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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Biomolekülen in partikelhaltigen Medien durch adsorptive Stofftrennung in einem ein Adsorbens, das als ein tangential an- oder umströmter Membranadsorber ausgebildet ist, aufweisenden Chromatographiemodul, welches die folgenden Schritte umfasst:
- b) kontinuierliches Inkontaktbringen des Adsorbens mit flüssigem Medium, welches mindestens einen Adsorbenden enthält,
- c) Waschen des Adsorbens mit dem adsorbierten Adsorbenden,
- d) Elution des Adsorbenden mit einem Eluens und
- e) Auffangen des den Adsorbenden enthaltenden Eluats.
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Die adsorptive Stofftrennung wird im Rahmen der Chromatographie zur Reinigung von Biomolekülen eingesetzt.
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So ist beispielsweise aus der
DE 102 36 664 A1 eine Vorrichtung und ein Verfahren zur adsorptiven Stofftrennung in flüssigen Medien, bei welchem ein flächiges Adsorbens mit einem Adsorbenden beladen wird, in dem das dem Adsorbenden enthaltende Medium mit der gesamten adsorptiv wirksamen äußeren Oberflächen des Adsorbens in Kontakt gebracht wird, bekannt. Die aus dieser Druckschrift bekannte Vorrichtung weist ein Chromatographiemodul bzw. einen Adsorber auf, der ein Gehäuse mit mindestens einem Zulauf und mindestens einem Ablauf für flüssiges Medium umfasst und ein flächiges Adsorbens mit mindestens einer adsorptiv wirksamen Oberflächenseite, welches zur Bindung mindestens eines Adsorbenden ausgelegt und im Gehäuse ortsgebunden angeordnet ist, wobei das Medium die gesamte adsorptiv wirksame äußere Oberfläche des Adsorbens über- bzw. umströmt wird.
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Derartige Vorrichtungen und Verfahren, die sich grundsätzlich bewährt haben, weisen den Nachteil auf, dass es zu einer unspezifischen Wechselwirkung von unerwünschten Molekülspezies mit dem Adsorbens kommen kann. Dieses kann dann wiederum in den nachfolgenden Elutionsschritten zu einer Verringerung der Reinheit und der Ausbeute des oder der Zielmoleküle führen.
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Aus der
DE 196 18 022 A1 ist ein Verfahren zur Wiederherstellung der Aktivität eines durch feste Verunreinigungen in seiner Adsorption gestörten Adsorbens bekannt, bei dem das Adsorbens bzw. die Adsorptionsschicht durch einen Waschvorgang mit einem Netzmittel (Seifen und Detergenzien) von den Verunreinigungen, insbesondere partikelförmigen Verunreinigungen, befreit wird. Dabei soll die Waschwirkung durch Ultraschall unterstützt werden.
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Aus der
DE 199 38 254 B4 ist weiterhin ein Verfahren zum Regenerieren von Adsorbenzien bzw. von Adsorber-Polymeren, die in Wasser eingebracht und dort einem Ultraschallfeld ausgesetzt werden, wobei die mit Stoffen beladenen Adsorbenzien unter erhöhtem statischen Druck mit Wasser gespült und gleichzeitig einem Ultraschallfeld ausgesetzt werden, bekannt. In der
DE 199 38 254 B4 sollen Adsorbenzien, die in galvanischen Bädern zur Abwasserbehandlung eingesetzt werden, um insbesondere Schadstoffe aus Flüssigkeiten gezielt herauszuziehen, regeneriert werden. Verschmutzte galvanische Bäder, also anorganische metallhaltige Gewässer mit unter Umständen extremen pH-Werten, z. B. Kupfersulfatlösung bzw. Kaliumzyanoargentat, werden jedoch unter hohem Druck (25 bar) behandelt und würden sich nachteilig auf die Enzymaktivität von Proteinen auswirken.
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Weiterhin ist es aus der
US 2005/0054839 A1 bekannt, Ultraschall zu verwenden, um aus kristallisierbaren Substanzen unterhalb des Schmelzpunktes eine „überkalte” Phase herzustellen. Die Ultraschallbehandlung dient dabei der Kristallisation und Konzentrierung von flüssigem Material, hier Plasma, durch Ausfrieren des Wassers und nicht zur selektiven Entfernung von Kontaminanten.
