DE19816902A1

DE19816902A1 - SREBP-1 und SREBP-2 in phosphorylierter Form

Info

Publication number: DE19816902A1
Application number: DE1998116902
Authority: DE
Inventors: Wilhelm Krone; Dirk Mueller-Wieland
Original assignee: MUELLER WIELAND DIRK
Current assignee: MUELLER WIELAND DIRK
Priority date: 1998-04-16
Filing date: 1998-04-16
Publication date: 1999-10-28
Also published as: WO1999054352A3; AU4358099A; WO1999054352A2; EP1071713A2

Abstract

Die Erfindung betrifft phosphorylierte bzw. aktivierte SREBP-1 und SREBP-2 sowie ihre Verwendung als Arzneimittel.

Description

Die Erfindung betrifft phosphorylierte SREBP-1 und SREBP-2 sowie ihre Verwendung als Arzneimittel.

Cholesterin ist ein essentieller Bestandteil der Zellmembran und Ausgangsverbindung für die Synthese von Steroidhormonen und Gallensäuren. Es ist lebenswichtig, obwohl die Cholesterinablagerung in Arterien mit ihren Komplikationen (z. B. Herzinfarkt, Schlaganfall), die häufigste Todesursache beim Menschen ist.

Zahlreiche Studien haben gezeigt, daß Veränderungen des zellulären Cholesterinstoffwechsels bei der Entstehung der Arteriosklerose bzw. koronaren Herzerkrankung eine bedeutende Rolle spielen. Erst kürzlich konnten umfangreiche Studien an weit über 20.000 Patienten zeigen, daß die medikamentöse Senkung des Cholesterins im Blut durch (medikamentös verabreichte) Cholesterinsynthesehemmer die kardiovaskuläre Letalität sowie Gesamtsterblichkeit signifikant reduziert.

Die Zellen decken ihren Bedarf an Cholesterin bevorzugt durch die Aufnahme von LDL- Cholesterin aus dem Blutplasma. Da Cholesterin wasserunlöslich ist, muß es für den Transport im Blutplasma in eine wasserlösliche Transportform gebracht werden. Zu diesen Zweck stehen dem Organismus verschiedene Lipidproteinkomplexe (auch Lipoproteine genannt) zur Verfügung, die als VLDL (Very Low Density Lipoproteins), IDL (Intermediate Density Lipoproteins), LDL (Low Density Lipoproteins) und HDL (High Density Lipoproteins) bezeichnet werden.

Das LDL-Cholesterin wird von den Zellen vorwiegend über den LDL-Rezeptor, der auf der Oberfläche vieler Zellen sitzt, in das Zellinnere mittels Endocytose eingeschleust. Das im LDL gebundene Cholesterin wird in der Zelle zu freiem Cholesterin abgebaut. Das freie Cholesterin bewirkt daraufhin die Reduzierung der Cholesterinbiosynthese über die Hemmung der Aktivität Hydroxymethylglutaryl-CoA-Reduktase (HMG-CoA-Reduktase), dem Schlüsselenzym der Cholesterinbiosynthese. Gleichzeitig hemmt freies Cholesterin die Expression des HMG-CoA- Reduktasegens als auch die Expression des LDL-Rezeptorgens. Wird die Zelle mit genügend LDL versorgt, wird sowohl weniger Cholesterin synthetisiert als auch weniger LDL-Rezeptor exprimiert. Die Konzentration des LDL und somit des Cholesterins im Blutplasma wird also vor allem durch die Aktivität des LDL-Rezeptors und der HMG-CoA-Reduktase reguliert.

