DE1941511A1 - Neue hypocalcaemische Peptide und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

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CIBA AKTIENGESELLSCHAFT, BASEL (SCHWEIZ) Case 6548/1-6 '.. . :

Deutschland

Neue hypocalcämische Peptide und Verfahren zu ihrer

Herstellung

Gegenstand der Erfindung sind das neue hypocalcämisch wirksame Peptid der Formel I

H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln

Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala~Ile-Gly-VaI-GIy-Ala-Pro-ÖH

und entsprechende Verbindungen., in welchen einer oder

mehrere der Asparagin- und Glütaminreste durch den Asparaginsäure- hzvi. Glutaminsäurerest und/oder der Asparaginsäurerest

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durch den Asparaginrest ersetzt sind, ihre Dimeren., insbesondere diejenigen in denen 2 gleiche Peptidsequenzen {1-32 und l^!-32') in antiparalleler Anordnung via die Gysteinreste 1,7'■ und 7*1* mittels Disulfidbindung verbunden sind, und Derivate der monomeren oder dimeren Peptide sowie Säureadditionssalze und Komplexe der genannten mono- und dimeren Peptide und ihrer Derivate und Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen.

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.Derivate sind z.B. Amide, insbesondere C-terminale Amide, die am Stickstoff unsubstituiert sind.

Weitere Derivate der genannten Verbindungen sind solche, in denen mindestens die a-Aminogruppe acyliert ist, sowie entsprechende Desamino -peptide.

Acylgruppen für die Acylierung der Aminogruppen, insbesondere für die Acylierung der N -Aminogruppe, sind die Reste von Carbonsäuren wie aliphatischen, aromatischen, araliphatischen, heterocyclischen und heterocyclylaliphatischen Carbonsäuren, insbesondere von niederen ein- oder zweiwertigen Alkan- oder Alkensäuren wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäuren, Acrylsäure, Bernsteinsäure, von alicyclischen Carbonsäuren wie CyclO-alkylcarbonsäuren, von ein- oder zweiwertigen monocyclischen aromatischen Carbonsäuren wie unsubstituierter und substituierter Benzoesäure oder Phthalsäure, von unsubstituierten und Aryl-substituierten Aryl-niederalkyl- oder -alkenylcärbonsäuren wie Phenylessigsäure, von unsubstituierten oder substituierten ein- oder zweiwertigen 5-bis 6-gliedrigen heterocyclischen Säuren mit Stickstoff, Schwefel und/oder

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Sauerstoff als Heteroatomen, wie Pyridincarbonsäuren, Thlophencarbonsäuren, oder von Heterocyclyl-niederalkansäuren wie Pyridylessigsäure, Imiaazolylessigsäure,.worin die Substituenten der Ringe z.B. Halogenatomen Nitrogruppen, Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppen oder Niedercarbalkoxygruppen sind., Weiter sind als Acylreste vor allem Acylreste von Aminosäuren, besonders α-Aminosäuren, wie z.B. P der Pyroglutamylrest zu nennen, ferner Acylreste, die sich von Kohlensäure oder Thiokohlensäure bzw. ihren Estern oder Amiden ableiten, z.B. Niederalkyloxycarbonylgruppen .. wie Aethoxycarbonyl, tert.-Butyloxycarbonyl, ferner unsubstituiertes und wie oben angegeben substituiertes Benzyloxycarbonyl, Carbamoyl und Thiocarbamoyl sowie N-substituiertes Carbamoyl und Thiocarbamoyl, z.B. N-Niederalkylcarbamoyl, N-Phenylcarbamoyl, N-Phenyl-thiocarbamoyl.

Als Saureadditionssalze sind besonders Salze von therapeutisch anwendbaren Säuren wie Salzsäure, Essigsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und Sulfonsäuren, wie Nlederalkansulfonsäuren, Benzol- oder Toluolsulfonsäure zu nennen. .

Unter.Komplexen sind die in ihrer Struktur noch nicht abgeklärten Verbindungen zu verstehen, die beim Zusatz gewisser anorganischer oder organischer Stoffe zu langkettigen Peptiden entstehen und diesen eine verlängerte

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Wirkung verleihen. Solche Stoffe sind beispielsweise beschrieben für Insulin und für ACTH und andere adrenocorticotrop wirksame Peptide. Zu nennen sind z.B. anorganische Verbindungen, die sich von Metallen wie Calcium, Magnesium, Aluminium, Cobalt und insbesondere von Zink ableiten, vor allem schwerlösliche Salze wie Phosphate, Pyrophosphate und Polyphosphate sowie Hydroxyde dieser Metalle, gegebenenfalls in Kombination mit sauren organischen Stoffen, z.B. saure Gruppen enthaltenden Polysacchariden wie Carboxymethylcellulose, oder Gerbsäure, Polyglutaminsäure oder teilweise hydrolysierte Gelatine, ferner Alkalimetallpolyphophate wie z.B. "Calgon N", "Calgon 322", "Calgon 188" oder "Polyron B 12". Organische Stoffe, die eine Verlängerung der Wikung hervorrufen, sind beispielsweise nicht antigene Gelatine, z.B. Polyoxygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose, ferner Sulfonsäure- oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextran, Polyphenolen und Polyalkoholen, vor allem Polyphoretinphophat und Phytinsäure, sowie Polymerisate und Copolymerisate von Aminosäuren, z.B. Protamin oder Polyglutaminsäure.

Die neuen Verbindungen weisen eine hypoealcämische Wirkung auf. So zeigt das C-terminale Amid der Verbindung der Formel I an der Ratte eine Aktivität von ca. 100 - 200 MRC-Einheiten pro mg (Peptid) in dem vom Kumar et al., J. Endocrinology 2i* [1965], 470, beschriebenen Test. Die neuen Verbindungen senken den Plasrna-Calcium- und -Phosphatgehalt des Blutes von Säugetieren, wie durch Versuche an

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50 - 15ο g schweren Ratten nachgewiesen wurde. Bei Patienten mit erhöhtem Knochenmetabolismus senken sie den Calcium-,spiegel des Blutes bei intravenöser, intramuskulärer oder . subcutaner Gabe von 0,01 bis 5 mg, z.B. in 0,1-m. Acetatpuffer vom pH 4,6. Sie können daher zur Behandlung von Hypercalcämien und von Knochenkrankheiten wie Paget's disease oder Osteoporose verwendet werden.

Die Verbindung der Formel I mit freier C-terminaler Carboxylgruppe ist selbst nur sehr wenig aktiv, kann aber als Zwiseheηr oder Ausgangsprodukt zur Herstellung aktiver Verbindungen verwendet werden. So kann man sie z.B. in das ent-

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sprechende. Asp , Pro^ -Diamid, welches gleich wirksam wie CaIeltonin-"M ist, umwandeln, z.B. indem man das Produkt der Formel I mittels tert.Butyloxycarbonylazid in das N , N^c di-BOC-geschützte Produkt überführt, dann mit Ammoniak in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid und Hydroxysuccinimid das Diamid bildet und schliesslich die BOC-Gruppen mit Säure,. z.B. Salzsäure oder Trifluoressigsäure, abspaltet.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der neuen mono- oder dimeren Peptide, ihrer Derivate, ihrer Säureadditionssalze und Komplexe ist dadurch gekennzeichnet, dass man . ' _v

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ι. aus Verbindungen der Formel I oder den genannten Analogen oder Derivaten oder Dimeren dieser Verbindungen, in welchen Verbindungen mindestens eine Aminogruppe oder eine Carboxylgruppe durch eine abspaltbare Schutzgruppe geschützt ist, die Schutzgruppe(n) abspaltet oder

2. Verbindungen der Formel II

H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-OH II

oder die genannten Analogen oder Derivate, worin die Mercaptogruppen frei oder durch die Tritylgruppe geschützt sind, zu Disulfiden oxydiert oder

3· Verbindungen der Formel III oder IV

s—:—=

CH

R-CH-CO-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-OH R-CH-CO-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-A III IV

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worin A 1 bis 21 der auf Cystein folgenden Aminosäurereste mit gegebenenfalls geschützter Seitenkettenaminogruppe und R Wasserstoff oder eine acylierte Aminogruppe darstellt, mit der restlichen C-terminalen Sequenz des Peptids mit ^f gegebenenfalls geschützter Seitenkettenaminogruppe bis zur C-terminalen Aminosäure!L-Prolin) nach in"der Peptidsynthese bekannten Methoden kondensiert mit der Massgabe, dass eine von einer aktivierten Carbonsäuregruppe ausgehende' Methode wie die Azidmethode, die Änhydridmethode oder die . Methode der aktivierten Ester angewendet wird, wenn die C-terminale Sequenz eine freie Carboxylgruppe aufweist und-, wenn erwünscht, die erhaltenen monomeren Verbindungen in ihre Dimeren oder die freien mono- oder dimeren Peptide in ihre Derivate und/oder Säureadditionssalze, oder Komplexe, überführt. -..'.-■

Bei der Herstellung der Ausgangsstoffe für die 1. Variante des erfindungsgemässen Verfahrens wie auch aller in den. 3 Verfahrensvarianten benötigten Zwischenprodukte kommen als Schutzgruppen besonders dip von der Synthese langkettiger Peptide her bekannten sowie einige neue Schutzgruppen in Betracht, die leicht abgespalten werden können, z.B. durch Hydrolyse, Reduktion, Amlnolyse- oder Hydrazinolyse.

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So verwendet man z.B. als Schutzgruppen für Aminogruppen Acyl- oder Aralkylgruppen wie Formyl-, Trifluoracetyl-,, Phthaloyl-, Benzol sulfonyl-, p-Toluolsulfonyl-, ο-Nitrophenylsulfenyl-, 2,4-Dinitrophenylsulfenylgruppen (diese SuIfenylgruppen können auch durch Einwirkung nucleophiler Reagenzien, z.B. Sulfite, Thiosulfate, vgl. englisches Patent 1 104 271 abgespalten werden), gegebenenfalls substituierte, wie z.B. durch Niederalkoxygruppen, besonders o- oder p-Methoxygruppen substituierte Benzyl-, oder Diphenyl- oder Triphenylmethylgruppen oder von der Kohlensäure sich ableitende Gruppen , wie gegebenenfalls in den' aromatischen Ringen, z.B. durch Hälogenatome wie Chlor oder Brom, Nitrogruppen, Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppen oder farbgebende Gruppen, z.B. Azogruppen substituierte Arylmethyloxycarbonylgruppen, in denen die Methylengruppe durch einen, weiteren Arylrest und/oder einen- oder gegebenenfalls gwei niedere Alkylreste substituiert sein kann, wie Benzyl-, Benzhydryl- .oder 2-Phenyl-isopropyl-Qxycarbonylgruppen, z.B. Carbobenzoxy, p-Brom- oder p-Chlorcarbobenzoxy, p-Nitrocarbobenzoxy oder ρ-Methoxycarbobenzoxy, ρ-Phenylazo-benzyloxycarbonyl und ρ-(ρ¹-Methoxy-phenylazo)-benzyloxycarbonyl, 2-Tolylisopropyloxycarbonyl und insbesondere 2-(p-Biphenylyl)-

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isopropyloxycarbonyl [vgl. Anmeldung G.Nr. IO73/67 (Case 6106)], sowie aliphatische Oxycarbonylgruppen wie Adamantyloxycarbonyl, Cycloperityloxycarbonyl, Trichloräthyloxycarbonyl, tert. Amyloxycarbonyl oder vor allem tert.-Butyloxycarbonyl. ,

