JPH05260991A - ポリアクリレートポリマーに対するモノクローナル抗体 - Google Patents
ポリアクリレートポリマーに対するモノクローナル抗体Info
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- JPH05260991A JPH05260991A JP4284110A JP28411092A JPH05260991A JP H05260991 A JPH05260991 A JP H05260991A JP 4284110 A JP4284110 A JP 4284110A JP 28411092 A JP28411092 A JP 28411092A JP H05260991 A JPH05260991 A JP H05260991A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
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- Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 ポリアクリレートの検出のためのモノクロー
ナル抗体、それらの製造方法及び抗体アッセイに関す
る。 【構成】 a)ポリアクリレートにより哺乳類を免疫化
し； b)免疫化された哺乳類からの細胞からモノクローナル抗
体を生成するハイブリドーマ細胞を調製し； c)細胞系を生成するために前記ハイブリドーマ細胞をク
ローン化し；そして d)前記ハイブリドーマ細胞系から前記モノクローナル抗
体を抽出することを含んで成る、ポリアクリレートに対
する親和性を有するモノクローナル抗体を製造するため
の方法に関する。
ナル抗体、それらの製造方法及び抗体アッセイに関す
る。 【構成】 a)ポリアクリレートにより哺乳類を免疫化
し； b)免疫化された哺乳類からの細胞からモノクローナル抗
体を生成するハイブリドーマ細胞を調製し； c)細胞系を生成するために前記ハイブリドーマ細胞をク
ローン化し；そして d)前記ハイブリドーマ細胞系から前記モノクローナル抗
体を抽出することを含んで成る、ポリアクリレートに対
する親和性を有するモノクローナル抗体を製造するため
の方法に関する。
Description
【０００１】発明の分野 本発明は、一般的に、抗体アッセイ及びより特定には、
ポリアクリレートの検出のためのモノクローナル抗体及
び抗体アッセイに関する。
ポリアクリレートの検出のためのモノクローナル抗体及
び抗体アッセイに関する。
【０００２】従来技術の記載 水溶性アクリレートホモポリマー（この後、“ポリアク
リレート”として言及される）は、腐蝕及び鉱物沈積
（スケール）を防ぐために産業ボイラー水の処理に使用
される。一般的に、ポリアクリレートは、鉱物と共に錯
化することによってボイラー水から溶解された鉱物を除
去する。時間と共に、ポリアクリレートの錯化部位は飽
和されるようになり、そしてその分子は不活性になり、
ボイラー水からいずれの追加の鉱物も除去できない。
リレート”として言及される）は、腐蝕及び鉱物沈積
（スケール）を防ぐために産業ボイラー水の処理に使用
される。一般的に、ポリアクリレートは、鉱物と共に錯
化することによってボイラー水から溶解された鉱物を除
去する。時間と共に、ポリアクリレートの錯化部位は飽
和されるようになり、そしてその分子は不活性になり、
ボイラー水からいずれの追加の鉱物も除去できない。
【０００３】機械に対する腐蝕及びスケール損傷を防ぐ
ため、ポリアクリレートポリマーが不活性化されるにつ
れて、それらは除去され、そして活性ポリアクリレート
により交換されるべきである。従って、活性ポリアクリ
レートは、ボイラー水中に連続的に供給されるべきであ
る。ポリアクリレートの適切な供給レベルの維持は、ボ
イラー水システムの最適な性能のために不可欠である。
不適切な供給速度は、重大な問題を導くことができる。
たとえば、不十分なレベルは、溶解された鉱物により圧
倒される水処理をもたらし、それによって重い腐蝕又は
スケール沈積を引き起こす。他方、高過ぎるレベルの維
持はひじょうに費用がかかり、そして産業ボイラー水の
処理のためには非能率な方法である。
ため、ポリアクリレートポリマーが不活性化されるにつ
れて、それらは除去され、そして活性ポリアクリレート
により交換されるべきである。従って、活性ポリアクリ
レートは、ボイラー水中に連続的に供給されるべきであ
る。ポリアクリレートの適切な供給レベルの維持は、ボ
イラー水システムの最適な性能のために不可欠である。
不適切な供給速度は、重大な問題を導くことができる。
たとえば、不十分なレベルは、溶解された鉱物により圧
倒される水処理をもたらし、それによって重い腐蝕又は
スケール沈積を引き起こす。他方、高過ぎるレベルの維
持はひじょうに費用がかかり、そして産業ボイラー水の
処理のためには非能率な方法である。
【０００４】ボイラー水におけるポリアクリレートの濃
度を決定するためにいくつかの方法が利用できるが、こ
れらの方法は、特異性の欠乏又は良好でない感度を有す
る。たとえば、ポリアクリレートを検出するための古い
