DE19530832A1 - Besserung der Dupuytren-Krankheit - Google Patents

Description

Die Dupuytren-Krankheit (Dupuytren-Kontraktur) der Hand tritt hauptsächlich wenn auch nicht ausschließlich bei Männern auf. Sie wird häufiger bei Personen mittleren Al­ ters und älteren Personen und denjenigen mit bestimmten chronischen Erkrankungen, z. B. Dia­ betes, Alkoholismus und Rauchen, gefunden. Die Ursache ist nicht bekannt.

Die Krankheit ist durch eine Verdickung und Kontraktur der Faszie (Bindegewebe) der Handfläche gekennzeichnet, und verläuft in der Regel unter Beugungsmißbildungen und Beteiligung von einem oder mehreren Fingern. Dies ergibt sich aus der Bildung von longitudi­ nalen Strängen aus verhärtetem Fasergewebe in der Handfläche. Eine ähnliche Läsion tritt manchmal im Fuß auf. Bei der Dupuytren-Kontraktur ist das Verhältnis von Kollagen Typ III zu Typ I erhöht, und eine erhöhte Anzahl proliferierender Fibroblasten wird gefunden. Es wurde keine wirksame lindernde Behandlung gefunden; schwere Fälle werden chirurgisch be­ handelt (Faszienspaltung oder Faszienausschneidung).

Die Folgen der Dupuytren-Krankheit werden durch die Behandlung der betroffenen Faszie mit Kollagenase gebessert, indem sie auf die Oberflächen der Fibrosebereiche oder durch direkte Injektion der Kollagenase in die Fibrosebereiche, d. h. die Stränge oder in frühen Fällen die Vorstufenknötchen in der Faszie, angewendet wird, wobei man darauf achtet, daß die darunterliegende Beugesehne nicht verletzt wird. Das Dehnungsmodul der Stränge wird durch die Behandlung mit Kollagenase stark verringert, was somit die entkräftende Spannung auf die Finger etwas verringert.

Kollagenase ist ein Enzym, das die spezifische Fähigkeit zur Spaltung von Kollagen aufweist. Sie wird kommerziell aus der Fermentation von Clostridium histolyticum gewonnen und wird durch ein chromatographisches Verfahren gereinigt.

Die Untersuchung der Kollagenaseaktivität beruht auf der 20- bis 24stündigen Spaltung von nicht denaturiertem Kollagen (aus Rindersehne) bei einem pH-Wert von 7,2 und bei 37°C. Die Zahl der gespaltenen Peptidbindungen wird durch die Ninhydrinreaktion gemessen. Die durch Trypsinspaltung freigesetzten Aminogruppen einer Kontrolle werden subtrahiert. Eine ABC-Nettoeinheit Kollagenase bringt Ninhydrin-reaktives Material in Lösung, das 1,09 nmol Leucin pro Minute entspricht.

Sterilisiertes, lyophilisiertes Kollagenasepulver mit einem Mindestgehalt von 50 ABC-Einheiten pro mg ist erhältlich. Der Gehalt kann von Charge zu Charge beträchtlich hö­ her sein, wird aber bei der Bestimmung des Pulvergewichts zur Verwendung mit einem phar­ mazeutisch verträglichen Träger, z. B. physiologischer Kochsalzlösung, bei der Herstellung ei­ ner erwünschten Konzentration zur Behandlung berücksichtigt.