Die Aminogruppen können auch durch Bildung von Enaminen, erhalten durch Reaktion der Aminogruppe mit 1,3-Diketonen, z.B. Benzoylaceton, Acetylaceton oder Dimedqn, geschützt werden. -

Carboxylgruppen werden beispielsweise durch Amid- oder Hydrazidbildung oder durch Veresterung geschützt. Die Amid- und Hydrazidgruppen können gegebenenfalls substituiert sein, die Amidgruppe z.B. durch die 3,4-Dimethoxybenzyl- oder bis-(p-Methoxyphenyl)-methylgruppe, die Hydräzldgruppe z.B. durch die Carbobenzoxygruppe, die ϊ Trichloräthyloxyearbonylgruppe, die Trifluoraeetylgruppe, die Trltylgruppe, die tert.-Butyloxycarbonylgruppe oder die 2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonylgruppe. Zur Veresterung geeignet sind z.B. niedere gegebenenfalls substituierte Alkanole,wie Methanol, Aethanol, Cyaninethylalkohol, Benzoylmethylalkohol oder insbesondere tert.-Butanol, ferner Aralkanole wie Arylniederalkanole, ziB. gegebenenfalls durch Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppen oder Halogenatome substituierte Benzyl- oder Benzhydrylalkohole wie

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p-Nitrobenzylalkohol, p-Methoxybenzylalkohol oder 2,4,6-Trimethylbenzylalkohol, gegebenenfalls durch elektronenanziehende -Substituenten substituierte Phenole und Thiophenole wie Thiophenol, Thiokresol, ρ-Nitrothiophenol, 2,4,5- und.2,4,6-Trichlorphenol, Pentachlorphenol, p-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, p-Cyahophenolj, oder p-Methansulfonylphenol, weiter z.B. N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid, N-Hydroxypiperidin, 8-Hydroxychinolin.

Die Hydroxygruppen der Serin-, Threonin-τ und Tyrosinreste können ζ/.B. durch Veresterung oder Verätherung geschützt werden. Als Acylreste bei der Veresterung sind' z.B. Niederalkanoylreste wie Acetyl, Aroylreste wie Benzoyl und vor allem von der Kohlensäure sich ableitende Reste wie Benzyloxycarbonyl oder Aethyloxycarbonyl geeignet. Zur Verätherung geeignete Gruppen sind z.B. Benzyl-, Tetrahydropyranyl- oder tert. Butylreste. Ferner eignen sich zum Schutz der Hydroxylgruppen die in Ber. 100 (1967), 3838 - 3849 beschriebenen 2,2,2-Trifluor-1-tert.-butyloxycarbonylamino- oder -1-benzyloxycarbonylarainoäthylgruppen (Weygand). Die Hydroxylgruppen brauchen aber nicht notwendig geschützt zu v/erden.

Die Mercaptogruppen der Cysteinreste werden z.B, durch Acylierung oder Alkylierung geschützt. Zur ' Acylierung geeignet ist z.B. der Acetyl- oder Benzoylrest, ein Niederalkylcarbamoylrest, beispielsweise

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der Aethylcarbamoylrest^ oder der gegebenenfalls substituierte Carbobenzoxyrest. Zur Alkylierung geeignet sind z.B. der tert.-Butyl- oder Benzylthiomethylrest oder gegebenenfalls substituierte Arylmethylgruppen wie Benzyl., p-Nitrobenzyl, Diphenylmethyl, Dimethoxybenzhydryl oder Trityl, .ferner Phenylcyclohexyl, Thienyl(2)-cyclohexyl u.a., vgl. Ber. 101 .(1.968), 681. Die Iminogruppe des Histidins braucht

- nicht unbedingt geschützt zu v/erden, jedoch kann es

vorteilhaft sein, sie zu schützen, z.Bs durch Benzyl, Trityl, Carbobenzoxy, Adamantyloxycarbonyl oder die oben genannten Weygand'sehen Gruppen. ■

Vorzugsweise verwendet man bei der 1. Variante des erfindungsgemässen Verfahrens zum Schutz der Carboxylgruppe der Seitenkette und gegebenenfalls der terminalen Carboxylgruppe die tert.-Butylestergruppe, zum Schutz der* Aminogruppe der Seitenkette die tert.-Butyloxycarboxylgruppe, für die Hydroxylgruppen'der Serin-, Threonin- und Tyrosinreste, sofern diese überhaupt geschützt werden, die tert ,..-Butyläthergruppe und, wenn erwünscht, zum Schutz der Iminogruppe des Histidins die 2,2,2-Trifluor-1-tert-butyloxycarbonylaminoäthylgruppe. Alle diese Schutzgruppen können, wenn erwünscht, in einer Stufe durch saure Hydrolyse, z.B.'mittels Trifluoressigsäure oder Salzsäure, abgespalten werden. Beim Aufbau der bei der 1. Verfahrenavariante als Ausgangsmaterial verwendeten geschützten Dotriacontapeptide

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unter Verwendung von mit Trifluoressigsäure

oder Salzsäure abspaltbaren Schutzgruppen werden die Mercaptogruppen vorzugsweise durch Benzyl oder Trityl geschützt. Die S-Tritylgruppen können aus dem geschützten Peptid in organischer Lösung selektiv (unter Beibehaltung der mit Trifluoressigsäure abspaltbaren Gruppen) mit Mercuriacetat und Schwefelwasserstoff abgespalten werden. Die S-Benzylgruppen können aus dem geschützten Peptid selektiv mit-Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten werden. In beiden Fällen erhält man das geschützte Peptid mit freien Mercaptogruppen.« Dieses kann zum geschützten Disulfide z.B. mit Jod in Eisessig, mit Dijodäthan oder Dirhodan in organischen Lösungsmitteln oder mit Luftsauerstoff in flüssigem Ammoniak oxydiert werden.■ Besonders vorteilhaft ist es, die Mercaptogruppen durch Tritylgruppen zu .schützen und diese aus dem geschützten Peptid unter gleichzeitiger Bildung der Disulfidbrücke mit Jod in Methanol zu entfernen, vgl. Schweizer Anmeldung Ges. Nr. 6999/68 (Case 6461). Die Bildung des Disulfidringes kann auf der Stufe· einer die beiden Cysteinreste enthaltenden Teilsequenz, z.B. des Decapeptids 1-10, oder auf der Stufe des Dotriacontapeptids ausgeführt werden.

Bei der 2. Verfahrensvariante des erfindungsgemässen Verfahrens kann das als Ausgangsmaterial verwendete

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offenkettige Peptid vorzugsweise ebenfalls mit den für Variante l) genannten Schutzgruppen hergestellt werden. Die S-Tritylgruppen können mit Trifluoressigsäure entfernt und das freie offenkettige Peptid in bekannter Weise durch Kaliumferricyanid in wässeriger Lösung oder durch Jod oder mit Luft in flüssigem Ammoniak oxydiert werden. Man kann aber auch die Tritylgruppen nach dem oben erwähnten Verfahren mit Jod und Methanol unter gleichzeitiger Disulfidbildung entfernen. ' , · .

Bei der'Herstellung der N-Aeylderivate kann die Acylgruppe· als Aminoschutzgruppe verwendet v/erden.

Die erhaltenen monomeren Peptide kennen in an sich bekannter Weise nachträglich in ihre Dimeren und umgekehrt und/oder die mono- oder dimeren Peptide in ihre Derivate, Säureadditionssalze und/oder Komplexe über- geführt werden. Die nachträglichen Umwandlungen können in zweckmässiger Reihenfolge, einzeln oder in Kombination durchgeführt werden.

Die Ueberführung erhaltener monomerer in dimere Verbindungen erfolgt ζ.B. durch Behandlung mit Mercaptoverbindungen in neutralem oder schwach saurem Medium, beispielsweise durch Behandlung mit Cysteinhydrochlorid. Die dimeren Verbindungen können unter basischen Bedingungen, z.B. mit verdünntem Ammoniak, in die monomeren Verbindungen umgewandelt werden.

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Zur Herstellung von Acylderivaten kann man das freie Peptid in üblicher V/eise N-acylieren, z.B. durch Umsetzung mit einem den betreffenden Acylrest enthaltenden gemischten Anhydrid oder Säureazid oder vor allem einem- aktivierten Ester wie Phenyl- oder substituierten Phenylester. Die Acylierung kann, wenn erwünscht, selektiv durchgeführt werden, so dass nur die a-Aminogruppe acyliert wird. ■-.-.;

Die Bildung von Säureadditionssalzen wird in bekannter Weise vorgenommen.

Auch die Bildung von Komplexen erfolgt nach bekannten oder diesen äquivalenten Methoden.

Komplexe mit anorganischen Stoffen wie schwerlöslichen· Metall-, z.B. Aluminium- oder Zinkverbindungen werden vorzugsweise in analoger Weise wie für ACTH bekannt, z.B. durch Umsetzung mit einem löslichen Salz des betreffenden Metalls, z.B. Zinkchlorid oder Zinksulfat, und Ausfällung mit einem Alkalimetallphosphat und/oder -hydroxyd hergestellt. Komplexe mit organischen Verbindungen wie Polyoxygelatine, Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyphloretinphosphat, Polyglutaminsäure etc. werden, durch Mischen dieser Substanzen mit dem Peptid in wässeriger Lösung erhalten. In gleicher Weise können auch unlösliche Verbindungen mit Alkalimetallpolyphosphaten

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hergestellt werden. ■

Die Erfindung betrifft auch diejenigen Ausführungsformen des Verfahrens/ bei denen man von einem auf irgendeiner Verfährensstufe erhältlichen Zwischenprodukt ausgeht und die fehlenden Schritte vornimmt oder das Ver- ■ fahren auf irgendeiner Stufe abbricht und/oder einen ' Ausgangsstoff in situ bildet und/oder in Form eines Salzes verwendet. ^: '

- Die als Ausgangsstoffe verwendeten Peptide -werden -erhalten., indem man die Aminosäuren, wenn erforderlich oder erwünscht unter Verwendung leicht abspaltbarer Schutzgruppen, -in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft, wobei gegebenenfalls auf einer geeigneten Stufe der Synthese die Disulfidbrücke gebildet wird. Man arbeitet zweckmässig nach den für die. Herstellung langkettiger Peptide, unter Berücksichtigung der Disulfid-Brücke, geeigneten Ver- .■-■ knüpfungsmethoden, wie sie aus der Literatur bekannt sind.

Die Verknüpfung der Aminosäure- und/oder Peptideinheiten erfolgt daher z.B. in der Weise, dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter a-Aminogruppe

und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Amino-

säure oder einem Peptid mit freier a-Aminogruppe und freier

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oder geschützter, ζ .B-." veresterter oder amidierter terminaler Carboxylgruppe umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-Aminogruppe und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter a-Aminogruppe umsetzt. Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch Ueberführung in ein Säureazid, -anhydride -imidazolid oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, Thiophenylester, p-Nitrothiophenylester, Thiokresylester, ρ-Me thansulfonylphenyl ester, p-Nitrophenylester·;^ 2,4-Dinitrophenylester, 2,4,5- oder 2,4,6-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidester, N-Hydroxyphthalimidester, 8-Hydroxychinolinester, N-Hydroxypiperidinester, oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimids (gegebenenfalls unter Zusatz von N-Hydroxysuccinimid) oder N,N¹-Carbonyldiimidazols, oder IsoxazOliumsalzes, z.B. Woodv;ard Reagens, die Aminogruppe beispielsweise durch Reaktion mit einem Phosphit aktiviert v/erden. Als gebräuchlichste Methoden sind zu nennen die Carbodiimidmethode, die Methode nach V/ey.gand-Wünsch (Carbodiimid in Gegenvmrt von N-Hydroxysuccinimid) _s- die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester und die.Anhydridmethode, ferner die Merrifield-Methode und die Methode der N-Carboxyanhydride oder N-Thlocarboxyanhydride.

