DE19518771C2 - Mittel enthaltend einen Komplex aus einem polymeren Mediator und einem Peptid, sowie eine Trägeroberflächen zur adsorptiven Bindung des Komplexes - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel, enthaltend einen Komplex aus einem polymeren Mediator und einem Peptid sowie eine Trägeroberfläche zur adsorptiven Bindung des Komplexes.

Beim Nachweis von Peptiden, insbesondere solchen mit einem geringen Moleku­ largewicht, gibt es das Problem, daß die Peptide nur ungenügend an eine Träg­ eroberfläche, auf der der quantitative und/oder qualitative Nachweis stattfinden soll, binden und bei möglichen Waschschritten entfernt werden. Dies geht zulasten der Nachweisgrenze bzw. macht es unmöglich, Peptide unterhalb einer bestimmten Größe zu bestimmen. Insbesondere die ELISA-Technik und die C-terminale Peptid- Sequenzanalyse leiden unter diesen Problemen.

Beim ELISA müssen die Peptide an eine Polystyrol-Trägeroberfläche binden und diese Fähigkeit weisen nicht alle Peptide gleichermaßen auf, so daß insbesondere kleine Peptide nicht die notwendigen Stellen aufweisen, um für einen Nachweis fest genug zu binden.

Der momentane Stand der Forschung auf dem Gebiet der C-terminalen Sequenzie­ rung von Proteinen ist dergestalt, daß Proteine im Bereich von 500 pmol bis 1 nmol standardmäßig 3 Zyklen weit C-terminal sequenziert werden können. Das einzige, momentan käufliche Gerät zur C-terminalen Sequenzierung von Hewlett- Packard ist für Proben mit einem Molekulargewicht über 5kD ausgelegt, d. h. es können erst Peptide ab einer Länge von ca. 50 Aminosäuren sequenziert werden. Dafür wird die Probe auf eine Teflon-Membran aufgebracht, an die sie adsorptiv gebunden wird und auf der im Gerät die Abbauzyklen stattfinden. Kleine Peptide werden im Laufe der Abbauzyklen von der Membran gewaschen und sind aus diesem Grund nicht sequenzierbar.

Es gibt allerdings auch schon Ansätze zur C-terminalen Sequenzierung kleinerer Peptide. Dabei werden diese kovalent an eine Carboxy-modifizierte Trägerober­ fläche gebunden (vgl. Shenoy, R. et al., Protein Science, 1, (1992), Seiten 58-67). Diese kovalente Bindungstechnik ist sehr aufwendig und dauert verhältnismäßig lange. Die Nachweisgrenze liegt bestenfalls im Bereich von 20 nmol.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu­ stellen, mit dem Peptide, insbesondere kleine Peptide, in einfacher und schneller Weise an Trägeroberflächen gebunden werden können. Ferner soll die Nachweis­ grenze für solche Peptide verbessert sein.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

Der Anmelder hat gefunden, daß Peptide besser an Trägeroberflächen, z. B. aus Polyethylen, Teflon oder Glas, haften, wenn die Peptide an einen polymeren Mediator gebunden sind. Soll nachfolgend eine C-terminale Peptidsequenzierung stattfinden, wird das Peptid N-terminal an den polymeren Mediator gebunden. Für die N-terminale Sequenzierung wird vorzugsweise ein Polymer mit vielen N-Termini (Aminogruppen) als Mediator eingesetzt, an den das Peptid C-terminal gekoppelt wird und dann einen freien N-Terminus aufweist. Geeignet als Mediator sind Polycarbonsäuren und deren Derivate, vorzugsweise Polyacrylsäure, sowie deren niedere Ester und Amide. Besonders geeignet ist der durch Umsetzung von Poly­ acrylsäure mit Methanol bzw. Ethanol gebildete Polyacrylsäurepolymethylester bzw. Polyacrylsäurepolyethylester. Dabei besteht die Möglichkeit, die Veresterung auf der Trägeroberfläche stattfinden zu lassen, nachdem die Polycarbonsäure an diese gebunden hat, oder schon vorher den Ester zu bilden und danach erst einen erfindungsgemäßen Komplex zu bilden, der später an die Trägeroberfläche gebun­ den wird. Die Veresterung der Polycarbonsäure hat den Vorteil, daß ein erfindungs­ gemäßer Komplex durch Erhöhung der Hydrophobizität besser auf der Trägerober­ fläche haftet. Ebenso wie die Veresterung führt die Amidierung, d. h. die Umsetzung der Polycarbonsäure mit Aminen, zu Verbindungen, die als Mediator eingesetzt werden können. Weitere Verbindungen, die sich als polymere Mediatoren eignen, sind Polyglutamat, Polyaspartat oder Polylysin, Polyvinylsulfat und Polyvinylalkoho­ le.