Im Promotorbereich des LDL-Rezeptorgens gibt es ein Sterol-reguliertes cis-Element (sre- 1; sterol regulatory element-1), welches zu potentiellen Bindungsstellen für den Transkriptionsfaktor SP1 benachbart ist. Zwei Transkriptionsfaktoren sind isoliert worden (SREBP-1 und -2), die an sre-1 binden; vgl. X. Wang et al. Cell 77: 53-62 (1994); J. Sakai et al. Cell 85: 1037-1046 (1996). "Sterol regulatory element binding proteins" (SREBP-1 und SREBP-2) sind Cholesterin-sensitive Transkriptionsfaktoren, die als Vorläufer-Protein von ca. 120 kDa im rauhen endoplasmatischen Retikulum lokalisiert sind und zur Familie der bHLH- Zip (basic Helix Loop Helix Leucine Zipper)-Proteine gehören. Durch Reduktion der intrazellulären Konzentration von Sterolen kommt es zur Aktivierung einer spezifischen Protease, die den ca. 68 kDa aminoterminalen transkriptionsaktiven Proteinteil abspaltet; vgl. G.P. Gasic Cell 77 : 17-19 (1994). Der N-Terminus von SREBP wandert dann auf bisher unbekannte Weise in den Zellkern. bHLH-Zip-Proteine entfalten ihre transkriptionsregulierende Wirkung, indem sie als Homo- oder Heterodimere an die DNA binden. Dimerisierungspartner sind bisher bei den SREBPs nicht identifiziert worden. Verschiedene Gene sind identifiziert worden, die durch SREBPs reguliert werden.

Unter allen Risikoparametern einer Arteriosklerose bzw. koronaren Herzerkrankung erwies sich LDL-Cholesterin mit dem höchsten prädiktiven Wert, obgleich sich zeigt, daß bei gegebenem LDL-Spiegel zwar eine erhebliche Variabilität des Risikos in Abhängigkeit von der sonstigen Risikofaktorenbelastung besteht. Ist die LDL-Cholesterin-Konzentration im Blutplasma erhöht, führt dies zu einer erhöhten Aufnahme von LDL-Cholesterin in die Zellen der Blutgefäße, wodurch sich Gefäßverengungen und instabile Plaques (Ablagerungen) bilden, die schließlich zu dem erhöhten koronaren Herzerkrankungsrisiko führen.

Neben der durch eine fettreiche Nahrung bedingten erhöhten LDL-Konzentration können weitere Ursachen für eine krankhaft bedingte erhöhte LDL-Konzentration (Hyperlipidämie, Hypercholesterinämie) im Blutplasma verantwortlich sein. Man unterscheidet bei der letzteren zwischen primärer und sekundärer Hyperlipidämie. Die sekundäre Hypercholesterinämie tritt bei Hypothyreose und Erkrankungen der Niere, Bauchspeicheldrüse oder Leber auf und wird nur in Ausnahmefällen mit Arzneimitteln behandelt, die den Stoffwechsel beeinflussen, da sie sich durch Therapie der Grundkrankheit bessern lassen. Den primären Hyperlipidämien liegen dagegen mono- und polygenetisch vererbte Defekte zugrunde. Die häufigste monogenetisch vererbte Hyperlipidämie ist die familiäre Hypercholesterinämie (FH), der eine Funktionsstörung des LDL-Rezeptors zugrunde liegt.

Die Hypercholesterinämien werden derzeit vorwiegend durch die Verabreichung von HMG- CoA-Reduktasehemmern, Ionenaustauscher oder u. a. auch Nikotinsäurederivaten behandelt. Die Therapie der ersten Wahl sind derzeit die HMG-CoA-Reduktase- bzw. Cholesterinsynthesehemmer. Ein Nachteil der Therapie mit HMG-CoA-Reduktasehemmern sowie auch Ionenaustauschern besteht darin, daß sie von der Expression des LDL-Rezeptors abhängig ist. Dementsprechend ist der Effekt bei Patienten mit Defekten in der Expression des LDL-Rezeptors bzw. seiner Strukturveränderung auch nicht vorhanden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Arzneimittel bereitzustellen, die den LDL-Rezeptor Cholesterin-unabhängig direkt stimulieren. Die Arzneimittel können zur Vorbeugung oder Behandlung von

- Arteriosklerose mit ihren Komplikationen, z. B. Schlaganfall, koronare Herzerkrankung, periphere arteriellen Verschlußkrankheit
- kardiovaskulären Risikofaktoren, z. B. Glukoseintoleranz oder Diabetes mellitus, arterielle Hypertonie, Adipositas, Fettstoffwechselstörungen
- genetischen Lebererkrankungen, die durch die Aktivierung von SREBP-empfindlichen Genen moduliert werden können, z. B. genetische Hypertriglyzeridämie mit ApoC2-Mangel
- Alzheimersche Erkrankung bzw. neurodegenrative Störungen

verwendet werden.

Diese Aufgaben werden erfindungsgemäß durch den Gegenstand der Patentansprüche 1 bis 10 gelöst.

Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft ein phosphoryliertes Polypeptid mit der Aminosäuresequenz wie aufgeführt in SEQ ID NO: 1 (SREBP-1) oder SEQ ID NO:2 (SREBP- 2) oder deren allelische Variante oder Derivat mit der biologischen Aktivität eines Transkriptionsfaktors. Bevorzugt ist ein Polypeptid, daß an den Aminosäurepositionen SER- 117 gemäß SEQ ID NO:1 oder SER-432 und/oder SER-455 gemäß SEQ ID NO:2 phosphoryliert ist. Das Polypeptid kann jedoch auch an jeder anderen Aminosäureposition phosphoryliert sein. Die phosphorylierten Aminosäuren können die im Wildtyp-Polypeptid vorhandenen Aminosäuren sein. Die Polypeptide können jedoch auch mittels üblichen Mutageneseverfahren substituiert oder deletiert sein oder es können zusätzliche Aminosäuren addiert sein. Ferner umfassen die erfindungsgeinäßen Polypeptide natürlicherweise vorkommende Splicevarianten wie das SREBP-1c (SEQ ID NO:3). Ferner bevorzugt sind erfindungsgemäße phosphorylierte Polypeptide aus nicht humanen Species z. B. aus Maus, Ratte, Schimpanse, Drosophila. Besonders bevorzugt sind die Polypeptide, die in vitro phosphoryliert werden. Insbesondere bevorzugt sind die Polypeptide, die durch die MAP- Kinasen ERK-1 oder ERK-2 in vitro phosphoryliert werden.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft das phosphorylierte Polypeptid als Arzneimittel. Bevorzugt ist die Verwendung des phosphorylierten Polypeptids zur Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung oder Behandlung von Arteriosklerose mit ihren Komplikationen, z. B. Schlaganfall, koronare Herzerkrankung, periphere arteriellen Verschlußkrankheit, kardiovaskulären Risikofaktoren, z. B. Glukoseintoleranz oder Diabetes mellitus, arterielle Hypertonie, Adipositas, Fettstoffwechselstörungen, genetischen Lebererkraningen, die durch die Aktivierung von SREBP-empfindlichen Genen moduliert werden können, z. B. genetische Hypertriglyzeridämie mit ApoC2-Mangel, Alzheimersche Erkrankung oder neurodegenrative Störungen. Bevorzugt ist ein Arzneimittel umfassend das phosphorylierte Polypeptid in Kombination mit einem oder mehreren Cholesterinsynthesehemmern. Durch die Kombinationstherapie wird der Effekt der Cholesterinsynthesehemmer verstärkt. Erfindungsgemäße phosphorylierte Polypeptide können z. B. in magensaftresistenter Tablettenform oder als Nasenspray, Zäpfchen, transdermales Pflaster oder mittels subkutaner oder intravenöser Injektionslösung appliziert werden.

Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Zeichnungen erläutert.

In Fig. 1A, B und C ist schematisch die Struktur von SREBP-1a (A), SREBP-1c (B) und SREBP-2 (C) gezeigt. Grauschraffiert ist die carboxyterminale Domäne, schwarz und schräg schraffiert der basic helix loop helix leucin zipper (bHLH-Zip). Unter den schematischen Strukturen sind die angefertigten GST-Fusionsproteine von SREBP-1a, SREBP-1c und SREBP-2 gezeigt.

Fig. 2 zeigt das Ergebnis einer Autoradiographie nach gelelektrophoretischer Auftrennung der in-vitro Phosphorylierung von SREBP-1a und SREBP-2 durch ERK-1 bzw. ERK-2

Fig. 3 A, B und C zeigt schematisch das Ergebnis der Identifizierung der MAPK- Phosphorylierungsstellen in SREBP-1a mittels Sequenzanalyse durch Edman-Abbau (A) und Massenspektroskopie (B). In Fig. 3 C ist schematisch die Lage der Phosphorylierung bei SER-117 gezeigt.

Fig. 4 A, B und C zeigt schematisch das Ergebnis der Identifizierung der MAPK- Phosphorylierungsstellen in SREBP-2 mittels Sequenzanalyse durch Edman-Abbau (A) und Massenspektroskopie (B). In Fig. 4 C ist schematisch die Lage der Phosphorylierung bei SER-432 und SER-455 gezeigt.

