DE19930893A1 - Verwendung hochgeordneter Proteine, die mit inselförmig angeordneten Clustern eines katalytisch aktiven Metalls besetzt sind - Google Patents

Abstract

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, für die hochgeordneten Proteine, die mit inselförmig angeordneten Clustern eines katalytisch aktiven Metalls besetzt sind, eine neue Verwendungsmöglichkeit vorzuschlagen. DOLLAR A Die Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung der hochgeordneten clusterbesetzten Proteine als trägerfixierter Katalysator für chemische Reaktionen, bei denen die mit den Clustern belegten Proteine unverändert bleiben.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung hochgeordneter Proteine, die mit inselförmig angeordneten Clustern eines katalytisch ak­ tiven Metalls besetzt sind, gemäß dem ersten Patentanspruch.

Aus der WO 97/48837 sind metallische Nanostrukturen auf der Ba­ sis selbstassemblierter, geometrisch hochgeordneter Proteine und ein Verfahren zu deren Herstellung bekannt. Unter dem Begriff "metallische Nanostrukturen" werden in der Druckschrift insbe­ sondere mechanische Bauteile auf dem Gebiet der Mikrosystemtech­ nik, beispielsweise Sonden für die Elektronenmikroskopie oder metallische Röhren, verstanden. Der Grundbaustein dieser Bau­ teile sind selbstassemblierte, mehrdimensional geometrisch hoch­ geordnete Proteine wie z. B. bakterielle Zellhüllenproteine, Kollagen, Actin- und Tubulinfilamente und DNA-Stränge. Zur Her­ stellung der Bauteile werden die Proteine mit einer Metall­ schicht überzogen. Der Herstellungsprozeß verläuft in zwei Schritten: Zuerst werden auf den Proteinen clusterartige metal­ lische Inselstrukturen, beispielsweise Platin-Cluster, abgela­ gert. Die metallischen Inselstrukturen werden in einem zweiten Schritt als Keimbildungszentren benutzt, um das gesamte Protein durch Reduktion von gelösten Metallionen mit einem anderen Me­ tall zu beschichten.

Die Druckschrift enthält die Bemerkung, die im ersten Schritt erhaltenen regelmäßigen Anordnungen von Platin-Clustern auf den Proteinen seien "vor allem hinsichtlich der Anwendung der kata­ lytischen Aktivität der abgeschiedenen Cluster interessant".

Die Erfinder der zitierten WO 97/48837 sind Autoren einer Veröf­ fentlichung (R. Kirsch et al. "Three-dimensional metallization of microtubules", Thin Solid Films 305 (1997) 248-253), in der das Herstellungsverfahren der metallischen Nanostrukturen und deren Aufbau eingehend diskutiert werden. In dieser Veröffentli­ chung wird insbesondere detailliert erläutert, für welchen Pro­ zeß die katalytische Aktivität der abgeschiedenen Cluster ein­ setzbar ist. Danach ergibt sich, daß die katalytische Aktivität der abgeschiedenen Cluster ausgenutzt wird, um durch Reduktion der Metallionen eines gelösten Salzes die mit den katalytisch aktiven Platin- oder Palladium-Clustern besetzten Proteine mög­ lichst vollständig mit einem anderen Metall zu überziehen, d. h., die Proteine zu metallisieren. In Experimenten mit Protei­ nen, die nur mit sehr wenigen Metallclustern besetzt waren, wurde gefunden, daß die Metallisierung der Proteine ausschließ­ lich an den katalytisch aktiven Metallclustern einsetzt. Die in der eingangs zitierten WO 97/48837 enthaltene Bemerkung ist da­ her in der Weise zu verstehen, daß sich die katalytische Aktivi­ tät der Cluster auf die Reduktion von Metallionen und die damit verbundene Ablagerung des entstehenden Metalls auf den mit den Clustern belegten Proteinen bezieht. Bei der erwähnten katalyti­ schen Aktivität der Cluster handelt es sich somit nicht um eine Katalyse im eigentlichen Sinn, bei der der Katalysator bei der chemischen Reaktion unverändert bleibt. Vielmehr werden die Me­ tallcluster im Verlauf der Reduktion der Metallionen von dem entstehenden Nickelmetall überdeckt, wodurch ihre katalytische Aktivität zwangsläufig aufgehoben wird, denn sie sind dann für die zu reduzierenden Metallionen nicht mehr zugänglich.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, für die hochgeordneten Proteine, die mit inselförmig angeordneten Clustern eines kata­ lytisch aktiven Metalls besetzt sind, eine neue Verwendungsmög­ lichkeit vorzuschlagen.