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Weiterhin ist aus der
US 2005/0054839 A1 eine Ultraschallbeaufschlagung der Elution einer Gelpartikel enthaltenden Chromatografiesäule und deren Geschwindigkeitserhöhung bekannt. Dabei wird keinesfalls nahegelegt, dass durch die Ultraschallbehandlung eine erhöhte Reinheit erzielt wird. Im Wesentlichen wird in der Entgegenhaltung nur von Konzentrierung von Plasmabestandteilen gesprochen. Eine Abtrennung von Kontaminanten wird dabei nicht erwähnt.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, das bekannte Verfahren so zu verbessern, dass unspezifisch gebundene Proteine verringert bzw. entfernt werden. Diese Aufgabe wird in Verbindung mit dem Oberbegriff des Anspruches 7 dadurch gelöst, dass während des Schrittes c) das Adsorbens mit dem adsorbierten Adsorbenden zur Entfernung unspezifisch gebundener Proteine mit Ultraschall beaufschlagt wird.
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Überraschenderweise hat sich nämlich gezeigt, dass die Beaufschlagung des Adsorbens mit Ultraschall während des Waschvorganges es ermöglicht, unspezifisch gebundene Proteine praktisch vollständig zu entfernen, während der spezifisch gebundene Adsorbend erst im nachfolgenden Elutionsschritt gelöst wird.
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Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt vor Schritt b) in einem Schritt a) ein Äquilibrieren des Adsorbens mit einem flüssigen Medium.
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Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird während des Schrittes d) das Adsorbens mit dem adsorbierten Adsorbenden mit Ultraschall beaufschlagt. Dies führt zu einer weiteren Verbesserung.
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Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden während der Schritte c) und d) unspezifisch gebundene Proteine im Ultraschallbad entfernt.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise genutzt werden, um Lysozym als Adsorbens aus Hühnereiweiß zu gewinnen. Es ist aber auch möglich, Trypsin aus Pancreatin, einem Homogenat und anschließender Gefriertrocknung des Rinderpankreasinhalts zu gewinnen. Es ist auch die Gewinnung von, in das Nährmedium ausgeschiedenen, His getaggten Proteinen aus Hefe- oder Bakteriensuspensionen (Kulturüberständen), möglich.
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Besondere Anwendungsgebiete sind Medien, welche Fette in Form von Micellen oder Lipoprotein-Aggregaten enthalten, also Serum, Plasma und Zellkulturmedien Zusatz von z. B. fötalem Kälberserum.
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Partikelhaltige Medien können direkt, das heißt ohne vorbehandlung, behandelt werden.
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Als partikelhaltige Medien kommen dabei Suspensionen von tierischen und/oder pflanzlichen Zellen, Zellkulturüberstände solcher Zellen mit Zellresten und partikulären Zellinhaltsstoffen, Suspensionen von Mikroorganismen wie Bakterien- und Hefezellen und deren Autolysate, Protozoen, mehrzelligen, virenhaltigen Medien oder Gewebshomogenate, Aufschlämmungen von getrockneten und/oder gefrorenem biologischen Material, subzelluläre Fraktionen, Press-Säfte von tierischen und pflanzlichen Zellen und/oder Geweben wie Kartoffelfruchtwasser, Maisquellwasser und Sojamilch, Schlempen und Melassen, oder Homogenate biologischen Materials, Körperflüssigkeiten wie Blut, Plasma, Serum, Harn oder Liquor, Milch, Molke, Pflanzensäfte und Exsudate, Nukleinsäure(n) enthaltende Medien in Frage.
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Weitere Anwendungsgebiete sind auch Homogenate von Pflanzen, wie Blättern, Früchten oder Samen.
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Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden speziellen Beschreibung sowie den Figuren.
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In den Zeichnungen zeigen:
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1: eine Seitenansicht eines Chromatographiemoduls im Schnitt und
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2: eine Abbildung einer gelelektrophoretischen Auftrennung der Proben der Extraktion von Lysozym aus Hühnereiweiß durch Verwendung eines Direct Capture Device (REC S 43).
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Die Vorrichtung 1 zur Reinigung von Biomolekülen besteht im Wesentlichen aus einem Chromatographiemodul 2, dessen Gehäuse 3 mindestens einen Zulauf 4 und mindestens einen Ablauf 5 für flüssiges Medium 9 aufweist. Zur adsorptiven Stofftrennung ist in dem Gehäuse 3 ein Adsorbens 6 angeordnet. Weiterhin weist die Vorrichtung eine Ultraschalleinrichtung 7 auf, mit der das Adsorbens 6 mit Ultraschall beaufschlagbar ist.