Fig. 5A und B zeigt schematisch den Einfluß proximaler Mitglieder der MAP-Kinasen- Kaskade auf die transkriptionelle Aktivität der SREBPs. HepG2 Zellen wurden mit dem Promotor-Konstrukt phLDL4 sowie dem Expressionsvektor pcSREBP-1a, pcSREBP-1c oder pcSREBP-2 mit und ohne dem Expressionsvektor pFC-MEKK (A) bzw. pFC-MEK1 (B) transient transfiziert. Die Promotoraktivität wird durch die Luziferaseaktivität, die im Zellextrakt gemessen wurde, repräsentiert. Die Luziferaseaktivität wurde mittels Cotransfektion auf die Transfektioneffizienz hin korrigiert. Gezeigt sind die Mittelwerte (±SD, n=4) vier verschiedener Bestimmungen, die jeweils in Dreifachbestimmungen durchgeführt wurden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die Beispiele sind nicht einschränkend aufzufassen.

Beispiele

Bei Methoden ohne Referenzangaben handelt es sich um Standardmethoden' die nach Sambrook (Sambrook et al., 1987) durchgeführt wurden.

Beispiel 1 Klonierung der SREBPs

Die Aminosäuren bzw. Nukleotidsequenz der SREBPs ist bekannt; vgl. X. Wang et al. Cell 77: 53-62 (1994); J. Sakai et al. Cell 85 : 1037-1046 (1996). Zur Klonierung der SREBPs in unserem Labor wurde RNA aus HeLa-Zellen isoliert. Die Nukleotidsequenz, die für den N- Terminus (Aminosäure 1 bis 460) von SREBP-1a kodiert, wurde nach reverser Transkription von 1 µg RNA mit den Primern SREBP-1a(NT1) sowie SREBP-1a(NT2) mittels PCR amplifiziert und dann in die BamHI/EcoRI-Schnittstelle des Klonierungsvektors pUC19 kloniert. Entsprechend wurde der N-Terminus (Aminosäure 1 bis 468) von SREBP-2 nach Amplifikation mit den Primern SREBP-2(NT1) sowie SREBP-2(NT2) kloniert. Das N- terminale Ende von SREBP-1c wurde durch Modifikation des SREBP-1a Klons erreicht. Der Vektor, der SREBP-1a enthält, wurde mit BamH und HgaI (Nukleotid 230) geschnitten. Dann wurde hierauf mit den Primern SREBP-1c(NT1) sowie SREBP-1a(NT2) eine PCR durchgeführt, um SREBP-1c zu erhalten. Die Nukleotidsequenzen wurden mittels DNA- Sequenzierung verifiziert.

Folgende Primer für die Klonierung der SREBPs herangezogen:
Oligonukleotide wurden nach der Festphasen-Phosphoamidit-Methode mit dem Pharmacia Gene Assembler und Chemikalien der gleichen Firma erstellt. Die Oligonukleotide wurden über Nacht mit NH₄OH_konz. vom Säulenmaterial entkoppelt, das Säulenmaterial durch Zentrifugation (15 000×g; 2 min; Raumtemperatur (RT)) entfernt und der Überstand im Vakuum (1 h) konzentriert. Die Oligonukleotide wurden mit 1/10 Vol. NaAc pH 4,0 und 3 Vol. EtOH_abs. 30 min bei -20°C gefällt, zentrifugiert (15 000xg; 15 min; 4°C;) und in 100 µl H2O_bidest. resuspendiert. Die Konzentration wurde photometrisch bestimmt (OD₂₆₀×Verdünnung×50× Bp^-1×MG^-1 = µmol/ml). Für die Erstellung der spezifischen cDNA-Fragmente wurden folgende Oligonukleotide konstruiert.

SREBP-1a(NT1) 5'-GTAGGATCCCCATGGACGAGCCACCCTTCAGC-3'
SREBP-1a(NT2) 5'-GGAATTCGTCAGGCTCGGAGTCACTGCC-3'
SREBP-2(NT1) 5'-GTAGGATCGCGATGGACGACAGCGGCGAGCTGGG-3'
SREBP-2(NT2) 5'-GGAATTCGTCTGGCTCATCTTTGACCTTTGC-3'
SREBP-1c(NT1) 5'-GTAGGATCCCCATGGATTGCACTTTCGAAGACATGCTTCAGCTTATC-3'

Erst-Strand-Synthese

1 µg Hela Gesamt-RNA wurde mit H₂O_bidest, 5 min bei 70°C hitzedenaturiert. Anschließend wurde dNTP-Mix (0,5 mM), pd(N)₆-Primer (0,2 µg), Mu-MLVRT (200 U) und 1× reverse Transkriptasepuffer (50 mM Tris/HCl; 40 mM KCl; 1 mM DTT; 6 mM MgCl₂; 0,1 mg/ml BSA; pH 8,3) zugegeben und die Synthese für 1 h bei 37°C durchgeführt.