方法は、ＲＶＳＫによるコロイド滴定、hyamine 1622と
の錯化又は過剰マグネシウムとクロムアズロールＳとの
反応を包含する。上記試験は、いずれかのポリアニオン
性材料を検出し、そして約５０ppm のポリマーの検出限
界を有する。現在、産業ボイラー水システムにおけるポ
リアクリレートの量は、安価且つ急速に決定され得な
い。
度を決定するためにいくつかの方法が利用できるが、こ
れらの方法は、特異性の欠乏又は良好でない感度を有す
る。たとえば、ポリアクリレートを検出するための古い
方法は、ＲＶＳＫによるコロイド滴定、hyamine 1622と
の錯化又は過剰マグネシウムとクロムアズロールＳとの
反応を包含する。上記試験は、いずれかのポリアニオン
性材料を検出し、そして約５０ppm のポリマーの検出限
界を有する。現在、産業ボイラー水システムにおけるポ
リアクリレートの量は、安価且つ急速に決定され得な
い。
【０００５】発明の要約 本発明の１つの観点は、ポリアクリレートに対する親和
性を有するモノクローナル抗体に向けられる。本発明の
モノクローナル抗体は、いくつかの検出型で使用される
場合、ポリアクリレートに対する絶対的な特異性及び１
０-15g/ml 範囲での検出の低い限界を有する。
性を有するモノクローナル抗体に向けられる。本発明の
モノクローナル抗体は、いくつかの検出型で使用される
場合、ポリアクリレートに対する絶対的な特異性及び１
０-15g/ml 範囲での検出の低い限界を有する。
【０００６】本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリ
ドーマ細胞系により生成される。本発明の好ましいハイ
ブリドーマ細胞系は、ハイブリドーマ細胞系６Ｅ２−Ｈ
１−Ｇ４である。本発明のもう１つの好ましいハイブリ
ドーマ細胞系は、ハイブリドーマ細胞系４Ｆ１２−Ｃ１
２である。さらに追加の好ましいハイブリドーマ細胞系
は、４Ｂ１−Ｈ６−Ｅ１０である。
ドーマ細胞系により生成される。本発明の好ましいハイ
ブリドーマ細胞系は、ハイブリドーマ細胞系６Ｅ２−Ｈ
１−Ｇ４である。本発明のもう１つの好ましいハイブリ
ドーマ細胞系は、ハイブリドーマ細胞系４Ｆ１２−Ｃ１
２である。さらに追加の好ましいハイブリドーマ細胞系
は、４Ｂ１−Ｈ６−Ｅ１０である。
【０００７】本発明のもう１つの観点は、ポリアクリレ
ートに対する親和性を有するモノクローナル抗体の製造
方法に向けられる。本発明の方法は、次の段階： a）キ
ャリヤータンパク質に結合されるポリアクリレートによ
り哺乳類を免疫化し； b）免疫化された哺乳類から除去
された細胞からモノクローナル抗体を生成するハイブリ
ドーマ細胞を調製し； c) ハイブリドーマ細胞系を生成
するためにハイブリドーマ細胞をクローン化し; そして
d) 前記ハイブリドーマ細胞系からモノクローナル抗体
を抽出することを含んで成る。従って、本発明の１つの
好ましい態様によれば、哺乳類はマウスであり、そして
ハイブリドーマ細胞系はハイブリドーマ細胞系６Ｅ２−
Ｈ１−Ｇ４である。本発明のもう１つの好ましい態様に
よれば、哺乳類はマウスであり、そしてハイブリドーマ
細胞系はハイブリドーマ細胞系４Ｆ１２−Ｃ１２であ
る。
ートに対する親和性を有するモノクローナル抗体の製造
方法に向けられる。本発明の方法は、次の段階： a）キ
ャリヤータンパク質に結合されるポリアクリレートによ
り哺乳類を免疫化し； b）免疫化された哺乳類から除去
された細胞からモノクローナル抗体を生成するハイブリ
ドーマ細胞を調製し； c) ハイブリドーマ細胞系を生成
するためにハイブリドーマ細胞をクローン化し; そして
d) 前記ハイブリドーマ細胞系からモノクローナル抗体
を抽出することを含んで成る。従って、本発明の１つの
好ましい態様によれば、哺乳類はマウスであり、そして
ハイブリドーマ細胞系はハイブリドーマ細胞系６Ｅ２−
Ｈ１−Ｇ４である。本発明のもう１つの好ましい態様に
よれば、哺乳類はマウスであり、そしてハイブリドーマ
細胞系はハイブリドーマ細胞系４Ｆ１２−Ｃ１２であ
る。
【０００８】本発明のもう１つの観点は、流体における
ポリアクリレートの存在又は濃度の決定のための方法に
向けられる。本発明の方法は、ポリアクリレートのため
の親和性を有するモノクローナル抗体（該モノクローナ
ル抗体は固体キャリヤーに結合される）と共にポリアク
リレートを含む流体のサンプルをインキュベートする段
階を包含する。本発明の１つの好ましい態様によれば、
流体はボイラー水である。
ポリアクリレートの存在又は濃度の決定のための方法に
向けられる。本発明の方法は、ポリアクリレートのため
の親和性を有するモノクローナル抗体（該モノクローナ
ル抗体は固体キャリヤーに結合される）と共にポリアク
リレートを含む流体のサンプルをインキュベートする段
階を包含する。本発明の１つの好ましい態様によれば、
流体はボイラー水である。
【０００９】好ましい態様の記載 ポリアクリレートホモポリマーのための親和性を有する
モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞系が
