten wie Blut, Plasma, Serum, Harn oder Liquor, Milch, Molke, Pflanzensäfte und Exsudate, Nukleinsäure(n) enthaltende Medien in Frage.
Weitere Anwendungsgebiete sind auch Homogenate von Pflanzen, wie Blättern, Früchten oder Samen.
Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden speziellen Beschreibung sowie der Figur.
In der Zeichnung zeigt:
1: eine Seitenansicht eines Chromatographiemoduls im Schnitt.
Die Vorrichtung 1 zur Reinigung von Biomolekülen besteht im Wesentlichen aus einem Chromatographiemodul 2, dessen Gehäuse 3 mindestens einen Zulauf 4 und mindestens einen Ablauf 5 für flüssiges Medium 9 aufweist. Zur adsorptiven Stofftrennung ist in dem Gehäuse 3 ein Adsorbens 6 angeordnet. Weiterhin weist die Vorrichtung eine Ultraschalleinrichtung 7 auf, mit der das Adsorbens 6 mit Ultraschall beaufschlagbar ist.
Entsprechend 1 ist das Gehäuse 3 des Chromatographiemoduls 2 als Teil der Ultraschalleinrichtung 7 ausgebildet. Im Bodenbereich des Chromatographiemoduls 2 sind zu diesem Zweck Ultraschallschwinger 8 angeordnet, die geeignet sind, das das Adsorbens 6 umgebende flüssige Medium 9 in Ultraschallschwingungen im Sinne eines Ultraschallbades zu versetzen. Das Adsorbens 6 kann beispielsweise als ein aufgewickelter Membranadsorber 10 ausgebildet sein.
Beispiel:
Es wurde eine Vorrichtung wie in DE 102 36 664 A1 beschrieben, verwendet.
Es wurde ein stark sauerer Membranadsorber als Adsorbens mit Sulfonsäure Gruppen, S-Typ, Best. Nr. 18842 Charge 9900533 R27 B1 verwendet, die eingebaute Fläche war 7303 cm². 20 handelübliche Frischeier eines lokalen Lebensmittelhändlers wurden aufgeschlagen und die Dotter vollständig vom Eiweiß getrennt. Es wurden 700 g Eiweiß mit einem pH von 9,09 und einer Leitfähigkeit von 8,4 mS/cm erhalten. Der Gehalt an Lysozym betrug 4,0 mg/ml. Die gesamte vorhandene Menge war 2,8 g.
Die Bestimmung der Lysozym-Aktivität erfolgte nach der Methode von D. Shugar, in Biochim. Acta 8, 302 (1952). Hierbei wurde die Rate der Hydrolyse des Bakteriums Micrococcus luteus bestimmt. Eine Einheit entspricht hierbei der Abnahme der Absorption bei 450 nm von 0,001 bei pH 7,0 und 25°C.
Die Menge an gebundenem und eluiertem Protein wurde durch Absorption der Proben bei 280 nm in einem UV-VIS Spectrophotometer der Fa. Perkin-Elmer bestimmt. Dabei wurde ein kommerziell erhältliches Lysozym-Präparat (FLUKA Buchs, Schweiz) zu einer Konzentration von 1 mg/ml in Puffer gelöst.
Die Zusammensetzung der erhaltenen Proben wurde weiterhin mittels reduzierender SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese untersucht.
Durchführung der Adsorption ohne Ultraschall:
Der Adsorber bzw. das Adsorbens wurde mit 2 l eines Puffers mit 0,01 M Kaliumphosphat pH 8,0 im folgenden Puffer genannt, gespült, die Spüllösung verworfen. Dann wurde das Eiweiß ohne weitere Vorbehandlung mit Hilfe einer Schlauchpumpe und einer Flussrate von 2 l/min mit Rezirkulation, aus einer Vorlage, über das Adsorbens gepumpt. Es wurde alle 5 min eine Probe aus der Vorlage entnommen und die Lysozym-Aktivität wie oben beschrieben, bestimmt. Nach 15 min wurde der Membranadsorber entleert und entgegen der ursprünglichen Flussrichtung wieder eingebaut. Dann wurde der Membranadsorber mit 5 l Puffer ohne Rezirkulation gespült, nach jedem Liter eine Probe am Auslass des Adsorbers genommen und die Lysozym-Aktivität, wie oben beschrieben bestimmt. Es zeigte, sich, dass bereits nach 1,5 l Spülflüssigkeit keine Aktivität mehr auftrat. Danach wurde 0,5 l einer Lösung von 1 M NaCl in Puffer über den Membranadsorber rezirkuliert und das so entstandene Eluat aufgefangen. Dieser Schritt wurde vier Mal wiederholt. Die fünf Eluate wurden zusammengegeben und nach gründlichem Mischen die Lysozym-Aktivität bestimmt.
Durchführung der Adsorption mit Ultraschall:
Es wurde die gleiche Versuchsanordnung wie bei der Durchführung ohne Ultraschall verwendet. Der Membranadsorber bzw. das Adsorbens wurde dabei in ein mit Wasser gefülltes Ultraschallbad, Typ Sonorex Super 10 P, DK 512 P, der Fa. Bandelin, Berlin Deutschland, gelegt, so dass der Membranadsorber bzw. das Adsorbens vollständig eingetaucht war. Während der Schritte Waschen, und Elution wurde das Ultraschallbad auf seine höchste Leistung geschaltet. Das Wasser im Bad erwärmte sich während der Behandlungsdauer um 5°C.
Gleichzeitig wurden 3 ml einer Lösung von 1 mg/ml Lysozym in Puffer in einem geschlossenen Reagenzglas so in das Ultraschallbad eingelegt, dass es völlig von Wasser umgeben war. Nach Ablauf der Versuchszeit wurde eine Probe aus dem Reagenzglas entnommen und die Lysozym-Aktivität, wie oben beschrieben, bestimmt. Es konnte keine signifikante Abnahme der enzymatischen Aktivität festgestellt werden.
Die Ergebnisse der Versuche sind in den Tabellen 1 bis 3 wiedergegeben. Tabelle 1 Versuche zur Abreicherung von Lysozym aus Hühnereiweiß durch eine Apparatur mit Membranadsorbern (Direct Capture Device): Waschen und Elution ohne Ultraschall