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Neben der Herstellung der Endprodukte stellt auch die Herstellung der Ausgangsstoffe, vor allem des' die Disulfidbrücke enthaltenden PeptidbruchstUckes und dessen Verknüpfung mit dem restlichen Teil des Peptids einen besonderen Erfindungsgegenstand dar. Es würde gefunden, dass es vorteilhaft ist, von einer Sequenz auszugehen, welche die ersten 10 N-terminalen Aminosäuren umfasst, und ™ . mit diesem N-Terminus die gesamte restliche Sequenz zu kondensieren.

Man kann aber auch die genannte N-terminale Sequenz mit dem Fragment bis zur 28. Aminosäure (Glycin) mit freier C-terminaler Carboxylgruppe verknüpfen und das Oetacosapeptid mit dem Tetrapeptid der Aminosäuren 29-32 kondensieren. Dieses Vorgehen eignet sich insbesondere auch für die Herstellung von C-terminalen Estern, z.B. solchen, die . sich von langkettigen Alcanolen ableiten oder für die Herstellung N-substituierter C-terminaler Amide. Die Kondensation wird beispielsweise nach der Weygand-Wünsch Methode durchgeführt. Falls die Kondensation der. Sequenz 1-10 mit der C-terminalen Sequenz 11-32 ausgeführt wird, . verwendet man vorzugsweise die Carbodiimidmethode oder die Methode nach V/eygand-Wünsch. Im folgenden wird die Herstellung des N-terminalen Decapeptids (l-lO) näher erläutert. .

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Es kann z.B. aus den Sequenzen 1-4 und 5-10 oder 1-5 und 6-10 oder 1-6 und 7-10 oder 1-7 und 8-10 aufgebaut werden, wie aus den Fig. 1-8 ersichtlich; man kann jedoch auch andere Bruchstücke zum Aufbau der Sequenz 1-10 verwenden. Als Schutzgruppe für die a-Aminogruppe am Cystein wird vorzugsweise die tert.-Butyloxycarbonylgruppe oder ein äquivalente, durch saure Hydrolyse abspaltbare Gruppe verwendet, oder wenn ein N -acyliertes Dotriacontapeptid hergestellt werden soll, die entsprechende Acyl- z.B. Acetylgruppe. Daneben verwendet'man zweckmässig als Mercaptoschutzgruppen solche, die selektiv gegenüber der durch saure Hydrolyse abspaltbaren N -Aminoschutzgruppe (z.B. tert.-Butyloxycarbonylgruppe) abgespalten werden können, z.B. die Benzyl- oder Tritylgruppe. Die terminale Carboxylgruppe des Decapeptids braucht nicht notwendig geschützt zu werden, z.B. nicht, wenn Kondensationen nach der Azid- oder Anhydridmethode ausgeführt werden. Man kann diese Gruppe aber auch durch Veresterung, wie oben angegeben, schützen, z.B. durch Veresterung mit Methanol oder Aethanol (Abspaltung der Estergruppe mit verdünnter Natronlauge) oder mit Benzyl-

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alkohol oder Analogen (Abspaltung der Estergruppe z.B. mit Natrium in flüssigem Ammoniak). Der Schutz der Aminogruppen der Zwischenprodukte erfolgt mittels der üblichen Schutzgruppen,, z.B. Carbobenzoxy, Trityl, tert. -Butyloxycarbonyl oder 2-.(ρ-Biphenylyl)-isoprcpyloxycarbonyl. Die Carboxylgruppen der Zwischenprodukte werde. , wenn erforderlich, in der üblichen V/eise verestert. Die Hydroxygruppen des Serin- und Threoninrestes können durch Verätherung, z.B. mit tert.-Butanol oder Aequivalenten geschützt werden.

In den folgenden Figuren und in den Beispielen bedeutet:

1) die Azidmethode

2) die Methode der gemischten Anhydride

3") die Methode der aktivierten Ester, besonders p-Nitrophenylester (ONP) oder Hydroxysuccinimidester (OSU) .

) Δ) die Carbodiimidmethode

5) die Methode nach Vieygand-Wünsch

BOC tert.-Butyloxycarbonyl ■ ' '

DPC 2-(p-Biphenylyl) -isopropyloxycarbonyl,; "'"^

Z Carbobenzoxy

TRI Trityl

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BzI Benzyl

OtBu tert.-Butylester

OBzI Benzylester

ONB p-Nitrobenzylester

ONP p-Nitrophenylester

OMe Methylester

OEt Aethylester .

OCP 2,4,5-Trichlorpheriylester

tBu tert.-Butyläther

Ac . Acetyl

Bmp ß-Mercaptopropionyl

TFA. Trifluoressigsäure

Die p-Nitrobenzylester- und Benzylestergruppen werden in Methionin-haltigen Sequenzen mit Natrium in flüssigem Ammoniak, sonst durch Hydrogenolyse in Gegenwart von Palladiumkohle abgespalten, die Carbenzoxygruppe ebenfalls durch Hydrogenolyse, die N-Tritylgruppe mit wässeriger Essigsäure, die tert.-Butyloxycarbonylgruppe mit Trifluoressigsäure, die Diphenylisopropyloxycarbony!gruppe mit wässeriger Essigsäure oder z.B. mit einem Gemisch von Ei.-sessig, Ameisensäure (823,8^Ig) und V/asser (7:1:2) wie in der Schweizer Anmeldung G.Nr. 1073/67 (Case 6l06) beschrieben.' Der p~Nitrobenzyl- oder Methylester kann mit Hydräzinhydrat in das Hydrazid übergeführt werden. Mit verdünnter Natronlauge wird die Methylester-

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gruppe hydrolysiert. Der tert.-Butylester wird mit Triflüoressigsäure gespalten,ebenso der tert.-Butyläther. Die S-Tritylgruppen werden mit Mereuriacetat und Schwefelwasserstoff entfernt,die S-Benzylgruppe mit Natrium in flüssigem Ammoniak, wobei gegebenenfalls vorhandene Benzyl- pder p-Nitrobenzylestergruppen gleichzeitig abgespalten werden. Der Ringschluss zum Disulfid erfolgt z.B. durch Oxydation mit 1,2-Dijodäthan, derjenige der S-Trityl-geschützten Verbindungen mit Jod in Methanol»

Die.mit der N-terniinalen Sequenz zu verbindende C-terirdnale Sequenz umfassend die 11. bis 32. bzw. 11. bis 28. Aminosäure wird beispielsweise aus den Sequenzen 11-16, -17-20, 21-28 und 29-32 zusammengesetzt, wie Fig. 9 zeigt.

In diesem Schema sind die Hydroxylgruppen der Threoninreste und des Tyrosinrestes geschützt, dies ist nicht unbedingt erforderlich. Es können auch andere Teil-Sequenzen miteinander vereinigt und andere Schutzgruppen verwendet werden.

Fig. 10 zeigt den Aufbau des Hexapeptids(in Form des Hydrazids) der Aminosäuren 11-16. Es kann nach der Azidmethode mit der Sequenz 17-28 oder 17-32 verknüpft werden.

Die Sequenz 17-28 kann nach der-Azidmethodo aus den Fragmenten 17-20 und 21-28 aufgebaut werden..

, Fig.11 zeigt die Synthese des Tetrapeptidhydrazids der ,Aminosäuren 17-20, Fig. 12 den Aufbau des Octapeptids 21-28. Nach der Verknüpfung der beiden Sequenzen wird die a--Aminoschutzgruppe abgespalten (die Carbobenzoxygruppe durch Hydrcgenol3'se in Gegenwart von Palladiunikchle) und das so erhaltene Dodecapeptid mit geschützten Seitenketten nach der Azidmethodc- mit dem Hexapeptidhydrazid 11-16 (Fig.10) kondensiert. ■

Die so erhaltene Sequenz 11-28. kann mit dem Tetrapeptidamid der Aminosäuren 29-32, dessen Herstellung Fig. 13 zeigt, verbunden werden, z.B. nach der Methode von V/ey gand-V/uns eh. N-2_an erhält dann, das geschützte. Docoss-peptidamid 11-32. Aus diesem kann man die a-Arr.inosehutzgruppe. , abspalten (Carbobenzoxy z.B. hydrogsnolytisch, DPC mit co^ige

Essigsäure oder Eisessig-Ameisensäure (82,8^ig) - Wasser (7:1:2)) und die so erhaltene Verbindung mit freier cc-Amino» gruppe nach Entfernung der Essigsäure mit dem K-terrninalen Decapeptid (Fig. 1-8) verknüpfen, beispielsv/eise nach der Methode der gemischten Anhydride,'der aktivierten Ester (OSU) oder nach Weygand-Wünsch.

Man kann aber auch die Sequenz 11-28

mit freier C-terminal'er Carboxylgruppe nach Abspaltung der a-Aminoschutzgruppe in der geno.nnten Weiüc ,

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mit dem N-terminalen Decapeptid nach der Methode der gemischten Anhydride verknüpfen und das so erhaltene Produkt mit dem Tetrapeptidamid 29-32 kondensieren, z.B.. nach Weygand-Wünsch. ' . ■"'.*■

Eine weitere Möglichkeit, die C-terminale Sequenz 11-32 aufzubauen, besteht z.B. darin, dass man sie' aus den Teilsequenzen 11-19 und 20-32, die in Fig. 14' und 15 gezeigt sind, zusammensetzt, vorzugsweise nach der Methode der"gemischten Anhydride oder nach Weygand-Wünsch.

Nach dem Schema von Fig. 15 kann auch die C-terminale Sequenz mit freier Carboxylgruppe hergestellt werden. In diesem Fall wird z.B. die an Aminosäure 32 vorhandene tert. Butylestergruppe nicht abgespalten und in die" Amidgruppe übergeführt", sondern" bis zu Stufe J beibehalten. Die Kondensation der Sequenz 20-32 mit C-terminaler freier Carboxylgruppe ' -mit der Sequenz II-I9 von Fig. 14 erfolgt z.B. nach der Methode der gemischten Anhydride, ebenso die Verknüpfung der so erhaltenen Sequenz II-32 mit der N-terminalen Sequenz 1-10.

Aus dem geschützten Dotriacontapeptidamld

109810/2197

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werden die Schutzgruppen abgespalten, beispielsweise mit Trifluoressigsäure, oder mit konzentrierter Salzsäure.

Das für das Verfahren gemäss Variante 2) zu verwendende Dotriacontapeptid mit freien bzw. Tritylgeschützten SH-Gruppen kann in analoger Weise wie das oben beschriebene geschützte Dotriacontapeptid hergestellt werden, mit dem Unterschied, dass die geschützten SH-Gruppen bis sum Schluss der Synthese beibehalten werden. Erst nachdem alle übrigen Schutzgruppen aus dem geschützten Dotriacontapeptid entfernt worden sind, spalte.tman die SH-Schutzgruppen ab bzw. oxydiert die Tritylgeschützte Verbindung direkt wie oben erwähnt.