Die Bindung des polymeren Mediators, insbesondere der Polycarbonsäure, an das Peptid erfolgt vorzugsweise über ein Kopplungsagens, z. B. N-Ethyl-N′-(3′-dimethyl­ aminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid(EDC), Dicyclohexlylcarbodiimid (DCC) oder Hydroxybenzotriazol/2-(1-H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluro-nium-hexa­ fluorophosphat (HBTU/HOBT). In diesem Zusammenhang wird auch auf den Artikel von Bauminger, S. und Wilchek, M., "The Use of Carbodiimides in the Preparation of Immunizing Conjugates", Meth. Enzymol. 70, (1980), 151 sowie US-A-4728639 verwiesen. Weitere immmunisierende Konjugate wie in dem Artikel von Bauminger und Wilchek sind in EP-A-0 540 314 beschrieben. Dort wird ein Konjugat aus Polyacrylat und einem Trägerprotein, z. B. BSA, gebildet. Dieses Konjugat eignet sich zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen Polyacrylat.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Mittels kann ein übliches Peptid-Nachweisverfahren, z. B. ein ELISA, durchgeführt werden. Auch kann eine C-terminale Sequenzierung des Peptids durchgeführt werden. Hierfür können auf dem Markt erhältliche Sequenzier-Geräte, z. B. der C-terminale Sequenzer G 1009 der Fa. Hewlett-Packard verwendet werden. In diesem werden als Trägeroberflächen Teflonmembranen eingesetzt, an die der oben genannte Komplex adsorptiv gebunden wird.

Wird ein oben genannter Komplex einer C-terminalen Sequenzanalyse unter­ worfen, kann jedes Peptid sequenziert werden. Die Mengen des Peptids liegen vorzugsweise über 50 pmol, um genügend Zyklen sequenzieren zu können. Als Peptide können native, synthetische oder biologisch prozessierte Peptide ver­ wendet werden.

Ein erfindungsgemäßes Mittel ist auf einfachste Weise herstellbar, wobei kleinste Peptide an Trägeroberflächen gebunden werden, wodurch die Peptide in Nachweisverfahren, z. B. ELISA, eingesetzt oder Sequenzierungsver­ fahren unterworfen werden können. Der oben genannte Komplex eignet sich besonders für eine routinemäßige Anwendung. Sein Einsatz bei der C-terminalen Sequenzanalyse von Peptiden macht es erstmalig möglich, Peptide in einem Mengenbereich zu sequenzieren, der von dem des N-terminalen Edman-Abbaus nicht weit entfernt ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt ein Chromatogramm des synthetischen Peptids HDTWHLM,

Fig. 2 zeigt einen C-terminalen "Repetitive Yield" des Peptids HDTWHLM,

Fig. 3 zeigt ein C-terminales Histogramm des Peptids HDTWHLM,

Fig. 4 zeigt einen C-terminalen "Carryover" des Peptids HDTWHLM,

Fig. 5 zeigt ein Chromatogramm eines Peptidpools, und

Fig. 6 zeigt ein C-terminales Histogramm des Peptidpools.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1 Bildung eines erfindungsgemäßen Mittels bestehend aus einem Polyacrylsäure/Peptid-Komplex auf einer Trä­ geroberfläche

Eine Stammlösung von Polyacrylsäure (PAS) (Monomerkonzentration = 133 nmol/µl) wurde mit HCl auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt. 7,5 µl dieser Lösung (= 1 µmol Monomereinheit) wurden auf eine Teflonmembran (Zitex®-Membran des C-terminalen Sequenzers G 1009 der Firma Hewlett Packard) gebracht, die un­ mittelbar vorher mit 5 µl Isopropanol angefeuchtet wurde. Anschließend wurden 2 µl einer frisch hergestellten, wäßrigen EDC-Lösung (800 nmol/µl) in den Tropfen Polyacrylsäure gegeben und 5 Minuten inkubiert. Eine wäßrige Peptidlösung wurde bis auf 5-10 µl eingegrenzt und ebenfalls auf die Membran appliziert. Anschließend wurde die Membran an der Luft trocknen gelassen und in den Sequenzer gegeben.