発明され、そして本明細書に記載される。本発明のモノ
クローナル抗体は、種々の程度の特異性を伴ってポリア
クリレートに結合する。２種の異なったアッセイ型を用
いることによって、これらのモノクローナル抗体が０〜
数百ppm の範囲の濃度でポリアクリレートを認識するこ
とができることが結果的にわかっている。本明細書に記
載される例は、流体、たとえば産業ボイラーからの水サ
ンプルにおけるポリアクリレートの存在又は濃度を決定
するために、本発明のモノクローナル抗体を用いること
の実施可能性を示す。
モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞系が
発明され、そして本明細書に記載される。本発明のモノ
クローナル抗体は、種々の程度の特異性を伴ってポリア
クリレートに結合する。２種の異なったアッセイ型を用
いることによって、これらのモノクローナル抗体が０〜
数百ppm の範囲の濃度でポリアクリレートを認識するこ
とができることが結果的にわかっている。本明細書に記
載される例は、流体、たとえば産業ボイラーからの水サ
ンプルにおけるポリアクリレートの存在又は濃度を決定
するために、本発明のモノクローナル抗体を用いること
の実施可能性を示す。
【００１０】本発明の１つの観点によれば、ポリアクリ
レートに対する親和性を有するモノクローナル抗体は、
流体サンプルにおけるポリアクリレートの濃度を決定す
るために酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ）に使用される。本発明のモノクローナル抗体を用い
るＥＬＩＳＡ型は、流体サンプル中のポリアクリレート
の濃度を測定するために好ましい。３種の好ましいイム
ノアッセイ法は、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競争ＥＬＩ
ＳＡ及び間接的ＥＬＩＳＡである。本明細書に記載され
るいくつかの抗体は流体サンプルにおけるポリアクリレ
ートのアッセイにおいて有用であるが、２種の最も好ま
しいモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞系６Ｅ
２−Ｈ１−Ｇ４及び４Ｆ１２−Ｃ１２により生成される
抗体である。なぜならば、それらの２種のクローンは、
間接的ＥＬＩＳＡにおいて最高の抗−ポリアクリレート
特異性を示すからである。
レートに対する親和性を有するモノクローナル抗体は、
流体サンプルにおけるポリアクリレートの濃度を決定す
るために酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ）に使用される。本発明のモノクローナル抗体を用い
るＥＬＩＳＡ型は、流体サンプル中のポリアクリレート
の濃度を測定するために好ましい。３種の好ましいイム
ノアッセイ法は、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競争ＥＬＩ
ＳＡ及び間接的ＥＬＩＳＡである。本明細書に記載され
るいくつかの抗体は流体サンプルにおけるポリアクリレ
ートのアッセイにおいて有用であるが、２種の最も好ま
しいモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞系６Ｅ
２−Ｈ１−Ｇ４及び４Ｆ１２−Ｃ１２により生成される
抗体である。なぜならば、それらの２種のクローンは、
間接的ＥＬＩＳＡにおいて最高の抗−ポリアクリレート
特異性を示すからである。
【００１１】本発明の１つの好ましい態様によれば、サ
ンドイッチＥＬＩＳＡは、ポリアクリレートの濃度を測
定するために使用されるであろう。好ましくは、精製さ
れた抗−ポリアクリレート抗体は、捕獲抗体として使用
されるであろう。抗体は、９６−ウエルマイクロタイタ
ープレートのウエルに吸着されるであろう。ポリアクリ
レートを含む試験サンプルが添加され、そして捕獲抗体
への結合を可能にされる。次の段階において、酵素ラベ
ルされた抗−ポリアクリレート抗体が添加され、そして
被覆抗体により捕獲されるポリアクリレート分子上で暴
露された抗原性部位への結合を可能にされる。従って、
洗浄後に保持される酵素ラベルされた抗体の量は、サン
プル中のポリアクリレートの量に直接的に相互関係す
る。個々のウエルに結合される酵素ラベルのレベルは、
色原体性酵素基質とのインキュベーション及び得られる
色の変化の測定により定量化されるであろう。標準曲線
が、ポリアクリレートポリマーの既知濃度を用いて生成
されるであろう。このアプローチは、サンドイッチＥＬ
ＩＳＡに通常関連する、より高い感度の利点を有する。
ンドイッチＥＬＩＳＡは、ポリアクリレートの濃度を測
定するために使用されるであろう。好ましくは、精製さ
れた抗−ポリアクリレート抗体は、捕獲抗体として使用
されるであろう。抗体は、９６−ウエルマイクロタイタ
ープレートのウエルに吸着されるであろう。ポリアクリ
レートを含む試験サンプルが添加され、そして捕獲抗体
への結合を可能にされる。次の段階において、酵素ラベ
ルされた抗−ポリアクリレート抗体が添加され、そして
被覆抗体により捕獲されるポリアクリレート分子上で暴