Das Verfahren gemäss Variante 3) eignet sich besonders für die Herstellung von Endprodukten, in denen die a-Aminogruppe und die Seitenkettenaminogruppe acyliert sind. Das N -acylierte Decapeptid kann z.B. nach Fig. 5 K hergestellt werden; man kann jedoch auch als Aminoschutzgruppe von Anfang an die beizubehaltende Acylgruppe wählten. Die Synthesemethoden entsprechen den oben beschriebenen. ■ Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen". Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch ver-

109810/2197

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wendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen, wie z.B. solche mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, beispielsweise'Salzsäure oder Bromwasserstoff säure, Perchlorsäure, Salpetersäure oder TMοcyansäure^ Schwefei- oder Phosphorsäuren, oder organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäüre, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Aepfelsäure, Weinsäure, ZitronenT-säure, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, 4-Aminobenzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäurejt Anthranilsäure, Zimtsäure, Mandelsäure* Saliöylsäure, 4-Aminosalicylsäuren 2-Phenoxybenzoesäure, 2-A-cetoxybenzoesäure, Methansulfonsäure,, Aethansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzolsulfon- säure, p-Töluolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder SuIfani1säure.

Bie verfahrensgemäss erhaltenen Peptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Biese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutisehen, organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage,» die mit den Polypeptiden nicht reagieren, wie z.B. , Gelatine Milchzucler, Glukose, Kochsalz, Stärke,

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109 810/2197

Magnesiumsfrearat, Talk, pflanzliche OeIe, Benzylalkohole, Gummi. Polyalkylen-glykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z.B. als Lyophilisat oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten.

Die Erfindung wird in d-en folgenden Beispielen be schrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

In der Dünnschichtchromatographie werden die folgenden Systeme verwendet:

n-Butanol-Pyridin-Wasser (46:31:23) tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser(IOD:4o:10) tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser(51:21:28) tert.-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser(32:32:36) see. Butanol-3^iges wässeriges Ammoniak (70:30) n-Butanol-Eisessig-Wasser (75:7,.5: 21) n-Butanol-Eisessig-Wasser (67:10:23) n-Butanol-Ameisensäure-Wasser (60:0,75:39) Aethylacetat-Pyridin-Wasser (40:20:40.) n-Butanol-Pyridin-Wasser (34:33:33) ., Isopropanol-Ameisenoäure-Wasser (77:4:IQ)

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: Aethylacetat-Methyläthylketon-Ameisensäure-V/asser

(50:30:10:10)

102E : Esslgester-Methyläthylketon-EisesBlg-Wasser

■(50:30:10:10)

104 : Chloroform-Methanol-17?jiges wässeriges Ammoniak

" IO7 ν Aethylacetat-Pyridin-V/asser (49:24:27)

110 : Aethylacetat-n-Butanol-Pyridin-Eisessig-Waüser

(42:21:21:6:10)

" 115 : Aethylacetat-Pyridih-Ameisensäure-Wasser

(63:21:10:6)

" 121A : Isopropanol-Ainmoniak (26^ig)-Wasser (85:5:10)

System 1 : Benzol-Aethanol (8θ:2θ) ' ·

" 2 : Benzol-Aethanol (90:10)
" 3 : Benzol-Aethanol (95:5)

" 4 : n-Amylalkohol-Ameisensäure-Wasser (70:20:10) " 5 : n-Butanol-Essigsäure-V/asser (66,6:1.6,7:16,7) " 6 : n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-V/asser (66, 6: 12j5^: 4,2 :1.6,7=) " 7 : n-Aniylalkohol-Pyridin-Wasser (50:30:20) " 8 : Chloroform-Methanol-Eioesslg (87,4:9,7:2,9) ¹¹ 9 : Benzoi-Aethanol (70:30).

Die Dünnschichtchrornatotsraphie wird auf' SiI lo.ic.cl oder Aluminiumoxid ("Alox" D-O der LM.rma Camaß mil i\% Olp«) oder auf Cülluloac

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Fig. 12

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Beispiel 1

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II-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-AIa-Ilfe-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH (Calcitonin M)

150 mg BOC-Cys-GIy-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBuJ-Cys-Met-Xeu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys-(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Prο-GIn-Thr(tBu)-AIa-Ile-Gly-· Väl-Gly-Ala-Pro-liH₀ werden in 3 ml 95^iger Trifluoressigsäure gelöst/ mit Stickstoff bespült und während 90 Hinuten bei 25 stehen gelassen« Das Trifluoracetat des freigesetzten Datriakontapeptidamides wird sodann durch Zufügen von βθ ml absolutem und peroxidfreiem Aether als amorphes Pulver ausgefällt _s abzentrifugiert, in 10 ml frischem Aether· suspendiert, nochmals .zentrifugiert, und der Rückstand bei- 30 getrocknet. Zur Umwandlung in das Acetat löst man das Trifluoracetat in 3 ml Wasser und filtriert durch eine mit 0,02-n. Essigsäure äquilibrierte Säule von schwach basischem Ionenaustauscher (z.B. Merck Nr. II; 0 7,5 mm; 1 = 20 cm). Man wäscht mit 0,02-n. Essigsäure bis zur Folin-negativen Reaktion, konzentriert das Eluat auf ein Volumen von ca. 5 nil und filtriert es durch eine Säule von Bio-Gel P 6, äquilibriert in 0,1-n. Essigsäure (Volumen des Gelbettes = 200 ml). Das Eluat wird dünn-

10 9610/2197

BAD ORH31NÄI-

schichtChromatograph!sch analysiert (Alox, System 52).. Die Hauptfraktionen (Maximum: bei ca. 100 - 120 ml) werden vereinigt.,_: im Rotationsverdampfer (Innentemperatur nicht über 20 ) zur Trockne eingeengt, in 5 nil Wasser wieder gelöst und lyophilisiert. Das so erhaltene Produkt wird zur endgültigen Reinigung einer Craig-Verteilung über. 500 Stufen im Lösungsmittelsystem n-Butanol-Eisessig-Wasser (4:1:5, Vol.) mit Phasenvolumina von je J> ml unterworfen. Aus den Vertellungselementen Nr. I4l-l8ö (Max. beiNr* 1Ö2; K= 0,48) isoliert man beim Einengen zur Trockne (Rotationsverdampfer, Innentemperatur höchstens 20 ), Lösen in 0,1-n. Essigsäure und Lyophilisieren das chrOmatographisch und elektrophoretisch einheitliche. Dotriakontapeptidamid. als weisses, amorphes Pulver.

In der Dünnschichtchromatographie weist es folgende Rf-Werte auf:

auf "Alox" D-O (Fa. Camag; . Rf (52) =0,56 Aluminiumoxid mit 8^ Gips) Rf (79) =0*66

Rf C*5> = 0,45

auf Cellulose "Selecta" l440 Rf (45) = 0,51 (der Fa. SclU-eichfirr und Sctonell^Rf (101A)- 0,60 Fertigplatten)

Elektrophorese auf Cellulose "Selecta" pH 1,9, 1^2 Stunden, 280 V : Laufstrecke = 3,5 cm zur Kathode,. pH 7,1, I¹ZS Stunden, 280 V : Laufstrecke = 1,3 cm zur Kathode.

109810/2197

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Das Äusgangsiria-terial kann wie folgt hergestellt; werden:

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■lö,.? g H-Leu-OMe und 46,0 g Z-Äsn-ONP werden-In 100 ml •frisch destilliert era Dimethylformamid gelöst.. "Die Lösung: wird. 19 Stunden bei 25° stehen gelassen. Hierauf gibt . ' man 1,2 Liter Wasser zu und nutseht die kristalline Fällung, ab. Das Dipeptidderivat wird bei 40 im Vakuum getrocknet und dann zvreimal aus'Methanol-Wasser urnkristallisiert.·; °i [α]^° +9°

F. l80-l8l°i [α]^°= +9° (c = 2,05 in Ghloroformi.; 2r. E-Äsn-Leu-OMe

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15*0 g Z-Äsn-Leu-OMe werden in 400 ml t-Butanol-Wafsser: C9:1) gelöst und in Gegenwart von 2 g Falladium-Kbhle (10^ Pd) hydriert, liaeh Beendigung der Hydrierung wird vonr Katalysator abgenutscht und bei 40° eingedampft. Der Rückstand wird direkt weiter.^verwendet.

5. Z-Crly-Asn-Leu-OMe .

•4,4 mMol H-Äsn-Leu-OMfe werden in 15 ml.. Dimethylformamid gelöst und dann 5,5 mMol Z-Gly-p-NitrOphenylester zugegeben. Die klare, gelbe Lösung wird l8 Stunden bei 2?° belassen. Dann wird im Hochvakuum bei 40° eingedampft, getrockneft und der^ Rückstand mit Essigester versetzt, wobei er kristallisiert. Nach 1 Stunde bei 0° wird abgenutscht

109810/2197

- 47 -

und getrocknet. Dann wird das Produkt nochmals in 25 ml

Essigester suspendiert, zerrleben, abgenutscht und.getrocknet; F/

4. H-GIy^Asn-Leu-OMe

1*3 S Z-GIy-Asn-Leu-OMe werden unter Erwärmen in 100 ml Methanol gelöst und die auf Raumtemperatur abgekühlte Lösung wird in Gegenwart von 0,3 S Palladiumkohle (10$ Pd) hydriert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme wird vom Katalysator abgenutscht und zur Trockne verdampft. Dabei werden 76O mg H-Gly-Asn-Leu-OMe in amorpher Form erhalten.

5. BOC-CyS(TRI)-GIy-Asn-Leu-OMe

710 mg H-Gly-Asn-Leu-OMe und 1,36 g BOC-Cys(TRl)-OH werden in 12 ml Acetonitril gelöst und die auf 0 gekühlte Lösung wird mit 820 mg Dicyciohexylcarbodiimid versetzt. Nach 30 Minuten bei 0° und 60 Stunden bei 28° wird vom Dicyclohexylharnstoff abgenutscht und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Petroläther versetzt, zerrieben, die Petrolätherlösung abgegossen und das unlösliche Produkt in Essigester aufgenommen. Die Essigesterlösung wird bei 0 mit verdünnter Zitronensäurelösung, Wasser, Natriumbicarbonatlösung und V/asser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das als farbloses Harz erhaltene Tetrapeptidderivat

1098 10/2197 BAO origihal

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wird zur Reinigung mehrmals aus Aceton-Aether gefällt. Ausbeute: 1,2 g Pulver, das nach Dünnschichtchromatographie an Silicagel einheitlieh ist; Rf = 0,39 im System Chloroform-Methanol (9:l).

6. BOC-CyS(TRl)-GIy-ASn-LeU-NHNH₀ ' ■

■ 988 mg BOC-Cys (TRI-)-Gly-Asn-Leu-OMe werden in 20 ml Methanol gelöst und zu der auf 0 . gekühlten Lösung werden 2 ml Hydrazinhydrat zugegeben. Nach 14 Stunden bei 2 werden 200 ml eiskalte 0,5-n. Essigsäure zugegeben, die abgeschiedene Fällung wird gründlich zerrieben, abgenutscht, mit Eiswasser neutral gewaschen und im Vakuumexsikkätor · über Nacht getrocknet. Das rohe BOC-Cys(TRl)-GIy-Asn-Leuhydrazid wird durch 2-maliges Umfallen aus Methanol-Wasser gereinigt. Bei Dünnschichtchromatographie aus Silicagelplatten ist R_f'= 0,2 im System Chloroform-Methanol (9:l).