PCR-Bedingungen

Zu 10 µl des Erst-Strang-Synthese Ansatzes wurde 1× PCR-Puffer (10 mM Tris/HCl; 50 mM KCl; 0,1 mg/mlBSApH 8,3), MgCl₂ (1,5 mM), dNTP-Mix (0,2 mM), 3' Primer (0,1 µM), 5' Primer (0,1 µM) und 1,25 U Taq-Polymerase addiert. Die PCR wurde in einem Probenvolumen von 100 µl durchgeführt; als Verdunstungsschutz wurde Mineralöl eingesetzt. Zur Herstellung der SREBP-cDNA wurde in 32 Zyklen (94°C 1 min; 60°C 2 min; 72°C 3 min) amplifiziert und ein Elongationsschritt (72°C, 7 min) angeschlossen.

Beispiel 2 Klonierung der GST-Fusionsproteine

Die in Beispiel 1 entsprechend angegebenen Konstrukte der SREBPs wurden in die BamHI/Eco-RI- Schnittstelle eines pGEX3X-Espressionsvektor (Pharmacia, Deutschland) unter Wahrung des offenen Leserasters kloniert. Nach Transformation dieser Expressionsvektoren in Bakterien (BL21) wurden diese entsprechend der Empfehlungen des Herstellers als GST-Fusionsproteine gereinigt (Pharmacia, Deutschland).

Beispiel 3 Phosphorylierung der GST-SREBP-Fusionsproteine

Jeweils 10 µg der aufgereinigten SREBP-1a(NT)-, -1c(NT)- oder -2(NT)-GST- Fusionsproteine wurden mit aktivierten MAP-Kinasen (100 ng/Probe Erk-2 bzw. 400 ng/Probe Erk-2) unter Verwendung der vom Hersteller (Upstate Biotechnology, USA) empfohlenen Bedingungen durchgeführt: 5 mM MOPS pH 7,2; 6,25 mM β-Giycerolphosphat; 1,25 mM EGTA; 0,25 mM Natriumorthovanadat; 0,25 mM DTT. Nach Zugabe von ATP und [γ-³²P] ATP (Endkonzentration: 250 µM bzw. 0,1 mCi/ml) folgte eine Inkubation von 10 Minuten bei 25°C. Zur Überprüfung der Phosphorylierung wurde die Reaktion durch Zugabe von 5× SDS- Probenpuffer abgestoppt, und anschließend wurden die Proben über ein 10%iges SDS- Polyacrylemidgel aufgetrennt. Das Gel wurde getrocknet und autoradiographiert. Nach Inkubation der transkriptional aktiven N-terminalen Domänen von SREBP-1a, SREBP-1c bzw. SREBP-2 mit den gereinigten MAP-Kinasen ERK-1 wie auch ERK-2 konnte eine deutliche Phosphorylierung der SREBPs detektiert werden (Fig. 2). Eine Phosphorylierung der C-terminalen Domänen konnte nicht beobachtet werden.