露された抗原性部位への結合を可能にされる。従って、
洗浄後に保持される酵素ラベルされた抗体の量は、サン
プル中のポリアクリレートの量に直接的に相互関係す
る。個々のウエルに結合される酵素ラベルのレベルは、
色原体性酵素基質とのインキュベーション及び得られる
色の変化の測定により定量化されるであろう。標準曲線
が、ポリアクリレートポリマーの既知濃度を用いて生成
されるであろう。このアプローチは、サンドイッチＥＬ
ＩＳＡに通常関連する、より高い感度の利点を有する。
【００１２】もう１つの好ましい態様においては、競争
ＥＬＩＳＡは、流体サンプルのためのポリアクリレート
を測定するために使用されるであろう。この態様によれ
ば、精製された抗−ポリアクリレート抗体が９６−ウエ
ルマイクロタイタープレート上に吸着される。ポリアク
リレートを含む試験サンプルが、酵素ラベルされたポリ
アクリレートポリマーの既知量と共にプレートに添加さ
れる。洗浄の後に保持される酵素ラベルされたポリアク
リレートの量は、試験サンプルに元来存在するポリアク
リレートの量に反比例する。存在する酵素の量は、適切
な色原体性基質の添加により測定されるであろう。標準
曲線が、ポリアクリレートの既知量を用いて生成され
る。この特定の型は、たった１回のインキュベーション
期間を伴っての実質的に一段階アッセイである利点を有
する。
ＥＬＩＳＡは、流体サンプルのためのポリアクリレート
を測定するために使用されるであろう。この態様によれ
ば、精製された抗−ポリアクリレート抗体が９６−ウエ
ルマイクロタイタープレート上に吸着される。ポリアク
リレートを含む試験サンプルが、酵素ラベルされたポリ
アクリレートポリマーの既知量と共にプレートに添加さ
れる。洗浄の後に保持される酵素ラベルされたポリアク
リレートの量は、試験サンプルに元来存在するポリアク
リレートの量に反比例する。存在する酵素の量は、適切
な色原体性基質の添加により測定されるであろう。標準
曲線が、ポリアクリレートの既知量を用いて生成され
る。この特定の型は、たった１回のインキュベーション
期間を伴っての実質的に一段階アッセイである利点を有
する。
【００１３】本発明のさらにもう１つ態様によれば、間
接的ＥＬＩＳＡアッセイは、流体中のポリアクリレート
の濃度を測定するために利用される。その態様によれ
ば、既知量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ−ポリアクリ
レート）接合体が９６−ウエルマイクロタイタープレー
トの重複ウエルに吸着される。次に、種々の希釈度の抗
−ポリアクリレートモノクローナル抗体が固定されたポ
リアクリレートへの結合を可能にされる。酵素ラベルさ
れたヤギ抗−マウスＩg が次に添加され、そして一次抗
体への結合を可能にされる。次に、色原体性基質が添加
され、結合された酵素により着色された生成物に転換さ
れる。得られた色の変化は、４９２nmでの吸光度（光学
密度）を測定することによって定量化される。色の変化
の量は、保持される酵素ラベルされた抗体の量に比例
し、そして従って固定されたポリアクリレートに初期に
結合できる抗−ポリアクリレート抗体の量と直接的に相
互関係する。この実験の結果は、アッセイに使用するた
めの抗−ポリアクリレート抗体の最適濃度を生成する。
接的ＥＬＩＳＡアッセイは、流体中のポリアクリレート
の濃度を測定するために利用される。その態様によれ
ば、既知量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ−ポリアクリ
レート）接合体が９６−ウエルマイクロタイタープレー
トの重複ウエルに吸着される。次に、種々の希釈度の抗
−ポリアクリレートモノクローナル抗体が固定されたポ
リアクリレートへの結合を可能にされる。酵素ラベルさ
れたヤギ抗−マウスＩg が次に添加され、そして一次抗
体への結合を可能にされる。次に、色原体性基質が添加
され、結合された酵素により着色された生成物に転換さ
れる。得られた色の変化は、４９２nmでの吸光度（光学
密度）を測定することによって定量化される。色の変化
の量は、保持される酵素ラベルされた抗体の量に比例
し、そして従って固定されたポリアクリレートに初期に
結合できる抗−ポリアクリレート抗体の量と直接的に相
互関係する。この実験の結果は、アッセイに使用するた
めの抗−ポリアクリレート抗体の最適濃度を生成する。
【００１４】間接的ＥＬＩＳＡのための抗体の適切な濃
度を定義した後、モノクローナル抗体とポリアクリレー
ト被覆されたマイクロタイタープレートとの間の結合の
溶液に存在するポリアクリレートによる阻害が決定され
る。モノクローナル抗−ポリアクリレート一次抗体が、
ポリアクリレート被覆されたマイクロタイタープレート
に添加される前、種々の濃度のポリアクリレートと共に
インキュベートされる。次に、標準曲線が、遊離ポリア
クリレート濃度の関数として％阻害率をプロットするこ
とによって生成される。これは、固定されたポリアクリ
レート及び一次抗体の個々の固定量のために実施され
る。このアッセイ型は、この標準曲線が、冷却水サンプ
ルにおいて存在する濃度に関連する濃度で鋭い用量応答