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Entsprechend 1 ist das Gehäuse 3 des Chromatographiemoduls 2 als Teil der Ultraschalleinrichtung 7 ausgebildet. Im Bodenbereich des Chromatographiemoduls 2 sind zu diesem Zweck Ultraschallschwinger 8 angeordnet, die geeignet sind, das das Adsorbens 6 umgebende flüssige Medium 9 in Ultraschallschwingungen im Sinne eines Ultraschallbades zu versetzen. Das Adsorbens 6 kann beispielsweise als ein aufgewickelter Membranadsorber 10 ausgebildet sein.
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Beispiel:
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Es wurde ein stark sauerer Membranadsorber als Adsorbens mit Sulfonsäure Gruppen, S-Typ, Best. Nr. 18842 Charge 9900533 R27 B1 verwendet, die eingebaute Fläche war 7303 cm2. 20 handelübliche Frischeier eines lokalen Lebensmittelhändlers wurden aufgeschlagen und die Dotter vollständig vom Eiweiß getrennt. Es wurden 700 g Eiweiß mit einem pH von 9,09 und einer Leitfähigkeit von 8,4 mS/cm erhalten. Der Gehalt an Lysozym betrug 4,0 mg/ml. Die gesamte vorhandene Menge war 2,8 g.
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Die Bestimmung der Lysozym-Aktivität erfolgte nach der Methode von D. Shugar, in Biochim. Acta 8, 302 (1952). Hierbei wurde die Rate der Hydrolyse des Bakteriums Micrococcus luteus bestimmt. Eine Einheit entspricht hierbei der Abnahme der Absorption bei 450 nm von 0,001 bei pH 7,0 und 25°C.
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Die Menge an gebundenem und eluiertem Protein wurde durch Absorption der Proben bei 280 nm in einem UV-VIS Spectrophotometer der Fa. Perkin-Elmer bestimmt. Dabei wurde ein kommerziell erhältliches Lysozym-Präparat (FLUKA Buchs, Schweiz) zu einer Konzentration von 1 mg/ml in Puffer gelöst.
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Die Zusammensetzung der erhaltenen Proben wurde weiterhin mittels reduzierender SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese untersucht.
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Durchführung der Adsorption ohne Ultraschall:
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Der Adsorber bzw. das Adsorbens wurde mit 2 l eines Puffers mit 0,01 M Kaliumphosphat pH 8,0 im folgenden Puffer genannt, gespült, die Spüllösung verworfen. Dann wurde das Eiweiß ohne weitere Vorbehandlung mit Hilfe einer Schlauchpumpe und einer Flussrate von 2 l/min mit Rezirkulation, aus einer Vorlage, über das Adsorbens gepumpt. Es wurde alle 5 min eine Probe aus der Vorlage entnommen und die Lysozym-Aktivität wie oben beschrieben, bestimmt. Nach 15 min wurde der Membranadsorber entleert und entgegen der ursprünglichen Flussrichtung wieder eingebaut. Dann wurde der Membranadsorber mit 5 l Puffer ohne Rezirkulation gespült, nach jedem Liter eine Probe am Auslass des Adsorbers genommen und die Lysozym-Aktivität, wie oben beschrieben bestimmt. Es zeigte, sich, dass bereits nach 1,5 l Spülflüssigkeit keine Aktivität mehr auftrat. Danach wurde 0,5 l einer Lösung von 1 M NaCl in Puffer über den Membranadsorber rezirkuliert und das so entstandene Eluat aufgefangen. Dieser Schritt wurde vier Mal wiederholt. Die fünf Eluate wurden zusammengegeben und nach gründlichem Mischen die Lysozym-Aktivität bestimmt.
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Durchführung der Adsorption mit Ultraschall:
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Es wurde die gleiche Versuchsanordnung wie bei der Durchführung ohne Ultraschall verwendet. Der Membranadsorber bzw. das Adsorbens wurde dabei in ein mit Wasser gefülltes Ultraschallbad, Typ Sonorex Super 10 P, DK 512P, der Fa. Bandelin, Berlin Deutschland, gelegt, so dass der Membranadsorber bzw. das Adsorbens vollständig eingetaucht war. Während der Schritte Waschen, und Elution wurde das Ultraschallbad auf seine höchste Leistung geschaltet. Das Wasser im Bad erwärmte sich während der Behandlungsdauer um 5°C.
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Gleichzeitig wurden 3 ml einer Lösung von 1 mg/ml Lysozym in Puffer in einem geschlossenen Reagenzglas so in das Ultraschallbad eingelegt, dass es völlig von Wasser umgeben war. Nach Ablauf der Versuchszeit wurde eine Probe aus dem Reagenzglas entnommen und die Lysozym-Aktivität, wie oben beschrieben, bestimmt. Es konnte keine signifikante Abnahme der enzymatischen Aktivität festgestellt werden.