7. BOC-Met-Leu-GIy-OMe ;

5 g. Z-Leu-GIy-OMe (J. am. ehem. Soc. 7_8^_ 2126 (1956)') werden in 200 ml Methanol gelöst und die auf 0 gekühlte Lösung wird in Gegenwart von 1 g Palladiumkohle (10^ Pd) unter intensivem Rühren bei 0° hydriert. Nach beendeter Hydrierung wird vom Katalysator abgenutscht, und das Filtrat im Vakuum bei 25 Badtemperatur eingedampft.

1 0 9810/ 219 7 bad

Der ölige Rückstand wird ohne Trocknung mit 4 g BOC-Methionin versetzt und das Gemisch in 100 ml Acetonitril gelöst. Dann wird im Vakuum auf ein Yolumen von 60 ml eingeengt, auf 0° gekühlt und es werden 4,5 g DieyeIohexylcarbodiimid zugegeben. Nach Entgasen mit Stickstoff wird 30 Minuten bei 0 und l8 Stunden bei 25 belassen. Dann wird vom ausgeschiedenen Dieyclohexy!harnstoff abgenutscht und das Piltrat zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird mit Petroläther unter Zerreiben gewaschen, die Petrolätherlösung abgegossen und das unlösliche Produkt getrocknet. Dann wird es in Essigester gelöst und die Lösung mit verdünnter Zitronensäurelösung, Wasser, Natriumbiearbonatlösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird zur Reinigung in der minimalen Menge peroxydfreiem Aceton gelöst und durch Zugabe von peroxydfreiem Aether gefällt; dabei wird das Trlpeptidderivat BOC-Met-Leu-Gly-OMe als festes Pulver erhalten. · "

8. H-Met-Leu-Gly-OMe .

3 g des unter 7)erhaltenen Tripeptidderivates werden, mit 60 ml 0,4-n. HCL in Essigester versetzt /und das Reaktions-Gemisch wird 90 Minuten bei 25° belassen. Dann wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand (H-Met-Leu-Gly OMe-Hydrochlorid) ,24 Stunden bei 0,01 Tor über Aetznatron •getrocknet, ' '

' ^C ■ 109810/2t97 bad

9* TRI-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OMe . . · .. . ■ -

1,23 g H-Met-Leu-Gly-QMe, HCl und-1,4-3 TRI-Cys(TRl)-OH werden mit 15'-ml-Acetonitril und 3OO mg N-Methylmorpholin versetzt," Nach Abkühlen auf O wird 8OO mg Dicyclohexylcarbodlimld zugegeben und ^»s Reaktionsgemisch 1 Stunde bei 0° und 45 Stunden bei 3O⁰ unter Stickstoff gerührt. Dann wird abfiltriert, das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit Petroläther zerrieben.: Die-Petroläther-Lösung wird abgegossen, der Rückstand getrocknet und in Essigester gelöst. Die Essigesterlösung wird bei 0° mit Zitronensäurelösung, Wasser, Natrium**!- , carbonatlösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Zur Reinigung wird das Rohprodukt (schwach gelbliches Harz)"in möglichst wenig Methanol gelost und die Lösung an. einer in Methanol bereiteten Säule von Sephadex LH-20 (2,5 + 90 cm) chromatographiert. Es vrerden Fraktionen ä 4 ml aufgefangen, einzeln eingedampft und Ihre Reinheit mittels DünnschichtcliromatogräpMe auf ßtllcagelplatten Im System Chloroform-Methanol. (99*-0 kontrolliert.

IQaVH-Cys(TRl)-Met-Leu-Gly-ÖMe . . · _v :

1,11 g des unter 9) erhaltenen Tetrapeptldderivates werden gelöst in 15-ml 75#iger Essigsäure und Ϊ Stunde bei

30° belassen. Dann wird im Hochvakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit peroxydfreiem Aether zerrieben. Das dabei erhaltene feste Pulver (essigsaures Salz von H-Cys(TRl)-Met-Leu-Gly-OMe) wird abgenutscht, mit Aether gewaschen und getrocknet, Ausbeute: 695 mg·

10b. H-Cys (TRI) -Met-Leu-GIy-OH

740 mg H-Cys(TRl)-Met-Leu-Gly-OMe werden in 10 ml Methanol und 1,3' ^ml Wasser in der V/arme gelöst. Unter Stickstoffspülung tropft man bei Zimmertemperatur 3*0 ml 1,0-n. Natronlauge zu und rührt 25 Minuten. Dann kühlt man auf 0° ab, gibt Ji,0 ml 1,0-n. Salzsäure und 20 ml Wasser zu und filtriert den flockigen Niederschlag ab, wäscht ihn mit kaltem Wasser und trocknet ihn bei Zimmertemperatur über Aetznatron am Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz.

Rf₇₀ = 0,40; -Rf₁₂^ = 0,45.

11. H-Thr(tBu)-OMe

12,92 g (40 mMol) Z-Thr(tBu)-OMe werden in 200 ml Eisessig und 3 S Pd-Kohle (l0$) bei Zimmertemperatur hydriert. Die Aufnahme von Wasserstoff ist nach einer Stunde beendet. Die Lösung wird vom Katalysator abfiltriert und am Wasserstrahlvakuum bei 35 eingedampft. Nach dem Trocknen am Hochvakuum bei 35 resultieren 7,3 g eines OeIs, das gemäss Dünnschichtchrornatogramm einheitlich ist und direkt weiter verwendet wird.

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12. DPC-Ser(tBu)-Thr(tBuy-OMe

19,3 g (38,6 mMol) DPC-SerCtBu)-OH, Cyclohexylaminsalz werden in 500 ml Chloroform aufgenommen und bei 0 dreimal mit 25 ml 1-n. Zitronensäure und fünfmal mit ²K) ml halbgesättigter Kochsalzlösung ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen der Lösung über Natriumsulfat wird eingedampft und der erhaltene Schaum in 250 ml Essigester aufgenommen. Man gibt 5,36 ml (38,6 mMol) Triäthylamin zu, kühlt die Lösung auf -10° ab und versetzt unter Rühren mit 5,13 ml (38,6 mMol) Isobutylchlorocarbonat. Es wird 10 Minuten bei -10 gerührt und dann die auf -12 gekühlte Lösung ' Von 7.3 S (38*6 mMol) H-Thr(tBu)-OMe in 100 ml Essigester so zugetropft, dass· die Reaktionstemperatur -10° nie übersteigt. Nach beendetem Eintragen wird noch eine Stunde bei -10° gerührt und dann über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen.: Die .Lösung wird vom ausgeschiedenen Triäthylamin-Hydrochlorid abfiltriert und bei. 0° dreimal mit je 20 ml 1-n, Zitronensäure und fünfmal mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft. Rohprodukt (Oel)i 22,07 g· Zur Reinigung wird Ig an einer Silicagelsäule (2,5 cm, 2° ^cm) chromatographiert. Mit ^Petroläther-Essigester (l:l) werden nach einem Vorlauf von 110 ml 787 mg reines. Produkt eluiert. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicägel in Toluol-Aceton

"(T:3) ist Rf = 0,51.

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13. BPC*-Ser (tBu) -Thr (tBu) -NH-NK₁

^i253 S (7,4 mMol) DPC-Ser(tBu) -Thr(tBu) -OMe in 18 ml Methanol werden mit 5*55 ml (ca. 110 rnMol) Hydrazinhydrat versetzt und 10 Stunden bei Zimmertemperatur und 2 Stunden bei 40 stehen gelassen. Die Reaktionslösung wird in 45Ο ml Essigester aufgenommen und' viermal mit halbgesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach dem Trocknen der Losung über Natriumsulfat wird auf ca. 15 ml eingeengt und mit ca. 5 ml Petroläther versetzt. Ueber' Nacht kristallisieren

3,17 g des Hydrazide vom F. 132-134° aus.

Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Toluol-Aceton

(7:3) ist Rf = .0,40*

BAD ORIGINAL

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l4a DPG-Ser'(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leü^Gly-OMe

"9ÖÖ mg J)PC-Ser (tBu).-Thr (tBu)-NHNH₂ in 12 ml Dimethylformamid werden bei -20° mit 2,0 ml 2,0-n. HCl in Essigester und dann mit 210 mg t-Butylnitrit versetzt» Nach 15 Minuten bei -10°· lässt man die auf -10° gekühlte Lösung von 680 mg des essigsauren Salzes von H-Cys(TRl)-Met-Leü-

W GIy-OMe in 9 ^ml Dimethylformamid zutropfen und gibt dann hoch 350 Rig N-Methylmorpholin zu. Die Reaktionstemperatur soll bei diesen Zugaben -5 nicht überschreiten. Dann rührt man 1 Stunde bei -5° und l8 Stunden bei 25°· Hierauf dampft man im Vakuum und dann im Hochvakuum auf ein kleines Volumen ein und fällt das Rohprodukt durch Zugabe von Eiswasser aus. Das Produkt wird gründlich ' zerrieben/ die Wässerige Lösung abgegossen und das unlösliche Hexa-

μ. peptidderivat getrocknet. Zur Reinigung wird es je zweimal aus Methanollösung durch Zugabe von Wasser und dann aus Essigesterlösung durch Zugabe von Petroläther ausgefällt. mn erhält 480 mg DPC-Ser(tBu)-Thr(tBü)-Gys(TRI)-Met-Leu-GIy-OMe. . ' ^;

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- 55 -l4 b, DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH

857 mg DPC-Ser (tBu)-Thr (tBu)-NH-NH₂ in 8,0 ml Dimethylformamid werden bei -10 mit 1,87 ml 2,0-n. Chlorwasserstoff in Essigester und 0,19 ml t-Butylnitrit versetzt. Nach 15 Minuten bei -10 tropft man unter Stick-, stoffspülung eine Lösung von 665 mg H-Cys(TRl)-Met-Leu-GIy-OH und 0,ββ5 ml Triethylamin in 7 ml Dimethylformamid zu. Es wird noch eine Stunde bei -10 gerührt und 24 Stunden bei 0 stehen gelassen. Einengen des Reaktionsgemisches auf ca. 3 ^ml (Hochvakuum, J>0 ) und Fällen mit 50 ml Wasser liefert ein flockiges Produkt, das abfiltriert, mit Wasser gewaschen und über Aetznatron am Hochvakuum getrocknet wird. Reinigung durch Umfallen aus Benzol-Hexan. Rf = 0,36 im System Chloroform-Methanol (7:3).

15. DPC -Ser-(tBu) -Thr (tBu) -Cys(TRI) -Met-Leu-Gly-OH

2,3 g des nach l4a) hergestellten Hexapeptidderivates werden in 100 ml Dioxan-Wasser (4:1.) gelöst und 5 ml 1-n. Natronlauge zugegeben. Nach 90 Minuten bei 27° wird die

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überschüssige Natronlauge durch Zugabe von etwas festem ■ Kohlendioxyd abgestumpft, die Lösung im Vakuum auf ein Volumen von etwa 10 ml eingeengt und hierauf 80 ml eiskalte, 2$ige"wässerige Zitronensäurelösung zugegeben. Das ausgefallene Hexapeptidderivat und gründlich zerrieben, abgenutscht und, mit mehreren Portionen"Eiswasser- gewaschen " und im Vakuumexsikkator getrocknet. . .