を示す場合に適切であろう。それは、抗−ポリアクリレ
ートモノクローナル抗体の追加の精製又は変性も必要と
しない利点を有する。
度を定義した後、モノクローナル抗体とポリアクリレー
ト被覆されたマイクロタイタープレートとの間の結合の
溶液に存在するポリアクリレートによる阻害が決定され
る。モノクローナル抗−ポリアクリレート一次抗体が、
ポリアクリレート被覆されたマイクロタイタープレート
に添加される前、種々の濃度のポリアクリレートと共に
インキュベートされる。次に、標準曲線が、遊離ポリア
クリレート濃度の関数として％阻害率をプロットするこ
とによって生成される。これは、固定されたポリアクリ
レート及び一次抗体の個々の固定量のために実施され
る。このアッセイ型は、この標準曲線が、冷却水サンプ
ルにおいて存在する濃度に関連する濃度で鋭い用量応答
を示す場合に適切であろう。それは、抗−ポリアクリレ
ートモノクローナル抗体の追加の精製又は変性も必要と
しない利点を有する。
【００１５】上記いずれかのアッセイはさらに開発さ
れ、そして他の固体支持体システム、たとえば被覆され
た管及びポリマー膜を用いて改良される。しかしなが
ら、サンドイッチＥＬＩＳＡ又は競争ＥＬＩＳＡ型が、
それらが“デップスティック（dipsdtick)" アッセイと
して企画されるので好ましい。それにもかかわらず、上
記アッセイ型のいずれかが、流体サンプル中のポリアク
リレートの濃度を測定するために本発明のモノクローナ
ル抗体と共に使用される。次の例は、好ましい態様を記
載するものであり、そして本発明を限定するものではな
い。
れ、そして他の固体支持体システム、たとえば被覆され
た管及びポリマー膜を用いて改良される。しかしなが
ら、サンドイッチＥＬＩＳＡ又は競争ＥＬＩＳＡ型が、
それらが“デップスティック（dipsdtick)" アッセイと
して企画されるので好ましい。それにもかかわらず、上
記アッセイ型のいずれかが、流体サンプル中のポリアク
リレートの濃度を測定するために本発明のモノクローナ
ル抗体と共に使用される。次の例は、好ましい態様を記
載するものであり、そして本発明を限定するものではな
い。
【００１６】
【実施例】例１: 抗原合成 抗原を次の通りにして調製した：約３５ＫＤの分子量を
有するポリアクリレート（３５Ｋ）１０mgを、Nalco Ch
emical Companyから得た。ポリアクリレートをまず、 p
Ｈ 5．0 で、カップリング剤１−エチル３ (３' −ジメ
チルアミノ−プロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）によ
り誘導体化した。室温で１５分のインキュベーションの
後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１０mgを添加し、そ
して室温で４時間、 pＨ 7．0 で反応させた。低分子量
の副生成物を、４℃で一晩の透析により除去した。ＢＳ
Ａ接合体のゲル電気泳動は、ＢＳＡの分子当たりに接合
される約１〜４個のポリマー分子を伴っての好結果の接
合を示した。
有するポリアクリレート（３５Ｋ）１０mgを、Nalco Ch
emical Companyから得た。ポリアクリレートをまず、 p
Ｈ 5．0 で、カップリング剤１−エチル３ (３' −ジメ
チルアミノ−プロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）によ
り誘導体化した。室温で１５分のインキュベーションの
後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１０mgを添加し、そ
して室温で４時間、 pＨ 7．0 で反応させた。低分子量
の副生成物を、４℃で一晩の透析により除去した。ＢＳ
Ａ接合体のゲル電気泳動は、ＢＳＡの分子当たりに接合
される約１〜４個のポリマー分子を伴っての好結果の接
合を示した。
【００１７】例２: 間接的ＥＬＩＳＡスクリーニングへ
のポリアクリレート−ＢＳＡ 接合体の使用 ポリアクリレートのＢＳＡ接合体を、ウサギ抗−ＢＳＡ
抗血清を用いて間接的ＥＬＩＳＡを行うことによってマ
イクロタイタープレート上への吸着について試験した。
プレートを、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ)(pH７.2) 中、
０．０１mg/ml (0.5μg/ウエル）の濃度で接合体により
被覆した。プレート上の非占有部位を、ＰＢＳ中、非脂
肪ミルクの５％溶液によりブロックした。ウサギ抗−Ｂ
ＳＡ抗血清の希釈溶液を、プレートと共にインキュベー
トした。次に、ホースラディシュペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）によりラベルされたヤギ抗−ウサギ抗体を、一次
抗−ＢＳＡ抗体に結合せしめた。次に、結合された酵素
（ＨＲＰ）を、色原体基質により定量化した。これらの
アッセイを２度行った。そのアッセイの結果は、表１に
要約される。これらの結果は、ＢＳＡ−ポリアクリレー
ト接合体がＥＬＩＳＡプレートに強く結合し、従って間
接的ＥＬＩＳＡ型において抗−ポリアクリレート抗体の