Die Aufgabe wird durch die im ersten Patentanspruch beschriebene Verwendung gelöst. In den weiteren Ansprüchen werden bevorzugte Ausgestaltungen der erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verwendung angegeben.

Für die erfindungsgemäße Verwendung können im Prinzip alle in den oben zitierten Druckschriften genannten Proteine eingesetzt werden. Besonders bevorzugt werden Mikrotubuli. Mikrotubuli be­ stehen aus globulären Tubulin (alpha,beta-Dimeren, Molmasse 110 000) und werden durch einen Selbstassemblierungsprozeß gebildet. Benachbarte Heterodimere sind jeweils um ca. 10° gegeneinander aus der Horizontalen versetzt, so daß sie eine helikale Anord­ nung einnehmen. Tubulindimere bauen mit alternierender al­ pha,beta-Tubulinbindung Protofilamente mit einem Durchmesser von ca. 4 nm auf, die sich longitudinal aneinanderbinden (typischer­ weise 13 oder 14) und Mikrotubuli bilden. Die Mikrotubuli be­ sitzen einen Außendurchmesser von ca. 25 nm und können eine Länge zwischen 1 und 10 µm oder auch mehr erreichen. Die Mikro­ tubuli sind dynamische Strukturen, d. h., sie können sich den rasch ändernden Bedürfnissen in der Zelle durch Assemlierungs- oder Desassemblierungsprozesse anpassen.

Im Fall der Verwendung der clusterbesetzten Mikrotubuli als Ka­ talysatoren ist ein solcher ständiger Desassemblierungsprozeß jedoch nicht erwünscht. Die Mikrotubuli, aber auch andere Pro­ teine, werden daher vorzugsweise chemisch und damit strukturell fixiert. Für die chemische Fixierung eignet sich insbesondere Glutaraldehyd. Hierdurch werden die Proteinmoleküle intra- und intermolekular verknüpft, wodurch die Assemblierungs-/Desassemb­ lierungsdynamik aufgehoben und infolge dessen die chemische und mechanische Stabilität der Proteine verbessert wird. Durch die Fixierung kann beispielsweise bei der Ablagerung der Metallclu­ ster auf den Proteinen die Reaktionstemperatur bis auf 100°C er­ höht werden, ohne daß die Metall/Protein-Struktur angegriffen wird. Dies ist sowohl für die Darstellung der clusterbesetzten Proteine als auch bei der Verwendung zur Durchführung von kata­ lysierten Reaktionen von Vorteil.

Die Proteine müssen mit inselförmig angeordneten Clustern eines katalytisch aktiven Metalls besetzt sein. Die Art des Metalls richtet sich nach dem vorgesehenen Einsatzzweck, d. h., nach der chemischen Reaktion, die katalysiert werden soll. Metalle, die eine Vielzahl von chemischen Reaktionen katalysieren, sind bei­ spielsweise Platin, Palladium, Gold, Ruthenium oder Rhodium ent­ weder allein oder in Kombination miteinander. Metallcluster mit einem Durchmesser von 1 bis 6 nm sind für die erfindungsgemäße Verwendung gut geeignet. Vorzugsweise sind sämtliche mit den Clustern belegbare Stellen des Proteins mit den Clustern be­ setzt, so daß eine möglichst hohe Clusterdichte auf der Protein­ oberfläche erzielt wird.

Erfindungsgemäß werden die mit den Metallclustern besetzten Pro­ teine als Katalysator für chemische Reaktionen eingesetzt. Trä­ gerfixierte Katalysatoren haben prinzipiell den Vorzug, daß sie nach Beendigung der katalysierten Reaktion einfach zurückgewon­ nen werden können. Bei der erfindungsgemäßen Verwendung ist der Begriff "Katalysator" in der üblichen Weise zu verstehen, näm­ lich daß die clusterbesetzten Proteine im Verlauf der durch sie katalysierten Reaktion unverändert bleiben und nicht - wie beim eingangs zitierten Stand der Technik - selbst einer Veränderung unterworfen werden.