16. H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRl)-Met-Leu-GIy-OH (essigsaures

870 mg des unter I5) erhaltenen Hexapeptidderivates werden in I5 ml SO^iger Essigsäure gelöst, und die Lösung wird β Stunden bei 3° belassen. Hierauf wird im Hochvakuum bei 30 zur Trockne eingedampft, der Rückstand 1 Stunde bei 30 getrocknet und dann mit peroxidfreiem Aether versetzt und das entstandene Pulver gründlich zerrieben. Es wird abgenutscht, mit viel Aether nachgewaschen und getrocknet. ·

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17. BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRl)-Met-Leu-GIy-OH

•1,0 g BOC-Cys(TRI)-GIy-ASn-LeU-MIMI₂ wird in 20 ml Dimethylformamid gelöst und die auf -10° gekühlte Lösung unter Rühren mit 1,5 ml 2,0-n. HCl in Essigester und lh'j, mg t-Butylnitrit versetzt» Nach 15 Minuten bei -10 werden weitere 10 ml auf -10° gekühltes Dimethylformamid, 1,0 g fein gepulvertes H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRl)-Met-Leu-Gly-OH (essigsaures Salz) und 400 mg N-Methylmorpholin zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird unter Stickstoff 1".Stunde, bei -10° und 48 Stunden bei 28° gerührt. Hierauf wird am Hochvakuum auf ein Volumen von ca. β ml eingeengt und das Decäpeptidderivat durch Zugabe von 100 ml Eiswasser gefällt. Der entstandene Niederschlag wird zerrieben, abgenutscht und im -Väkuumexsikkator über Aetznatron getrocknet. Das Produkt zeigt im Dünnschiehtehromatο-gramm auf Silicagelplatte R„ in Chloroform-Methanol (= 7:3) =0,60.

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19Λ15ΊΊ

. BQC-GJ^Gly-AGn~Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu).-Cys-Met-Leu-Gly-OH

300 rag: BQC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-(TRI)-Met-Leu-GIy-OH werden in 100 ml Methanol gelost und im Verlauf von 1 Stunde zu einer intensiv gerührten Lösung von, 400_: mg Jod in 120 ml Methanol getropft. !lach beendeter Zugabe rührt man 45 Minuten weiter und 'entfärbt dann die auf 0 gekühlte Lösung mit 1-n. wässriger Natriumthiosulfatlösung;. Dann engt man im Vakuum auf ein Volumen von ungefähr 10 ml ein und fällt das Decapeptidderivat durch Zugabe von 100 ml eiskalter, l^iger wässriger Essigsäurelösung aus.. Nach Zerreiben,- Abnutschen und Waschen mit Eiswasser trocknet man das Produkt im Exsikkator über Aetznatron.. Das Produkt Viird zur Reinigung einer Gegenstromverteilung im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:3:5:4) unterworfen (Puffer: 29 ml· Eisessig, I9 g Ammoniümacetat j mit Viasser auf 1 Liter aufgefüllt);. .· '

Die das reine Decapeptidderivat enthaltenden Fraktionen werden'vereinigt und die Losung wird eingedampft. Zur Entfernung von Ammoniümacetat wird das Produkt in Chloroform gelöst und die Lösung 3 mal mit verdünnter Zitronensäurelösung und 3 mal mit Wasser gewaschen und dann zur Trockne

eingedampft.

Dünnschichtchromatogramm auf Silicagelplatten Rf_10n - O,45l Rf_121A = 0,55; Rf₇₀ =0,40; Rf_43C =0,35.

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19· Z-Asp(OtBu)-Phe-OCH ·

3jO g Phenylalaninmethylester-hydrochlorid werden zusammen mit 6,17 g Z-Asp.(0tBu)~0NP in 25 ml absolutem Ν,Ν-Dimethylformamid zu einer klaren Lösung gelöst und unter Rühren mit 1,93 ml Triäthylamin versetzt. Die tiefgelbe Suspension wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, dann in viel Essigester aufgenommen und dreimal mit verdünnter wässriger Zitronensäurelösung, fünfmal mit verdünnter wässriger Sodalösung und zuletzt mit gesättigter wässriger Kochsalzlösung gewaschen so lange, bis die Waschflüssigkeit neutral bleibt. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird eingedampft und das entstandene äther- und chloroformlösliche OeI durch Säulenchromatographie an Silicagel (die Substanz wird mit Toluol und Toluol/Aether 4:1 eluiert) gereinigt:; man erhält ein farbloses, öliges Produkt. - .

■An Silicagel ist der Rf-Wert in Chloroform-Methanol (9:1) 0/75; in Chloroform-Aceton (i:l) 0,67·

20. Η-Asp(OtBu)-Phe-OCH,,HCl

770 mg des Dipeptides Z-Asp(OtBu)-Phe-OMe werden in 200 ml Methanol gelöst und Unter Zusatz von Ο,βΟ ml Chlorwasserstoff in Dioxan (3,0-N, 1,8 mMol) und 200 mg

109810/2197 BAO original

Palladiumkohle-Katalysator (1Ο#) mit Wasserstoff in der Schüttelente bei Raumtemperatur decarbobenzoxyliert. Nach Beendigung der sehr schnellen Wasserstoffaufnahme wird •filtriert, eingedampft, in Essigester von etwas Unlöslichem abfiltriert und mit Aether gefällt. ■ Im Dünnschichtchrorfiatogramm an Silicagel im System Chloroform-Methanol (9:1) ist Rf = 0,60; Rf 43C ■= 0,63.

21. Z-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH, , -

•.55O mg H-Asp (OtBu) -Phe-OCH , HCl v/erden zusammen mit 574 mg Z-GIn-ONP in 2,5 ml absolutem Ν,Ν-Dimethylformamid gelöst und mit 0,20 ml Triäthylamin während 15 Stunden bei · 30-33° .Badtemperatur gerührt. Anschliessend wird in viel Essigester wie unter I9. beschrieben ausgeschüttelt, getrocknet und eingedampft. ' .

22. H-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH , HCl

4,4 g Z-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH werden in 3OO ml Methanol nach Zugabe von 2,4 ml Chlorwasserstoff in Dioxan (3jO N, 7,2 mMbl) und 90O mg lO^igem Palladiumkohle-Katalysator mitWasserstoff bei Raumtemperatur in der Schüttelente, decarbobenzoxyliert-. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme wird filtriert und am Vakuum zur Trockene "eingedampft. Der gelbliche, feste Rückstand wird zweimal mit Aether verrieben und ohne weitere Reinigung für die nächste Stufe verwende't. ■ ~

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- 6i ■ '

23· Z-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Phe-OCH₃

3,68 g Z-Thr(tBu)-OH, Dicyclohexylainraoniumsalz werden in Essigester dreimal mit verdünnter wässeriger Zitronensäurelösung und dreimal mit gesättigter wässriger Kochsalzlösung geschüttelt, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das daraus resultierende, wasserklare OeI wird mit 3,34 g H-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH, HCl in 40 ml Methylenchlorid gerührt, 0,9 ml Triäthylamin beigefügt und die Lösung von 1,54 g Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml Methylenchlorid zugetropft. Man wäscht nach mit 10 ml Methylenchlorid und rührt die Suspension bei Raumtemperatur l4 Stunden. Dann stellt man 2 Stunden in den Kühlschrank, filtriert vom festen Niederschlag ab, den man mit wenig Methylenchlorid wäscht und schüttelt das Piltrat in viel Essigester wie bei 19. beschrieben aus. Der amorphe Eindampfrückstand wird mit Aether-Hexan (l';l) verrieben und getrocknet.

24. H-Thr(tBu)-GIn-Asp(OtBu)-Phe-OCH,

4,3 g Z-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Phe-OCH werden in

300 ml Methanol mit 1 g lO^igem Palladium-Kohle-Katalysator

/
wie üblich hydriert, nach Beendigung der Wasserstoffauf-

nahme filtriert und eingedampft. Der Eindampfrückstand, ein fester., farbloser Schaum, wird ohne weitere Reinigung in

die nächste Stufe eingesetzt.

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25- Z-Tyr·(tBu)'-ThF(tBu)-Gin-ΛSp(OtBu)-PhC-OCH

3*5 g Z-Tyr(tBu)-0H, Dicyclohexylammoniumsalz wird in Essigester wie unter 23. beschrieben mit Zitronensäure die Säure freigesetzt und das erhaltene,,' klare OeI mit ■ 3,29 g H-Thr(tBu)-GIn-Asp(OtBu)-Phe-OCH in 80 ml Acetc·- · nitril gerührt. Dazu gibt man 1,31 S Dicyclohcxylcarbodiimid in fester Form un;l rüiirt 24 Stunden'bei Zimmertemperatur. ■ Nun wird vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, dieser mit etwas Acetonitril gewaschen, und das FiItrat zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in viel Chloroform gelöst und ausgeschüttelt und zwar dreimal mit verdünnter wässriger Zitronensäurelösung, dreimal mit verdünnter wässriger Sodalösung und viermal mit gesättigter Kochsalzlösung., Nach dem Trocknen über- Natriumsulfat wird eingedampft und der Rückstand in Methanol-Essigester (l:8.) gelöst und mit Petroläther in der Kälte gefällt. Die Fällung wird wiederholt. Das geschützte Pentapeptid resultiert als feinkörniges Pulver. ^: ;

26. H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-GIn-ASp(OtBu)-PhC-OCH₅

4,0 g Z--Tyr (tBu)-Thr (tBu)-Gin-Asp (OtBu)-Phe-OCH, werden in 100 ml absolutem vorhydriertem N,N-Dimethylformaraid unter Zusatz v_%on 1,4 g !Obiger Palladium-Kohle bei ,

•Zimmertemperatur mit Wasserstoff' decarbobenzoxyliert. -

" "; 1098i0/2197 ■

Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme wird mit 400 ml Methanol verdünnt, filtriert und im Vakuum eingedampft. Der farblose, feste Rückstand wird ohne weitere Reinigung für die nächste Stufe verwendet.

27. -Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-GIn-Asp(QtBu)-Phe-OCH,

Aus 2,85 g Z-Thr(tBu)-OH, Dicyclohexylammoniumsalz wird in Essigester wie unter 25. beschrieben mittels Zitronensäure die Säure freigesetzt, und das erhaltene OeI von Z-Thr(tBu)-OH mit 3,33 g H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-GIn-Asp(OtBu)-Phe-OCH-, in 80 ml Acetonitril bei Zimmertemperatur gerührt. Dazu werden in fester Form 1,20 g Dicyclohexylcarbodiimid gegeben und es wird 23 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abfiltrieren des ausgefallenen Dicyclo-

hexylharnstoffes, den man mit drei Portionen ä 7 ml

Acetonitril wäscht, wird am Vakuum eingedampft und der . Rückstand dreimal aus Essigester/Alkohollösung mit Petroläther gefällt. .

28. Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-GIn-Asp(OtBu)-Phe-NHNHg

1,3 g Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Phe-OCH, vrerden in 30 ml "Methanol gelöst und bei 0° mit 0,6 ml Hydrazinhydrat versetzt. Man belässt drei Tage im Kühlschrank, wobei ein gallertiger Niederschlag ausfällt. Diesen

10981072197 sad original

verfestigt man durch Zugabe von Aether, filtriert und kristallisiert den Rückstand aus Aethanol/Aether um.

29. Z-Lys(BQC)-Phe-OMe .

25,0 g Z-Lys(BOC)-ONP und 10,7 g H-Phe-OMe, PICl in 70 ml Dimethylformamid werden unter Rühren bei Raumtemperatur' mit 6/9 wl Triäthylamin versetzt und noch l8 Stunden gerührt. Nach Verdünnen mit Essigester wird mit Kaliumcarbonatlösung Nitrophenol-frei gewaschen, mit 0,1-m. , Zitronensäure und Wasser ausgeschüttelt, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Aus Esslgester-Hexan kristallisiert das geschützte Dipeptid vom F. 78.-8O⁰. ■ : - '._--■

Rf =■ 0,^5 im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel im System Chloroform-Aceton (8:2).

30. Z-Lys(BOC)-Phe-NH-NH

27 g des obigen Dipeptidmethylesters werden in 135 ml warmem Methanol gelöst, bei Raumtemperatur mit 25 ml Hydrazin hydrat versetzt und l6. Stunden stehen gelassen. Das Kristall! sat viird mit 135 ml Wasser versetzt, abgenutscht und gut mit Wasser gewaschen. P. I73-I74⁰ nach Umkristallisieren aus Methanol-Wasser. Rf = 0,3 im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel im System Chloroform-Methanol-.(95:5)·

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31. Z-Lys{BOcVPhe-HIs-OMe

5,4 g Z-Lys (BOC)-PiIe-NH-NH₂ in .40 ml Dimethylformamid werden bei -ΐβ mit 6,8 ml 3,66-n. HCl in Dioxan und dann mit 1,5 ml t-Butylnitrit versetzt. Nach 10 Minuten bei -10° bis -15° werden 3,5 ml Triethylamin zugegeben. 3,64 g H-His-OMe, 2 HCl werden fest zugesetzt, anschliessend 4,2 ml Triäthylamin zugetropft. Man lässt innert 1 Stunde auf 0 erwärmen, wobei durch Zugabe von insgesamt 0,8 ml Triäthylamin ein pH von ca. 7 eingestellt wird. Nach Rühren über Nacht bei 0 wird in 250 ml V/asser gegossen und das schmierige Produkt durch Zerreiben mit Wasser, pulvrig gewonnen. Im Dünnschicht chrornatogramm an Silicagel in Chloroform-Methanol (9:1) ist Rf = 0,4. F'. 136-I37⁰ (aus Essigester).

32. H-Lys(BOC)-Phe-His-OMe·

. 6,8 g Z-Lys(BOC)-Phe-His-OMe in l40 ml Methanol werden in Gegenwart von 1 g lO^iger Pd-Kohle hydriert. Nach beendigter Hydrierung wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat zur Trockne eingedampft und der Rückstand sofort

ϊ■ . -i ■ . -

weiterverarbeitet. - ^{Λ? ;}

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1 9 A1S11

33· ^Asn-Lys(BOC)-Phe-His-ÖMe

"Der unter 32» erhaltene Tripeptide thylester (5,4 g) uM 4j 5 g 2-Asn-ΌΝΡ werden in 20 ml Dimethylformamid 20 Stunden bei'Raumtemperatur gerührt. Durch Zugabe von Aether-Eexan wird das Peptidderivat ausgefällt, abfii- , triert·' und mit Aether Nitrophenol frei gewaschen. Gereinigt wird durch Umfallen-aus DimethyIformamid-Aether.· Das Produkt ist dünnschichtchromatographiseh einheiclich;

3j97 g Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-OMe werden in 20 ml siedendem Methanol gelöst. Zu der noch etwa 30 warmen Lösung werden 2,5 ml Hydrazinhydrat zugesetzt und es'wird während 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen* _"■■ Durch Zugabe von Wasser wird das Peptidhydrazid ausgefallt, abfiltriert und mit Wasser Hydrazin frei gewaschen. Das Produkt wird aus DimethyIformamid-V/asser umgefällt,

35. 2-Thr(tBu)-Phe-Pro-0H " '· -

% % Z-Phe-Pro-OH werden in Methanol-Wasser (4:1) gelöst und in Gegenwart von Palladiumkohle (lO# Pd) -hydriert. Nach beendeter Wasserstoffaufnahme wird vom Katalysator abgenut.scht, das Piltrat zur Trockne eingedampft und der

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Rückstand (H-Phe-Pro-OH) getrocknet. Er wird mit 1,1 g N-Methylmorpholin und soviel Wasser versetzt, dass das Produkt eben in Lösung geht. Die Lösung wird mit Dimethylformamid soweit verdünnt, dass eine klare Lösung verbleibt, dann auf -5 gekühlt. Hierzu gibt man die Lösung des gemischten Anhydrides von Z-Thr(tBu)-GH, die wie folgt bereitet wird:
3,6 g Z-Thr(tBu)-OH werden in 40 ml absolutem Tetrahydro-

furan gelöst, 1,8 ml absolutes Triäthylamin zugegeben und die auf -10° gekühlte Lösung mit 1,7 g Chlorkohlensäure-isobutylester versetzt. Nach 5 Minuten bei -10 wird ungeachtet des ausgeschiedenen Triäthylaminhydrochlorids das gesamte Reaktionsgemisch zu der obigen Dipeptidlösung gegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde bei -5°' und l8 Stunden bei 5° belassen. Dann wird vom Ungelösten abfiltriert, das Eluat im Vakuum vom Tetrahydrofuran und im Hochvakuum vom Dimethylformamid befreit und der Rückstand mit Natriumbicarbonatlösung versetzt. Die unlöslichen Anteile werden durch Waschen .mit Aether entfernt, die wässrige Phase mit Essigester überschichtet und angesäuert. Das Tripeptidderivat wird mit Essigester ausgetragen und die Essigesterlösung mit Wasser neutral gewaschen. Nach. Trocknen über Natriumsulfat und Eindampfen wird Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-OH als farbloses harzartiges Produkt erhalten. Zur Reinigung wird es mehrmals aus Benzol-Petroläther umgefällt. __ 109810/2197

3β. Z-Ile-GIy-OMe " ' .·

2,23 g Z-Ile-OH-dicyclohexylammoniumsalz werden in "_ Essigester suspendiert und mit 0,2~m. Zitronensäure angesäuert. Die erhaltene Essigester-Lösung wird neutral gewaschen, getrocknet und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 15 ml Acetonitril gelöst, zu der Lösung werden 750 mg H-GIy-OMe, HCl zugegeben und bei 0 unter Rühren 0,84 ml Triethylamin. Nach 10 Minuten gibt man 1,24 g Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt über Nacht bei 0°. Die Fällung wird abfiltriert und das Filtrat wird zur Trockene eingedampft, der Rückstand in 30 ml Essigester aufgenommen und filtriert. Die Essigesterlösung wird mit Ö,2-m. Zitronensäure und gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen, getrocknet und im Vakuum auf etwa 10 ml eingeengt. Nach Zugabe von 25 ml Hexan kristallisiert das ._ geschützte. Dipeptid aus, F. 120-122°. Rf = 0,53 im System Chloroform-Methanol (95·5.) im Dünnschiehtchromatogramm auf Silicagel.

37. H-IJe-Gly-OMe · .

3,36 g Z-Ile-GIy-OMe werden in 100 ml Methanol und 10 ml 1-n. Salzsäure gelöst und in Gegenwart von 0,5 S Pd-Kohle .(10Jo) hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel vollständig verdampft. Der erhaltene Schaum ist im Dünnschiehtchromatogramm auf Silicagel ein-heltlichj Rf = 0,26 in Chloroform-Methanol (95;5.}.

109810/2197 . .

38. Z-A la -I le -GIy-OMe " " "' -

2,39·S des obigen Dipeptidester-hydrochiorids und 3,78 g Z-AIa-ONP in 40 ml Dimethylformamid werden unter Rühren mit 1,4 ml Triäthylamin versetzt und die entstandene Suspension wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Verdünnen mit Essigester wird mit verdünnter Käliumcarbonatlösung Nitrophenol-frei gewaschen, anschliessend noch mit 0,1-m. Zitronensäure und Wasser gewaschen. Ein Teil des-Tripeptidderivats bleibt während des Ausschütteins ungelöst, es wird abfiltri'ert. Die Essigesterlösung wird nach dem Trocknen vollständig eingedampft. Der Rückstand besteht ebenfalls aus reinem Produkt. P. 190-191°, Rf =0,5 im Dünnschichtchromatogramm auf Silicägel im System Chloroform-Methanol (95:5)· · ' · - "

39. H-AIa-Ile-GJy-OMe ·

2,0 g Z-Ala-Ile-Gly-OMe werden in h0 ml Methanol unter schwachem Erwärmen gelöst, dann in Gegenwart von ^0Q mg Pd-Kohle (10$) hydriert. Nach beendigter Hydrierung, wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat vollständig zur Trockene eingedampft. Der im Dünnschichtchromatogramm einheitliche Rückstand wird sofort weiterverarbeitet.

' ■ - . BAD ORIGINAU

109810/2197

40. Z-Thv (tBu)-AIa-Ile-GIy-OMe ■ . " " ' ' 1*36 g des obigen Tripeptidesters und 2₃β g Z-Thr(tBu)-ONP v/erden In 3 ml Dimethylformamid während 20 Stunden bei' Raumtemperatur gerührt. Das Tetrapeptidderivat wird durch Aether ausgefällt, abfiltriert und mit Aether Nitrophenpl-^ frei" gewaschen. Das Produkt wird durch Umfallen aus Dimethylformamid-A et her gereinigt.

41.' H-ThrCtBu)-Ala-Ile-Gly-OMe -

5,66 g der obigen Carbobenzoxyverbindung werden in . 50 ml Dimethylformamid und.in Gegenwart von 1 g Pd-Kohle (lOJo) hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators über* einer Schicht aus·2 g Norit wird'das Dimethylformamid Im J Hochvakuum bei 40° vollständig verdampft. Der amorphe Rückstand wird roh weiterverarbeitet.

h2, H-ThrCtBu)-AIa-lie-GIy-OH

4,3 g des Tetrapeptidmethylesters werden in 43 ml Methanol unter gelindem Erv/ärmen gelöst. Nach Abkühlen auf 20° werden 12 ml 1-n. Natronlauge zugegeben. Nach 5, 10 und 15 Minuten werden je 5 ml V/asser zugesetzt. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur werden 12 ml .1 N Salzsäure zugegeben, vom Methanol im "ν^μυΓη befreit und mit n-Butanol extrahiert. Die Butanol-Lösung wird !nit Wasser chloridfrei

109810/2197.

gewaschen, dann ohne zu trocknen im Vakuum zur Trockene verdampft. Der Rückstand wird ohne weitere Reinigung für die nächste Stufe eingesetzt.

kj>. Z-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH

Das oben erhaltene Tetrapeptidderivat (4,2 g) wird zusammen mit 4,8 g Z-GIn-ONP und 1,35 ml Triäthylamin in 30"ml Dimethylformamid 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Durch Zugabe von -Aether wird, das Produkt ausgefällt, dann abgenutscht und mit Aether Nitrophenol-frei gewaschen. Nach Lösen in wassergesättigtem n-Butanol wird bei 0 mit 1-n. Salzsäure ausgeschüttelt, darauf mit V/asser chloridfrei gewaschen und ohne zu trocknen im Vakuum bei 40° einge-.dampft. Durch nochmaliges Umfallen aus DimethyIformamid-Aether wird das Produkt rein erhalten. Nach Trocknen im Hochvakuum bei 40 über Phosphorpentoxid wird bei der potentiometrischen Titration mit 0,1 n.-NaOH in Methanol ein Aequivalentgewicht von 693 erhalten, berechnet 680.