スクリーニングのためへのそれらの接合体の利用性を確
保することを明確に示す。
のポリアクリレート−ＢＳＡ 接合体の使用 ポリアクリレートのＢＳＡ接合体を、ウサギ抗−ＢＳＡ
抗血清を用いて間接的ＥＬＩＳＡを行うことによってマ
イクロタイタープレート上への吸着について試験した。
プレートを、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ)(pH７.2) 中、
０．０１mg/ml (0.5μg/ウエル）の濃度で接合体により
被覆した。プレート上の非占有部位を、ＰＢＳ中、非脂
肪ミルクの５％溶液によりブロックした。ウサギ抗−Ｂ
ＳＡ抗血清の希釈溶液を、プレートと共にインキュベー
トした。次に、ホースラディシュペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）によりラベルされたヤギ抗−ウサギ抗体を、一次
抗−ＢＳＡ抗体に結合せしめた。次に、結合された酵素
（ＨＲＰ）を、色原体基質により定量化した。これらの
アッセイを２度行った。そのアッセイの結果は、表１に
要約される。これらの結果は、ＢＳＡ−ポリアクリレー
ト接合体がＥＬＩＳＡプレートに強く結合し、従って間
接的ＥＬＩＳＡ型において抗−ポリアクリレート抗体の
スクリーニングのためへのそれらの接合体の利用性を確
保することを明確に示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】例３: 有用なハイブリドーマの同定 ５種の細胞系により生成されるモノクローナル抗体を、
ポリアクリレート−ＢＳＡ接合体への結合について、間
接的ＥＬＩＳＡによりアッセイした。試験される５種の
細胞系は次の通りであった: ４８１−Ｈ６−Ｅ１０，４
Ｆ１２−Ｃ１２，６Ｅ２−Ｈ１−Ｇ４，４Ｄ４−Ｃ９−
Ｆ６及び６Ｄ１２−Ｈ９−Ｈ３。これらのアッセイを２
度行い、そしてその結果を図１に要約する。
ポリアクリレート−ＢＳＡ接合体への結合について、間
接的ＥＬＩＳＡによりアッセイした。試験される５種の
細胞系は次の通りであった: ４８１−Ｈ６−Ｅ１０，４
Ｆ１２−Ｃ１２，６Ｅ２−Ｈ１−Ｇ４，４Ｄ４−Ｃ９−
Ｆ６及び６Ｄ１２−Ｈ９−Ｈ３。これらのアッセイを２
度行い、そしてその結果を図１に要約する。
【００２０】例４: 抗体拡張 ハイブリドーマ細胞系６Ｅ２−Ｈ１−Ｇ４及び４Ｈ２−
Ｃ１２を、それらをインビトロで数継代、増殖し、そし
てそれらをプリスタン−感作されたBalb/cマウスのグル
ープに注射することによって拡張した。細胞は、腹水腫
瘍としてそれらのマウス中で増殖し、そしてそれらの腹
腔に蓄積する流体を収穫した。その腹水流体は、下記ア
ッセイにおいて精製され、そして使用される所望する抗
−ポリアクリレート抗体に富んだ。
Ｃ１２を、それらをインビトロで数継代、増殖し、そし
てそれらをプリスタン−感作されたBalb/cマウスのグル
ープに注射することによって拡張した。細胞は、腹水腫
瘍としてそれらのマウス中で増殖し、そしてそれらの腹
腔に蓄積する流体を収穫した。その腹水流体は、下記ア
ッセイにおいて精製され、そして使用される所望する抗
−ポリアクリレート抗体に富んだ。
【００２１】例５: 抗体精製 行われるアッセイ型に依存して、抗体は、非精製腹水と
して又は高く精製された免疫グロブリン調製物として必
要とされるであろう。抗体を、抗体イソタイプ及び種々
の緩衝液に対する抗体の感受性に依存して、種々の方法
により腹水流体から精製した。例３で同定されたクロー
ン６Ｅ２−Ｈ１−Ｇ４及び４Ｆ１２−Ｃ１２は、ＩｇＧ
イソタイプのものであり、そして従って、それらは擬−
アフィニティーマトリックスプロティンＡを用いること
によって精製された。
して又は高く精製された免疫グロブリン調製物として必
要とされるであろう。抗体を、抗体イソタイプ及び種々
の緩衝液に対する抗体の感受性に依存して、種々の方法
により腹水流体から精製した。例３で同定されたクロー
ン６Ｅ２−Ｈ１−Ｇ４及び４Ｆ１２−Ｃ１２は、ＩｇＧ
イソタイプのものであり、そして従って、それらは擬−
アフィニティーマトリックスプロティンＡを用いること
によって精製された。
【００２２】例６: 抗−ポリアクリレートモノクローナ
ル抗体の反応性プロフィール 異なった抗−ポリアクリレートモノクローナル抗体の結
合特異性を、間接的ＥＬＩＳＡにより試験した。重複ウ
エルを、ウエル当たり次の抗原パネル５００ngにより被
覆した: ＢＳＡ−ポリアクリレート，ポリアクリレート
又はＢＳＡ。１０の段階での１：１０〜１：１０6 の範
囲での腹水流体の一連の希釈溶液を、種々の抗原被覆さ
れたプレートと共にインキュベートした。腹水流体サン
プルとのインキュベーションの後、プレートを洗浄し、
そしてＨＲＰ−ラベルされたヤギ抗マウスＩg と共にイ
ンキュベートした。最後に、個々のウエルに保持される
酵素（ＨＲＰ）の量を、 H2O2 及び色原体基質を用いて
定量化した。４９２nmで読み取られる光学密度を、自動
ＥＬＩＳＡリーダーを用いて記録し、そしてその結果
を、図２及び３に要約する。
ル抗体の反応性プロフィール 異なった抗−ポリアクリレートモノクローナル抗体の結