Das Behandlungs- und Dosierungsverfahren ist natürlich Sache der ärztlichen Beur­ teilung und hängt unter anderem vom Grad der Krankheit und der Art der Arbeitsunfähigkeit ab. Als Richtlinien kann man flüssige Träger mit etwa 100 ABC-Einheiten Kollagenase oder weniger bis etwa 10 000 ABC-Einheiten oder mehr pro ml verwenden. Ein geeigneter Bereich wurde bei etwa 300 bis etwa 700 ABC-Einheiten pro ml gefunden. Die Dosierung kann im Be­ reich von etwa 100 ABC-Einheiten oder weniger bis zu etwa 7500 ABC-Einheiten oder mehr pro betroffenem Strang oder äquivalenter Struktur liegen. Diese kann als Einzeldosis oder im allgemeinen wirksamer in aliquoten Teilen an zwei oder mehreren Stellen in die Läsion(en) verabreicht werden. Eine Einzelbehandlung kann ausreichen oder zwei oder mehrere auf die Zeit verteilte Behandlungen, z. B. monatlich, können, abhängig von den beobachteten Ergebnis­ sen, anwendet werden. Obwohl innerhalb weniger Tage oder Wochen günstige Ergebnisse be­ obachtet werden, muß betont werden, daß eine vollständige Linderung oft nicht erreichbar ist, und einige Rückfälle erwartet werden können.

Es ist Sache des Fachmanns, Träger für die Kollagenase auszuwählen, die pharma­ zeutisch verträglich sind, und auch Inaktivität gegenüber der Kollagenase zeigen. Beispiele sind physiologische Kochsalzlösung, wäßrige Dextranlösung, wäßrige Hetastärkelösung. In einigen Fällen kann der Arzt eine flüssige oder feste Trägerformulierung zur Injektion oder Implantati­ on mit langsamer Freisetzung vorziehen, wobei in diesem Fall die Dosierung der Kollagenase in der Regel etwas höher ist als die, die in einer einfachen wäßrigen Injektion verwendet wird. Man kann Fibrinleim, umfassend Fibrin oder Fibrinvorstufen, z. B. Fibrinogen plus Thrombin, als Träger verwenden; siehe U.S.-Patent 5279825. Wieder unterliegen die Wahl des Trägers und der Herstellungsverfahren der Formulierungen dem Fachmann.

Die Zeichnungen sind Mikrofotografien von 3,5 µm dicken Schnittpräparaten von Kontrakturen, Vergrößerung 10 × 10.

Fig. 1 ist ein Schnittpräparat einer Kontrolle.

Fig. 2 ist ein Schnittpräparat einer Probe, die nur mit Verdünnungsmittel behandelt wurde.

Fig. 3 ist ein Schnittpräparat einer Probe, die mit 225 ABC-Einheiten (U) Kollage­ nase/ml inkubiert wurde.

Fig. 4 ist ein Schnittpräparat einer Probe, die mit 450 U/ml inkubiert wurde.

Fig. 5 ist ein Schnittpräparat einer Probe, die mit 675 U/ml inkubiert wurde.

Experiment I

Aus Patienten, die sich einer routinemäßigen Faszienausschneidung gegen die Du­ puytren-Krankheit unterzogen, wurden zwanzig entfernte Stränge erhalten. Die Proben wurden innerhalb von 30 Minuten nach dem Eingriff eingefroren. Zehn Proben wurden statistisch als Kontrollgruppe bestimmt, und zehn wurden statistisch zur Behandlung bestimmt. Nachdem den letzteren Kollagenase injiziert wurde, wurden beide Gruppen 24 Stunden bei 37°C inku­ biert. Die Proben wurden unter Verwendung steriler Verfahren gehandhabt.

Lyophilisiertes Kollagenasepulver von Advance Biofactures Corp. of Lynbrook, NY 11563 wurde mit einem Verdünnungsmittel aus Wasser, 0,9% NaCl und 2 mM CaCl₂ rekon­ stituiert. Die Kollagenasekonzentration betrug 3600 ABC-Einheiten pro 0,5 ml. Diese Lösung wurde als Einzeldosis von 0,5 ml injiziert, so daß jeder behandelte Strang 3600 Einheiten Kollagenase erhielt.