Beispiel 2 Bildung eines erfindungsgemäßen Mittels bestehend aus einem Polyacrylsäurepolymethylester/Peptid-Komplex auf einer Trägeroberfläche

• (a) 2 µl einer Stammlösung von PAS (= 260 nmol Monomereinheit) wurden auf eine mit Isopropanol angefeuchtete Polystyrol-Oberfläche einer ELISA-Platte gegeben und mit frisch hergestellter EDC-Lösung (= 800 nmol) 5 Minuten inku­ biert. Zur Veresterung der Polyacrylsäure wurden direkt hintereinander 1 µl Acetat­ puffer (100 nmol/µl; pH = 5,0) und 5 µl Methanol appliziert und 5 Minuten inku­ biert. Dann erfolgt die Zugabe eines Peptids. Nach Lufttrocknung wurde ein üblicher ELISA durchgeführt.
• (b) Analog zu der Bearbeitung von (a) erfolgte die Bildung des oben genannten Komplexes auf der Teflon-Oberfläche des Sequencers G 1009 (vgl. vorste­ hend), um eine C-terminale Sequenzierung durchführen zu können.

Beispiel 3 C-terminale Sequenzierung verschiedener Peptide

• (a) Es wurde das Peptid HDTWHLM synthetisiert, durch HPLC gereinigt und seine Masse wurde überprüft. Eine wäßrige Lösung mit einer Konzentration von 3 nmol/µl wurde hergestellt und die Konzentration durch N-terminale Sequenzanalyse bestätigt.

Dieses Peptid wurde gemäß Beispiel 1 auf einer Trägeroberfläche adsorptiv gebun­ den und einer C-terminalen Sequenzanalyse unterworfen. Die Sequenzierung fand mit 3 nmol des Peptid s über 4 Abbauzyklen statt. Das Ergebnis der Sequenzierung ist in den Fig. 1-4 angegeben. Der "Initial Yield" liegt bei 135 pmol, der "Repetiti­ ve Yield" bei 40% und der "Carryover" beträgt für Methionin 18%, Leucin 51%, Histidin 115% und Tryptophan 110%.

Ein Peptid in einer Menge von 150 pmol konnte über 2 Zyklen erfolgreich sequen­ ziert werden.

• (b) Es wurde ein Peptidpool aus einem Zellüberstand verwendet und gemäß Beispiel 1 ein Komplex mit Polyacrylsäure gebildet. Die C-terminale Sequenzierung erfolgte über 9 Zyklen hinweg und alle Aminosäuren konnten detektiert werden. In Zyklus 1 ist für Arginin ein dominantes Signal zu sehen, das sich mit einem "Car­ ryover" von 100% in Zyklus 2 zieht, dann aber verschwindet. Die hydrophoben Aminosäuren A, Y, M, V, F, I und L weisen einen hohen "Carryover" von bis zu 100% auf. Das Ergebnis der Sequenzierung ist in den Fig. 5 und 6 angegeben.
• (c) Es wurde das Peptid HDTWHLM synthetisiert, durch HPLC gereinigt und seine Masse wurde überprüft. Eine wäßrige Lösung mit einer Konzentration von 3 nmol/µl wurde hergestellt und die Konzentration durch N-terminale Sequenzanalyse bestätigt.

Dieses Peptid wurde gemäß Beispiel 2 (b) auf einer Trägeroberfläche adsorptiv gebunden und einer C-terminalen Sequenzanalyse unterworfen. Die Sequenzierung fand mit 150 pmol des Peptids über 3 Abbauzyklen statt. Der "Initial Yield" beträgt für Methionin 4,3 pmol. Das Signal steigt in Zyklus 2 noch etwas an, ist aber in Zyklus 3 nicht mehr zu sehen. Klar zu erkennen ist in Zyklus 2 Leucin, das um 3 pmol von 4,4 auf 7,4 zunimmt, um in Zyklus 3 wieder auf 3,6 pmol zu sinken. Histidin wird erst in Zyklus 3 erkannt und stellt mit 3,7 pmol ein für diesen späten Zyklus vergleichsweise hohes Signal dar. Der "Repetitive Yield" beträgt über­ raschenderweise 93%.

Claims (7)

1. Mittel, enthaltend

• - einen Komplex aus
• - einem polymeren Mediator ausgewählt aus der Gruppe Polycarbonsäuren und deren Derivate,Polylysin, Polyglutamat, Polyaspartat, Polyvinylalkohole sowie Polyvinylsulfat und
• - mindestens einem Peptid
• - sowie eine Trägeroberfläche zur adsorptiven Bindung des Komplexes.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Komplex mehrere Peptide enthält.

3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Polycarbonsäure Polyacrylsäure bzw. das Polycarbonsäure-Derivat ein Ester oder Amid von Polyacrylsäure ist.

4. Mittel nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplung des Mediators an das Peptid über ein Kopplungsagens stattfindet.

5. Mittel nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Kopplungsagens N-Ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid (EDC) ist.

6. Verwendung des Mittels nach einem der Ansprüche 1-5, in ELISA-Reaktionen.

7. Verwendung des Mittels nach einem der Ansprüche 1-5 bei der C- oder N- terminalen Proteinsequenzierung.