合特異性を、間接的ＥＬＩＳＡにより試験した。重複ウ
エルを、ウエル当たり次の抗原パネル５００ngにより被
覆した: ＢＳＡ−ポリアクリレート，ポリアクリレート
又はＢＳＡ。１０の段階での１：１０〜１：１０6 の範
囲での腹水流体の一連の希釈溶液を、種々の抗原被覆さ
れたプレートと共にインキュベートした。腹水流体サン
プルとのインキュベーションの後、プレートを洗浄し、
そしてＨＲＰ−ラベルされたヤギ抗マウスＩg と共にイ
ンキュベートした。最後に、個々のウエルに保持される
酵素（ＨＲＰ）の量を、 H2O2 及び色原体基質を用いて
定量化した。４９２nmで読み取られる光学密度を、自動
ＥＬＩＳＡリーダーを用いて記録し、そしてその結果
を、図２及び３に要約する。
【００２３】図２及び３に示される結果から、細胞系６
Ｅ２−Ｈ１−Ｇ４及び４Ｆ１２−Ｃ１２からの２種の異
なったモノクローナル抗体は、ＢＳＡ又はポリアクリレ
ートのみに比較して、ＢＳＡ−ポリアクリレートに対す
る劇的に高い結合特異性を示す。これらの結果は、図１
に示される初期見解を確証し、ここでそれらの研究は、
それらの細胞系からの古い組織培養上静液により行われ
た。
Ｅ２−Ｈ１−Ｇ４及び４Ｆ１２−Ｃ１２からの２種の異
なったモノクローナル抗体は、ＢＳＡ又はポリアクリレ
ートのみに比較して、ＢＳＡ−ポリアクリレートに対す
る劇的に高い結合特異性を示す。これらの結果は、図１
に示される初期見解を確証し、ここでそれらの研究は、
それらの細胞系からの古い組織培養上静液により行われ
た。
【００２４】組成、操作、及び種々の細胞系の配置、モ
ノクローナル抗体、本明細書に記載される段階及び工程
は、請求の範囲内で変更が行われ得る。
ノクローナル抗体、本明細書に記載される段階及び工程
は、請求の範囲内で変更が行われ得る。
【図１】これは、ポリアクリレート（３５Ｋ）、ウシ血
清アルブミンに接合されるポリアクリレート（３５Ｋ−
ＢＳＡ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対するハ
イブリドーマ細胞系４Ｂ１−Ｈ６−Ｅ１０，４Ｆ１２−
Ｃ１２，６Ｅ２−Ｈ１−Ｇ４，４Ｄ４−Ｃ９−Ｆ６及び
６Ｄ１２−Ｈ９−Ｈ３からのモノクローナル抗体の結合
プロフィールを示すグラフである。
清アルブミンに接合されるポリアクリレート（３５Ｋ−
ＢＳＡ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対するハ
イブリドーマ細胞系４Ｂ１−Ｈ６−Ｅ１０，４Ｆ１２−
Ｃ１２，６Ｅ２−Ｈ１−Ｇ４，４Ｄ４−Ｃ９−Ｆ６及び
６Ｄ１２−Ｈ９−Ｈ３からのモノクローナル抗体の結合
プロフィールを示すグラフである。
【図２】これは、３５Ｋ−ＢＳＡ−○−、３５Ｋ−□−
及びＢＳＡ−■−に対するハイブリドーマ細胞系６Ｅ２
−Ｈ1 −Ｇ４からのモノクローナル抗体の結合プロフィ
ールを示す。
及びＢＳＡ−■−に対するハイブリドーマ細胞系６Ｅ２
−Ｈ1 −Ｇ４からのモノクローナル抗体の結合プロフィ
ールを示す。
【図３】これは、３５Ｋ−ＢＳＡ−○−、３５Ｋ−□−
及びＢＳＡ−■−に対するハイブリドーマ細胞系４Ｆ１
２−Ｃ１２からのモノクローナル抗体の結合プロフィー
ルを示す。
及びＢＳＡ−■−に対するハイブリドーマ細胞系４Ｆ１
２−Ｃ１２からのモノクローナル抗体の結合プロフィー
ルを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 5/20 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 リチャード イー．ブリュエール アメリカ合衆国，カリフォルニア 94606, オークランド，102，イースト トゥエン ティース ストリート，611 (72)発明者 クリシュナ バラクリシュナン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94805, リッチモンド モンテレー アベニュ 6087
Claims (8)
- 【請求項１】 ポリアクリレートポリマーに対する親和
性を有するモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 前記モノクローナル抗体がハイブリドー
マ細胞系により生成される請求項１記載のモノクローナ
ル抗体。 - 【請求項３】 前記ハイブリドーマがハイブリドーマ細
胞系６Ｅ２−Ｈ１−Ｇ４である請求項２記載のモノクロ
ーナル抗体。 - 【請求項４】 前記ハイブリドーマがハイブリドーマ細
胞系４Ｆ１２−Ｃ１２である請求項２記載のモノクロー
ナル抗体。 - 【請求項５】 ポリアクリレートに対する親和性を有す
るモノクローナル抗体を製造するための方法であって、
下記段階： a）ポリアクリレートにより哺乳類を免疫化し； b）免疫化された哺乳類からの細胞からモノクローナル
抗体を生成するハイブリドーマ細胞を調製し； c) 細胞系を生成するために前記ハイブリドーマ細胞を
クローン化し；そして d) 前記ハイブリドーマ細胞系から前記モノクローナル
抗体を抽出することを含んで成る方法。 - 【請求項６】 前記哺乳類がマウスであり、そして前記