Anmerkung: Nach 15 min sind 61% der gesamten vorhandenen Lysozym-Aktivität am Membranadsorber gebunden. Nach dem Waschen werden 52% der gesamt vorhandenen Aktivität vom Membranadsorber eluiert, das entspricht 88% der gebundenen Aktivität.

Anmerkung: Nach 15 min sind 66,7 der gesamten vorhandenen Lysozym-Aktivität am Adsorbens bzw. Membranadsorber gebunden. Nach dem Waschen werden 66,7 der gesamt vorhandenen Aktivität vom Adsorbens eluiert, das entspricht 97,9 der gebundenen Aktivität.

Es wurden je drei Messungen durchgeführt und der Mittelwert gebildet.
Bei der gelelektrophoretischen Auftrennung der Proben der Extraktion von Lysozym aus Hühnereiweiß durch Verwendung eines Direct Capture Device (REC S 43) wurden folgende Spuren von oben nach unten erhalten:

1–3 während des Waschens und der Elution wurde der Adsorber mit Ultraschall behandelt
4–6 während des Waschens und der Elution wurde der Adsorber nicht mit Ultraschall behandelt
7 kommerziell erhältliches Lysozym
8 die Eiweißprobe vor der Kreislaufpassage
9 die Eiweißprobe nach der Kreislaufpassage
10 Molekulargewichts-Marker mit folgenden Proteinen:

Ergebnisse:
Das elektrophoretische Bild (nicht dargestellt) zeigt, dass durch die Kreislaufpassage über den Adsorber schwächer in der Spur „Eiweiß nach der Kreislaufpassage" als in der Spur „Eiweiß vor der Kreislaufpassage", wohingegen die anderen Proteine, repräsentiert durch die entsprechenden Banden praktisch die gleiche Intensität und damit die gleiche Konzentration aufweisen. Weiterhin zeigt sich, dass durch das Waschen und die Elution ohne Ultraschallbehandlung weitere Proteine im Molekulargewichtsbereich zwischen 35 und 70 kD eluiert werden. Es handelt sich hierbei um Proteine des Hühnereiweiß, welche aufgrund ihrer niedrigen isoelektrischen Punkte nicht ionisch sondern allenfalls unspezifisch gebunden werden (Spuren 4–6). Durch die Behandlung mit Ultraschall wird diese unspezifische Bindung sehr stark bis völlig unterdrückt, was an den verringerten Mengen an Proteinen im Bereich von 35 bis 45 kD und dem völligen Fehlen der Banden im Bereich größer 66 kD zu sehen ist.

Claims

Vorrichtung zur Reinigung von Biomolekülen durch adsorptive Stofftrennung in einem ein flächiges Adsorbens (6) aufweisenden Chromatographiemodul (2), dessen Gehäuse (3) mindestens einen Zulauf (4) und mindestens einen Ablauf (5) für flüssiges Medium (9) aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass eine Ultraschalleinrichtung (7) vorgesehen ist, mit der das flächige Adsorbens (6) mit Ultraschall beaufschlagbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das flächige Adsorbens (6) aus dem Chromatographiemodul (2) in eine mit Flüssigkeit gefüllte Ultraschallwanne einer Ultraschalleinrichtung (7) einbringbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gehäuse (3) des Chromatographiemoduls (2) als Teil der Ultraschalleinrichtung (7) ausgebildet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das flächige Adsorbens (6) als ein Membranadsorber (10) ausgebildet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das flächige Adsorbens (6) als eine Matrix mit – ionischer Wechselwirkung und/oder – hydrophober Wechselwirkung und/oder – van der Waals'scher Wechselwirkung und/oder – Wasserstoffbrücken Wechselwirkung und/oder – einer Kombination aus ionischer und hydrophober Wechselwirkung und/oder – reversibler kovalenter Wechselwirkung und/oder – gruppenspezifischer Wechselwirkung und/oder – chelatbildender Wechselwirkung ausgebildet ist.