Nach der Herstellung wurden die Proben unter Verwendung einer Chatillon UTSE- 2-Maschine mechanisch geprüft, die eine Dehnung, d. h. einen Längszug, durchführt, um Ände­ rungen des Dehnungsmoduls nach der Kollagenaseanwendung zu bestimmen. Der Forscher machte mit einem Stift zwei Markierungen auf die Stränge, um die aktuellen Längenänderun­ gen (d. h. die Dehnung) zu beurteilen, denen das Gewebe ausgesetzt wurde. Verankernde Klammern wurden nahe den Enden eines Stranges befestigt, und der Strang wurde anschlie­ ßend in Probenhalter, einer an jedem Ende, eingesetzt. Die Halter wurden an der Chatillon-2 UTSE-Maschine befestigt, die anschließend die Dehnung durchführte. Mit einem 12,5fach Mikroskop wurde der Abstand zwischen den Markierungen beobachtet, und die Beobachtun­ gen wurden einer computergestützten Videoanalyse unterzogen.

Das mittlere Dehnungsmodul für die mit Kollagenase behandelte Gruppe war um den Faktor 15 herabgesetzt: das mittlere Dehnungsmodul in der Kontrollgruppe betrug 33,0169 MPa (Standardabweichung ± 22,9386 MPa) verglichen mit 2,1653 MPa (Standardabweichung ± 3,2027 MPa) für die behandelte Gruppe (p < 0,002).

Die histologische Untersuchung der behandelten Gruppe bewies eine Spaltung des Kollagenbündels. Diese wurde in der Kontrollgruppe nicht gefunden.

Somit ist die Behandlung mit Kollagenase zur Spaltung und Verminderung des Deh­ nungsmoduls des pathologischen Stranges bei der Dupuytren-Krankheit mit nachfolgender Verminderung der entkräftenden Spannung auf die Finger sehr wirksam.

Experiment II

Die Patienten mit Dupuytren-Kontraktur kamen zu der handchirurgischen Abteilung des Krankenhauses zur Operation. Die Kontraktur wurde entfernt und, in feuchte Kompressen eingewickelt, in ein nicht markiertes Gefäß gegeben.

Das Gefäß wurde in das Labor gebracht, wo die Kontraktur von Fett etc. befreit wurde, so daß nur erkranktes Gewebe zurückblieb. Anschließend wurde die Kontraktur in vier etwa gleich große Stücke geschnitten. Drei der Stücke wurden in 1,5 ml Eppendorf-Zentrifu­ genröhrchen gegeben.

Kollagenase ist ein Enzym, das die Peptidbindungen in dem Protein Kollagen spaltet. Kollagen wird auch in der Haut gefunden, so daß das Tragen von Handschuhen wichtig ist.

Die erforderliche Zahl an Behältern mit Kollagenase (gefriergetrocknetes Nucleoly­ sin®, das durch ein chromatographisches Verfahren gereinigte Kollagenase ist und von Advan­ ce Biofactures Corp., Lynbrook, NY 11563 bereitgestellt wurde) wurde aus dem Gefrierappa­ rat entnommen, in dem sie aufbewahrt wurden, und in einem Verdünnungsmittel aus Wasser, NaCl (NaCl zur Injektion von Baxter, 9 mg/ml) und CaCl₂ (Pulver purum, wasserfrei von Merck), das 0,9% Natriumchlorid und 10% Calciumchlorid enthielt, rekonstituiert.

Jeder Behälter mit Nucleolysin® enthielt 810 ABC-Einheiten (U) Kollagenase. Zu jedem wurde das Volumen an Verdünnungsmittel gegeben, das zur Bereitstellung einer der nachstehenden Konzentrationen erforderlich war:

225 U/ml
450 U/ml
600 U/ml
675 U/ml
900 U/ml.

Der Inhalt aus jedem Behälter mit rekonstituiertem Nucleolysin® wurde zum Bedecken von zwei der Kontrakturstücke verwendet. Das dritte Stück wurde mit Verdünnungsmittel bedeckt.

Anschließend wurden die drei Gefäße zur 48stündigen Inkubation bei 37°C in einen Inkubator gegeben. Die übrigen Stücke wurden als Kontrolle verwendet und nicht inkubiert.