Beispiel 4 Sequenzierung der Phosphorylierungsstellen

Die phosphorylierten Proteine wurden durch ein SDS-PAGE aufgetrennt, die spezifischen Banden nach Autoradiographie ausgeschnitten und anschließend im Gel mit 50 µg Trypsin (Sequenzierungsgrad, Boehringer Mannheim, Deutschland) über Nacht bei 37°C verdaut. Daraufhin wurden die Peptide mit Ammoniumkarbonat (50 mM) eluiert und auf einer Anionaustausch-Chromatographie-Säule (Nucleogel SAX 1000-8/46 50 mm × 4,6 mm, Machery & Nagel) getrennt. Die Flußrate der HPLC betrug 0,5 ml/min. Nach Injektion der Probe (1 ml) wurden die Peptide eluiert. Zu Beginn wurde 100% Puffer A (20 mM NH₄CH₂COOH, pH 7,0) eingesetzt und 0% Puffer B (0,5 M KH₂PO₄, pH 4,9). Der Anteil von Puffer B wurde innerhalb von 40 Minuten auf 10% erhöht und von 10 auf 50% innerhalb der folgenden 75 Minuten. Es wurden Fraktionen von je 0,5 ml gesammelt. Die radioaktiven Fraktionen wurden dann in eine Reverse-Phase-HPLC weiter analysiert. Die entsprechenden Peptide wurden auf einer C18-Reverse-Phase-Säule (150 mm × 0,8 mm, 5 µm Partikelgröße, 300 A Porengröße, LC-Packings, The Netherlands) mit Hilfe des ABI 140 B-Systems separiert (Applied Biosystems, USA). Die HPLC-Flußrate wurde adjustiert auf 70 öl/min. Nach Auftragen von 100 µl Lösungsmittel wurde mit 95% der Lösung A (0,1% TFA) und 5% der Lösung B (Acetonitril/Wasser/TFH, [84/16/0,1; v/v/v]) eluiert. Der Anteil von Lösung B wurde auf 50% innerhalb von 90 Minuten erhöht und von 50 auf 100% innerhalb von 15 Minuten. Die gesammelten Fraktionen, die radioaktiv markierte Peptide enthielten, wurden massenspektrometrisch und durch Edman-Abbau ("Applied Biosystems model 476A pulse liqnid sequenator") untersucht. Die Massenspektrometrie wurde durchgeführt auf einem TSQ 7000 (Finnigan, USA), ausgestattet mit einem Nano-Elektronenspray-Ionenquelle. Das Massenspektrum wurde im positiven Ionenmodus erhalten in einer Massengröße von m/z 40- 2500 mit einer Scandauer von 2 sek. Die Spannung des Elektronensprays wurde auf ungefähr 1 kV gehalten. Kollisions-aktivierte Dissoziationsspektren wurden mit Argon als Kollisionsgas erhalten mit einem Druck von ungefähr 4×10^-3 mbar. Die Kollisionsenergie wurde auf 15 bis 46 eV gesetzt, abhängig von dem offensichtlichen Verhältnis zwischen Ionenmasse und Ladung. Zusätzlich zum selbständigen Vergleich der bekannten Sequenzen wurde das SEQUEST-Programm eingesetzt, um die identifizierten Phosphopeptide mit den entsprechenden Stellen zu verifizieren. Zur Suche in einer Datenbank wurde die OWL- Sequence-Data Base (University of Leeds) benutzt. Die Charakterisierung mittels HPLC- Anion-Austausch-Chromatographie, konsekutiver C 18 Reverse-Phase-Chromatographie tryptisch verdauter phosphorylierter SREBPs sowie ihre genaue Sequenzanalyse mittels Edmann-Abbau und Massenspektrometrie zeigte eine Phosphorylierungsstelle für SREBP-1a (Ser-117) und zwei Phosphorylierungsstellen für SREBP-2 (Ser-432, Ser-455) (Fig. 3 und 4).

Beispiel 5 Transiente Transfektion von HepG₂-Zellen

Die HepG₂-Zellen (Knowles et al., 1980, Science 209, 497-499) wurden entweder wie mit der bereits beschriebenen Methode oder durch Elektroporation transfiziert. Bei der Elektroporation wurden die Zellen als Monolayer in RPMI-1640 (Sigma, Deutschland) komplementiert mit 10% (v/v) FCS (Gibco, Deutschland) und Antibiotika (Sigma, Deutschland, A9909, 1%-Lösung) kultiviert. Vor Elektroporation wurden die Zellen trypsiniert und gewaschen und in Opti-MEM (Gibco, Deutschland) suspendiert. Die Zellsuspensionen (2×10⁵-Zellen pro well) wurden mit den entsprechenden nachstehenden Vektoren vermischt. Diese Proben wurden dann in einer Elektroporationscuvette (Interelektrode Distanz 0,4 cm) transferiert und für 18 msek. gepulst. Bevor diese gepulsten Zellsuspensionen auf Sechslochplatten ausgesät worden waren, wurden sie im o. a. Zellkulturmedium verdünnt. Für die Experimente mit den endogenen Induktionen, mit den Expressionsvektoren für z. B. die Kinasen (nachstehend aufgeführt), wurden die Zellen 16 Stunden nach Elektroporation isoliert. Für die Experimente mit den exogenen Stimuli, wie z. B. Hormone oder Wachstumsfaktoren, wurden die Zellen vor der Ernte zunächst für 16 Stunden auf serumfrei gezüchtet und dann für weitere 4 Std. inkubiert. Die Luziferaseaktivität wurde entsprechend des Herstellers (Promega, Deutschland) bestimmt. Die Transfektionseffizienz wurde durch gleichzeitige Kotransfektion mit dem β-Galaktosidase-Expressionsvektor pSVβGal kontrolliert. Die β-Galaktosidase-Aktivität wurde durch den Galaktolight-assay (Tropix) nach den Angaben des Herstellers bestimmt. Die Daten zeigen die relative Luziferaseaktivität als x-fache Induktion, bedingt durch entweder endogene oder exogene Stimulation im Vergleich zu unstimulierten Zellen.