ハイブリドーマ細胞系がハイブリドーマ細胞系６Ｅ２−
Ｈ１−Ｇ４である請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 前記哺乳類がマウスであり、そして前記
ハイブリドーマ細胞系がハイブリドーマ細胞系４Ｆ１２
−Ｃ１２である請求項５記載の方法。 - 【請求項８】 流体におけるポリアクリレートの存在又
は濃度の決定方法であって、ポリアクリレートのための
親和性を有するモノクローナル抗体（該モノクローナル
抗体は固体キャリヤーに結合される）と共にポリアクリ
レートを含む流体のサンプルをインキュベートする段階
を含んで成る方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US78615491A | 1991-10-31 | 1991-10-31 | |
| US786154 | 1991-10-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05260991A true JPH05260991A (ja) | 1993-10-12 |
Family
ID=25137743
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4284110A Pending JPH05260991A (ja) | 1991-10-31 | 1992-10-22 | ポリアクリレートポリマーに対するモノクローナル抗体 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0540314B1 (ja) |
| JP (1) | JPH05260991A (ja) |
| CA (1) | CA2081879C (ja) |
| DE (1) | DE69212112T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0678762A (ja) * | 1992-02-29 | 1994-03-22 | Fmc Corp Uk Ltd | 決定方法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19518771C2 (de) * | 1995-05-22 | 1997-12-04 | Deutsches Krebsforsch | Mittel enthaltend einen Komplex aus einem polymeren Mediator und einem Peptid, sowie eine Trägeroberflächen zur adsorptiven Bindung des Komplexes |
| ZA97248B (en) | 1996-01-18 | 1997-07-18 | Rohm & Haas | Method for identifying and quantifying polymers utilizing immunoassay techniques |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2075695C (en) * | 1991-08-30 | 2003-05-20 | Robert L. Wetegrove | Monoclonal antibodies to sulfonated polymers |
-
1992
- 1992-10-22 JP JP4284110A patent/JPH05260991A/ja active Pending
- 1992-10-28 EP EP92309880A patent/EP0540314B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-28 DE DE1992612112 patent/DE69212112T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-10-30 CA CA 2081879 patent/CA2081879C/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0678762A (ja) * | 1992-02-29 | 1994-03-22 | Fmc Corp Uk Ltd | 決定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69212112T2 (de) | 1996-12-05 |
| DE69212112D1 (de) | 1996-08-14 |
| CA2081879C (en) | 2003-06-10 |
| EP0540314A1 (en) | 1993-05-05 |
| EP0540314B1 (en) | 1996-07-10 |
| CA2081879A1 (en) | 1993-05-01 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040113 |