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Die Ergebnisse der Versuche sind in den Tabellen 1 bis 3 und
2 wiedergegeben. Tabelle 1 Versuche zur Abreicherung von Lysozym aus Hühnereiweiß durch eine Apparatur mit Membranadsorbern (Direct Capture Device): Waschen und Elution ohne Ultraschall
| Probe | mg/ml | Units total × 103 | Aktivität [%] |
| Ausgangslösung | 4,1 | 70258 | 100 |
| Nach 15 min | 1,0 | 27418 | 39 |
| Waschen | 0 | 1330 | 6,7 |
| Elution | 0,87 | 36534 | 52 |
Anmerkung: Nach 15 min sind 61% der gesamten vorhandenen Lysozym-Aktivität am Membranadsorber gebunden. Nach dem Waschen werden 52% der gesamt vorhandenen Aktivität vom Membranadsorber eluiert, das entspricht 88% der gebundenen Aktivität. Tabelle 2 Waschen und Elution mit Ultraschall
| Probe | mg/ml | Units total × 103 | Aktivität [%] |
| Ausgangslösung | 4,0 | 42643 | 100 |
| nach 15 min | 1,0 | 10887 | 25,6 |
| Waschen | 0 | 1330 | 3,1 |
| Elution | | 28453 | 66,7 |
Anmerkung: Nach 15 min sind 66,7% der gesamten vorhandenen Lysozym-Aktivität am Adsorbens bzw. Membranadsorber gebunden. Nach dem Waschen werden 66,7% der gesamt vorhandenen Aktivität vom Adsorbens eluiert, das entspricht 97,9% der gebundenen Aktivität. Tabelle 3 Enzymatische Aktivität von Lysozym vor und nach der Behandlung mit Ultraschall:
| Probe | Abnahme der Absorption bei 450 nm/min |
| Unbehandelt | 0,074 |
| Ultraschall-behandelt | 0,073 |
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Es wurden je drei Messungen durchgeführt und der Mittelwert gebildet.
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2 zeigt die gelelektrophoretische Auftrennung der Proben der Extraktion von Lysozym aus Hühnereiweiß durch Verwendung eines Direct Capture Device (REC S 43). Die Spuren von oben nach unten zeigen:
1–3 während des Waschens und der Elution wurde der Adsorber mit Ultraschall behandelt
4–6 während des Waschens und der Elution wurde der Adsorber nicht mit Ultraschall behandelt
7 kommerziell erhältliches Lysozym
8 die Eiweißprobe vor der Kreislaufpassage
9 die Eiweißprobe nach der Kreislaufpassage
10 Molekulargewichts-Marker mit folgenden Proteinen:
| Protein | Molekulargewicht (MG) [kD] |
| Beta-Galaktosidase | 116,0 |
| Rinderserumalbumin | 66,2 |
| Ovalbumin | 45,0 |
| Laktat-Dehydroganese | 25,0 |
| RE Bsp981 aus E.coli | 25,0 |
| Beta-Lactoglobulin | 18,4 |
| Lysozym aus Hühnereiweiß | 14,4 |
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Ergebnisse:
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Das elektrophoretische Bild (2) zeigt, dass durch die Kreislaufpassage über den Adsorber Lysozym abgereichert wurde, die Bande bei 14,4 Kilodalton (kD) ist deutlich schwächer in der Spur „Eiweiß nach der Kreislaufpassage” als in der Spur „Eiweiß vor der Kreislaufpassage”, wohingegen die anderen Proteine, repräsentiert durch die entsprechenden Banden praktisch die gleiche Intensität und damit die gleiche Konzentration aufweisen. Weiterhin zeigt sich, dass durch das Waschen und die Elution ohne Ultraschallbehandlung weitere Proteine im Molekulargewichtsbereich zwischen 35 und 70 kD eluiert werden. Es handelt sich hierbei um Proteine des Hühnereiweiß, welche aufgrund ihrer niedrigen isoelektrischen Punkte nicht ionisch sondern allenfalls unspezifisch gebunden werden (Spuren 4–6). Durch die Behandlung mit Ultraschall wird diese unspezifische Bindung sehr stark bis völlig unterdrückt, was an den verringerten Mengen an Proteinen im Bereich von 35 bis 45 kD und dem völligen Fehlen der Banden im Bereich größer 66 kD zu sehen ist.