Die Expressionsvektoren, die entweder eine konstitutiv aktive MEKK (Aminosäure 380 bis 672) oder MEK-1 (gesamtes Protein mit konstitutiv aktivierende Mutation: 5218/222 E A32 bis 51) unter Kontrolle eines CMV-Promotors enthalten, wurden von Stratagene bezogen. Die Expressionsvektoren (Stratagene), die regulative Domänen von Transkriptionsfaktoren, fusioniert zu heterologen DNA-Bindungsdomäne von Gal-4 (Aminosäure 1-147) unter Kontrolle eines MLV-Promotor enthalten, wurden zur Herstellung von Konstrukten mit den entsprechenden N-terminalen Domänen (s. o.) der SREBPs im offenen Leseraster (hierzu wurden die Vektoren mit BamH/EcoRI subklonierten Fragmenten mit BarnHI aufgeschnitten, aufgefüllt und "blunt-end in-frame" religiert) erstellt. Zur Bestimmung der Transaktivierung des Reporterplasmids wurde das Luziferasegen genommen, welches unter der Kontrolle von 5 Gal-4-bindenden Elementen steht (Stratagene, Deutschland).

Es zeigte sich, daß nach ektopischer Expression von MEKK bzw. MEKI nicht nur die LDLR- Promotoraktivität deutlich gesteigert werden konnte, sondern darüberhinaus die transktiptionelle Aktivität von SREBP-1a, SREBP-1c oder SREBP-2 signfikant erhöht wurde (Fig. 5). Dies zeigt die Bedeutung dieser posttranslationalen Modifikation durch die MAP- Kinasen. Diese Ergebnisse weisen erstmalig daraufhin, daß die transkriptionale Aktivität der SREBPs nicht nur durch den Cholesteringehalt der Zelle, sondern auch durch posttranskriptionale Modifikation reguliert wird.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Phosphoryliertes Polypeptid mit der Aminosäuresequenz wie aufgeführt in SEQ ID NO:1 (SREBP-1) oder SEQ ID NO:2 (SREBP-2) oder deren allelische Varaianten oder Derivate mit der biologischen Aktivität eines Transkriptionsfaktors.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, das an den Aminosäurepositionen SER-117 gemäß SEQ ID NO:1 oder SER-432 und SER-455 gemäß SEQ ID NO:2 phosphoryliert ist.

3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, wobei mindestens eine Aminosäuren substituiert, deletiert oder addiert ist.

4. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Polypeptid eine natürliche Splicevariante ist.

5. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Polypeptid aus Maus, Ratte, Schimpanse oder Drosophila stammt.

6. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Polypeptid in vitro phosphoryliert ist.

7. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polypeptid durch die MAP- Kinasen ERK-1 oder ERK-2 phosphoryliert ist.

8. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 als Arzneimittel.

9. Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung oder Behandlung von Arteriosklerose, Schlaganfall, koronarer Herzerkrankung, peripherer arterieller Verschlußkrankheit, Glukoseintoleranz, Diabetes mellitus, arterielle Hypertonie, Adipositas, Fettstoffwechselstörungen, genetische Hypertriglyzeridämie mit ApoC2-Mangel, Alzheimersche Erkrankung, neurodegenerative Störungen oder genetischer Lebererkrankung, die durch die Aktivierung von SREBP- emplindlichen Genen moduliert werden kann.

10. Verwendung des Polypeptids nach Anspruch 9 in Kombination mit einem oder mehreren Cholesterinsynthesehemmern.