Nach der Inkubation wurden die Stücke zusammen mit dem unbehandelten Kon­ trollstück in Formaldehyd (Gepufferter neutraler 4%iger Formaldehyd von Apoteksbolaget) zur technischen Verwendung) gegeben, bevor sie wenigstens eine Zeitdauer von 24 Stunden fixiert wurden. Nach der Fixierung wurden die Stücke nach dem folgenden Schema dehydratisiert:

Dehydratisierungsschema

Von diesen in Paraffin eingebetteten Proben wurden unter Verwendung eines Rotationsmikro­ toms (Historange Mikrotom 2218 von LKB) Schnittpräparate hergestellt, wobei die Stücke zu Schnittpräparaten mit einer Dicke von 3,5 µm geschnitten wurden. Anschließend wurde das Schnittpräparat durch zwei Verfahren angefärbt, um eine beliebige mögliche Verminderung von Kollagen sichtbar zu machen. Van Gisons-Lösung, ein spezielles Färbemittel für Bindege­ webe, wurde als allgemeines Anfärbungsverfahren verwendet. Das Masson Dreifarbenfärbemit­ tel, ein spezifisches Verfahren für Kollagen, wurde als spezifischeres Verfahren zum direkten Nachweis von Kollagen verwendet.

Die Untersuchung der aus dem inkubierten Material hergestellten Schnittpräparate zeigte, daß die Kontrolle (Fig. 1) und Verdünnungsmittelkontrolle (Fig. 2) etwa gleich gro­ ße Mengen und gleich wenig gelöstes Kollagen aufwiesen. Das Kollagen lag in großen Inseln vor, die dick und verhärtet erschienen und stark gefärbt waren. Das Kollagen war nicht gespal­ ten.

Bei dem Schnittpräparat, das mit 225 U/ml Kollagenase behandelt wurde, erschien das Kollagen unversehrt in großen Stücken, während es gleichzeitig an bestimmten Stellen ge­ spalten schien (Fig. 3).

Die Untersuchung des Schnittpräparates, das nach der Inkubation in einer Kollage­ naselösung mit 450 U/ml hergestellt wurde, zeigte, daß das Kollagen deutlich dünner war und daß das Kollagen ein Netzwerk bildete (Fig. 4).

Bei dem nach der Behandlung mit 675 U/ml Kollagenase hergestellten Schnittpräparat konnte man deutlich erkennen, daß das Kollagennetzwerk sehr stark gespalten war und das Kollagen eben weich zu werden begann (Fig. 5).

Auf der Grundlage der Untersuchung der Schnittpräparate schienen bei diesen Ver­ suchsbedingungen 450 U/ml eine geeignete Konzentration zu sein, da sie das Kollagen etwas jedoch nicht so viel löste, daß ein Verletzungsrisiko für die Beugesehnen zu bestehen schien.

Literaturverzeichnis

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Claims (8)

1. Arzneimittelzubereitung zur Behandlung der Dupuytren-Krankheit, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge an Kollagenase.

2. Zubereitung gemäß Anspruch 1, wobei die Menge der Kollagenase innerhalb des Bereiches von etwa 100 bis etwa 7500 ABC-Einheiten pro Zubereitung liegt.

3. Zubereitung gemäß Anspruch 1 oder 2, umfassend einen pharmazeutisch verträgli­ chen Träger, der Kollagenase in einer Konzentration von etwa 100 bis etwa 10 000 ABC-Ein­ heiten Kollagenase pro ml enthält.

4. Zubereitung gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, wobei die Konzentration der Kollage­ nase innerhalb des Bereiches von etwa 300 bis etwa 700 ABC-Einheiten pro ml liegt.

5. Zubereitung gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, wobei der Träger wäßrig ist.

6. Zubereitung gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, die zur Anwendung auf dem Dupuy­ tren-Strang bestimmt ist.

7. Zubereitung gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, umfassend einen flüssigen, pharmazeu­ tisch verträglichen Träger, der Kollagenase enthält und zur Injektion in den Dupuytren-Strang bestimmt ist.

8. Verwendung von Kollagenase zur Behandlung der Dupuytren-Krankheit.