Die erfindungsgemäß zu verwendenden clusterbesetzten Proteine bieten wesentliche Vorteile: Da das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen mit abnehmender Teilchengröße zunimmt, werden prinzipi­ ell die Materialeigenschaften kleiner Partikel stärker von den Oberflächenatomen als von den klassischen Gitteratomen bestimmt. Die Zahl der aktiven Zentren an der Oberfläche, die für die Ak­ tivität einer heterogen katalysierten Reaktion entscheidend sind, nimmt deshalb in der Regel mit abnehmender Teilchengröße zu. Bei der erfindungsgemäßen Verwendung sind die Metallcluster während der Reaktion chemisch und sterisch als katalytisch ak­ tive Oberfläche frei verfügbar. Die Agglomeration der Metallclu­ ster wird durch ihre Fixierung auf der Proteinoberfläche verhin­ dert. Das Protein dient dabei als Abstandshalter. Chiralität bei Proteinen wird sowohl durch asymmetrische Kohlenstoff-Atome (Primärstruktur) als auch durch die helikale Faltung (Sekundär­ struktur) bedingt. Die clusterbesetzten Proteine können deshalb die Stereoselektivität von chemischen Reaktionen beeinflussen.

Es hat sich gezeigt, daß die clusterbesetzten Proteine insbeson­ dere für die Katalyse von chemischen Hydrierungen geeignet sind. Beispiele solcher chemischen Hydrierungen sind die Hydrierung von Kohlenstoff-Mehrfachbindungen und die Hydrierung von Nitro­ gruppen.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen und einer Figur näher erläutert.

Die Figur zeigt die nach Beispiel 3 erhaltenen Ergebnisse.

Beispiel 1 Assemblierung und Fixierung von Mikrotubuli

Die Assemblierung von Mikrotubuli aus einer Proteinlösung mit einer Endkonzentration von 1 mg/ml Tubulin erfolgte in einer Pufferlösung von 20 mM PIPES (1,4-Piperazindiethansulfonsäure, pK_a 6,8), 80 mM NaCl, 0,5 m MgCl₂, 1 mM EGTA (Ethylenglykol-bis- (2-Aminoethyl)-Tetraessigsäure) durch Zugabe von 10 mM GTP (Guanosintriphosphat) und 10 µM Taxol bei einer Temperatur von 37°C. Um die Assemblierung zu verfolgen, wurde bei 360 nm die Trübung der Assemblierungslösung mit einem Spektrometer aufge­ zeichnet, bis eine Sättigung beobachtet wurde (ca. 20 min). Die Mikrotubuli werden zunächst in 0,05%, dann nach 5 min in 3% Glutaraldehyd unter starkem Rühren fixiert. Nach 20 min wird die Reaktionslösung gegen 1000 ml Wasser/Puffer 10 : 1 über Nacht dia­ lysiert, um das restliche Glutaraldehyd aus dem Reaktionsgemisch zu entfernen.

Beispiel 2 Darstellung von Metallclustern auf Mikrotubuli

• a) Herstellung von Mikrotubuli-geträgerten Palladium-Clustern
  Ein Volumen von 100 µl der nach Beispiel 1 erhaltenen Lösung mit assemblierten und fixierten Mikrotubuli wird mit 200 µl einer Na₂PdCl₄-Lösung (0,0125 M in einem Puffer/Wasser-Gemisch von 1 : 4, pH 6,8) versetzt. Nach der Zugabe von 280 µl Wasser wird das Pd²⁺ mit 20 µl einer wäßrigen Lösung des Trinatrium­ salzes der Citronensäure (0,25 M in Wasser) bei 90°C während 1 h reduziert. Bei der Untersuchung der Probe mit dem Trans­ missionselektronenmikroskop ist deutlich die Anlagerung von vielen, ca. 2 nm großen Palladiumclustern am Mikrotubulus er­ kennbar. Um überschüssiges, nicht reduziertes Metallsalz aus dem Reaktionsgemisch zu entfernen, wird über Nacht dialy­ siert.
• b) Herstellung von Mikrotubuli-geträgerten Rhodium- oder Ruthe­ nium-Clustern
  200 µl einer RhCl₃-Lösung (0,0125 M in einem Puffer/Wasser-Ge­ misch von 1 : 4) oder einer RuCl₃-Lösung (0,0125 M in Wasser) werden in Gegenwart von 100 µl einer NaN₃-Lösung (9,8 mg in 2000 µl Wasser) bei 90°C während 15 min reduziert. Die Unter­ suchung der Probe mit Hilfe des Transmissionselektronenmi­ kroskops zeigt deutlich eine dichte Anlagerung kleinster Me­ tallpartikel an die Mikrotubuli.
• c) Herstellung von Mikrotubuli-geträgerten bimetallischen Gold- Palladium-Clustern
  Jeweils 3 ml verschiedener kolloidaler Gold-Suspensionen (Polyscience: Au-Partikeldurchmesser 5 nm, 10 nm, 20 nm und 60 nm) werden mit der Zentrifuge auf ca. 200 µl aufkonzen­ triert, mit 100 µl assemblierten und fixierten Mikrotubuli versetzt und innerhalb von 30 min bei Raumtemperatur auf den Mikrotubuli immobilisiert. Die Darstellung der ca. 2 nm großen Au-Kolloide geschieht in Gegenwart von 100 µl der Mi­ krotubuli-Lösung durch Reduktion von 100 µl einer HAuCl₄-Lö­ sung (1 g/ml in Wasser) mit 20 µl einer NaBH₄-Lösung (0,5 eq) bei 0°C. Die so hergestellten Au-Kolloide dienen als Nuklea­ tionskeime bei der Reduktion von 400 µl Na₂PdCl₄-Lösung (0,0125 M in einem Puffer/Wasser-Gemisch von 1 : 10, pH 6,8) mit 40 µl einer wäßrigen Lösung des Trinatriumsalzes der Citronensäure (0,25 M in Wasser) bei 70°C während 30 min. Um überschüssiges, nicht reduziertes Metallsalz aus dem Reakti­ onsgemisch zu entfernen, wird über Nacht dialysiert.

Beispiel 3 Hydrierung von Crotonsäure

780 µl der nach den Beispielen 2a und 2c hergestellten Lösungen werden mit 49,22 ml Wasser und 10 ml einer wäßrigen Crotonsäure­ lösung (0,723 M) versetzt und bei 25°C mit 1.013 bar Wasserstoff beaufschlagt. Gemessen wird die Abnahme an H₂ pro Zeiteinheit und Metallmasse. Die Gesamtmetallmasse wird durch ICP-Messungen (Inductively Coupled Plasma) bestimmt.

Die nach diesem Beispiel erhaltenen Ergebnisse sind in der Figur dargestellt. Die Figur enthält ein Diagramm, bei dem auf der Or­ dinate die katalytische Aktivität in [ml/mg.min] und auf der Ab­ szisse der Durchmesser der Metallcluster aufgetragen sind. Das Volumen ist auf Standardbedingungen (Nml) umgerechnet. Die dunk­ len Balken geben die Anfangshydrieraktivität bezogen auf die Ge­ samtmetallmasse an, die mittels ICP bestimmt wurde. Die hellen Balken beziehen sich auf die Anfangshydrieraktivität bezogen auf die Palladiummasse. Über den Balken sind die Pd/Au-Verhältnisse (Molverhältnis) angegeben. Beim Pd/Au-Verhältnis von 3,9 konnte nur die Partikelgröße des Au-Anteils (20 nm), nicht dagegen die Partikelgröße des Pd-Anteils (1 bis 2 nm) exakt bestimmt werden; deswegen wurde auf der Abszisse "20 + x" angegeben.

Aus dem Diagramm geht hervor, daß die katalytische Wirksamkeit mit der Zunahme der Cluster- bzw. Partikelgröße sinkt.

Claims (5)

1. Verwendung hochgeordneter Proteine, die mit inselförmig ange­ ordneten Clustern eines katalytisch aktiven Metalls besetzt sind, als trägerfixierter Katalysator für chemische Reaktio­ nen, bei denen die mit den Clustern belegten Proteine unver­ ändert bleiben.

2. Verwendung nach Anspruch 1, bei der fixierte hochgeordnete Proteine eingesetzt werden.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 für chemische Hydrierungen.

4. Verwendung nach Anspruch 3 für die Hydrierung von Kohlen­ stoff-Mehrfachbindungen.

5. Verwendung nach Anspruch 3 für die Hydrierung von Nitrogrup­ pen.