.. H-Gln-Thr(tBu) -Ala-Ile-GIy-OH , HCl

3,Λθ g Z-GIn-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH werden in 70 ml", warmem Dimethylformamid gelöst. Nach Abkühlen auf Raum- .' . ■ temperatur gibt man 5 ml 1-n. Salzsäure und 500 mg Pd-KoIiIe zu und hydriert. Nach beendeter Hydrierung wird der

109810/2197 . / bad original

. . ■".■"■ 194151Ί ^:

■ _ 72 -

Katalysator über 1 g Norit abgenutscht und das Filtrat im Hochvakuum bei 40° auf etwa 10 ml eingeengt·. Diese Lösung wird in 100 ml Aether eingetropft, das ausgefallene Material abfiltriert und mit Aether gewaschen. Das im Hochvakuum bei Raumtemperatur getrocknete Produkt ergibt bei der . potentiometrischen Titration mit Q/l-n. Natronlauge in Methanol einen Gehalt von

45. Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH

2,8 g Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-OH und 0,77 ml abs. Triethylamin werden in 30^1 trockenem Tetrahydrofuran gelöst und die auf -10° gekühlte Lösung wird tropfenweise mit 700 mg' Isobutylchlorocarbonat versetzt, wobei darauf geachtet wird, dass die Temperatur -5° nicht übersteigt. Dann wird

10 Minuten bei -10° belassen und hierauf eine auf -20° vorgekühlte Lösung von 2,5 g H-GIn-Thr(tBu)-Alä*-Ile-GIy-OH, HCl in 65 ml Dimethylformamid-Wasser (9:1) zubegeben. Dann setzt man tropfenweise 1,2 ml Triäth'ylamin zu und belässt 1 Stunde bei -10° und l8 Stunden bei 0°. Hierauf wird im Vakuum urid dann im Hochvakuum bei 40° Badtemperatur auf ein Volumen von etwa 15 ml eingeengt und dann durch Zugabe von 100 ml eiskalter, 2$iger Essigsäure ausgefällt. Man nutscht ab, wäscht mit Eiswasser, trocknet und : fällt zur Reinigung zweimal aus Methanol-Wasser um, · Ausbeute 3,9 g Oktapeptidderivat,

1.0.-9 610/2-197

46. H-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH

3,6 g des unter 45) erhaltenen Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH werden in 100 ml 80#iger Essigsäure gelöst und die Lösung wird in Gegenwart von 0,5 g Palladiumkohle (10$ Pd) hydriert. Nach beendeter Wasserstoffaufnahme nutseht man vom Katalysator ab und dampft die Lösung zur Trockne ein. Das als farbloser Firn erhaltene essigsaure Salz des Oktapeptidderivats wird im
Hochvakuum getrocknet. ·

47. Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gin-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH · · -

1,60 g Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-hydrazid werden mit 25 ml Dimethylformamid· versetzt, •'hierauf wird auf -20°
gekühlt und dann werden 4 ml 2,5-n. wässrige Salzsäure zugegeben. Man rührt bei -20°, bis vollständige Lösung des Hydrazids eingetreten ist. Dann werden 2,0 ml 1,0-n. Natriumnitritlösung zugetropft, das Reaktionsgemisch wird auf
-10° erwärmt und 20 Minuten bei -10° belassen. Dann werden eine auf -10° gekühlte Lösung von 1,50 g H-Thr(tBu)-Phe-■pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH (essigsaures Salz) in 25 ml 80$igem Dimethylformamid und 1,11 g N-Methylmorpholin zugegeben. Das Reaktionsgemiseh wird l6 Stunden bei 0°

belassen. Hierauf wird im Hochvakuum auf ein Volumen von

' !Essigsäure

oa. 8 ml eingedampft und durch Zugabe von eiskalter,l^iger)ge-

109810/2197

.' '■ ■ - 74 - - ' - ·· fällt. Nach Abnutsehen und Trocknen im Vakuumexsikkator wird das Rohprodukt zur Reinigung zweimal aus Dimethylformamld-Essigester umgefällt. Die Ausbeute an geschütztem Dodekapeptid beträgt 2,1 g.

48. H-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-GIy-OH . .' · ·

1,85 S des obigen geschützten Dodekapeptids werden In 50 ml 90$iger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von Oi4 g Palladiumkohle (10$ Pd) wie üblich hydriert. Das nach Abnutsehen des Katalysators, Eindampfen der Lösung und Trocknen im Hochvakuum verbleibende essigsaure Salz von H-Asn-Lys (BOC) -Phe -His-Thr (tBu) -Phe -Pro-Gln-Thr (tBu) -AIa- Ile-Gly-OH. wird ohne weitere Reinigung weiterverarbeitet.

49. Z-Thr(tBu)-Tyr (tBu; )-Thr(tBu )-GIn-Asp(etBii)-Phe-Asn- Lys (BOC)-Phe-His-Thr (fcBu )-Phe-Pro-Gln-Thr (t3u) -AIa-He-GIy-OH , , .

2,30 s Z-Thr(tBu5-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(0tBu)-Phewerden In 35 ml Dimethylformamid gelöst und zu der

auf -20° gekühlten Lösung 3/5 ml 3-n. wässrige Salzsäure getropft-. Dann gibt man 2,7 ml 0,9-n. Natriumnitrit lösung zu und lässt das Reaktionsgemisch 20 Minuten bei -10° stehen. Hierauf werden die auf -10° gekühlte Lösung· von 1,72 g H-Äsn-Lys (BOC) -Phe-His-Thr (tBu) -Phe-Pro-Gln-Thr (tBu)-AXa-'

109 8 1Q/2197

Ile-Gly-OH (essigsaures Salz) in 30 ml 90^igem. Dimethylformamid und 1,0 g N-Methylmorpholin zugetropft. Man lässt die Mischung l8 Stunden bei Ό stehen, engt dann im Hochvakuum zur öligen Konsistenz ein und fällt das Produkt durch Zugabe von 100 ml eiskalter 2$iger Zitronensäure lösung aus'. Der Niederschlag wird gründlich zerrieben, abzentrifugiert, 4 mal mit kleinen Rationen Eiswasser nachgewaschen und im Vakuumexsikkator über Aetznatron getrocknet. Zur Reinigung wird mehrmals aus Dimethylformamid -Essigester umgefällt. ..

50. Z-Ala-Pro-NH₂

• " 2,28 g H-Pro-NH und 7,57 g Z-AIa-ONP werden in-20

ml Dimethylformamid gelöst und. die gelbe Lösung wird

■ * -■ 18 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann

wird im Hochvakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit Essigester versetzt und das entstehende Pulver gründlich zerrieben. Nach Abnutsehen und Trocknen werden 5,5 g Z-Ala-Pro-NH_p von F. 164 - 165° erhalten..

• ■ ■ " ·

51. Z-Gly-Ala-Pro-NH₂ ·

5,1 g des obigen Dipeptidderivats werden unter Erwärmen in 200 ml eines vorhydrierten t-Butanol-Wasser (9:1)-Gemisches gelöst. Die auf Raumtemperatur abgekühlte Lösung wird in Gegenwart von 1 g Palladium-Kohle (10$ Pd) '

109810/2197 ' - "·....

• . BAD ORlGlNAl

- ."■■·.. - 76 -■ -

hydriert. Nach' beendeter Hydrierung wird die Lösung sofort bei 30 Badtemperatur und 0,01 Torr, zur Trockne eingedampft, der Rückstand von H-Ala-Pro-NH in 300 ml auf. -20° gekühltem Dimethylformamid gelöst und dann die wie folgt bereitete Lösung des gemischten Anhydrids von Z-■ GIy-OH zugegeben: 3,7 g Z-GIy-OH und 2,'65 ml absolutes Triäthylamin v/erden in 25 ml absolutem Tetrahydrofuran gelöst und zu der auf -10 gekühlten Lösung 1,85 g Chlor-

" kohlensaureathylester unter Rühren und Kühlen derart zugetropft, dass die Temperatur -5 nicht übersteigt. Hierauf wird auf -10 gekühlt, 5 Minuten stehen gelassen und dann das Gemisch ungeachtet des ausgeschiedenen Triäthylamin-hydroehlorids zur obigen Lösung von H-Ala-Pro-NH_p gegeben. Nach"1 Stunde bei -10° und l8 Stunden bei 0° wird die .Lösung filtriert und das Filtrat im Vakuum und dann im Hochvakuum zur Trockne eingedampft. Dann wird ,

) mit 1 Liter Chloroform versetzt, von Triathylaminhydrochlorid abgenutscht, die Chloroformlösung 2 mal mit je 20 ml halbgesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das erhaltene Tripeptidderivat zeigt bei Dünnschichtchromatogiaphie auf Silicagel Rf =- 0-, 58 ■ (iiv Methanol)· . ' .;."■. .

* ^{& #} " BAD ORIGINAL

52. H-GIy-AIa-PrO-NH₂.'

3,8 g des unter 51· erhaltenen rohen Tripeptidderivates werden wie unter 51· beschrieben hydriert. Der nach Abnutschen des Katalysators und Eindampfen des Lösungsmittelgemisches verbleibende Rückstand zeigt bei Dünnschichtchromatagraphie auf Silicagel in Methanol Rf = 0,15, Ausbeute 2,2 g.

53.' Z-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂ ■ .

Das unter 52. erhaltene rohe Tripeptidamid wird.in "ml Dimethylformamid"gelöst. Zu der Lösung gibt man 4,1 g Z-Val-p-Nitrophenyl-ester, Nach l8 Stunden bei Raumtemperatur wird die gelbe Lösung zur Trockne verdampft, der Rückstand mit Essigester versetzt, zerrieben, abgenutscht, das gallertige Pulver in 2 Liter Chloroform gelöst, die Lösung 2 mal mit. je 20 ml ^%lgev Zitronensäure und 2 mal "mit halbgesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Dann wird die ChloroformlÖsung mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Eindampfrückstand wird unter Erwärmen mit ml Essigester versetzt und nach Stehen bei 0° das als festes Pulver ausgeschiedene Tetrapeptidderivat abgenutsoht, F. 205 - 210°, Rf-Wert auf Silicagelplatten = O₃Bo in Chloroform-Methanol (1:1);

• - 78 -

H-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂

1,1 g Z-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂ werden in 50. ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung v/ird in Gegenwart von 0,3 S Palladium-Kohle· (10$ Pd)- hydriert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme v/ird vom Katalysator abgenutscht,' die Losung eingedampft und der Rückstand im Hochvakuum bei 35° Badt.emperatur getrocknet. Dabei v/ird das Tetrapeptid H-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₀ als farblose Substanz erhalten, Rf-

i '·-■■ '

Wert = 0,20 (Silicagelplatten, System. Chloroform-Methanol = 1:1).

55. Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys-• ' (BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Txhr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHg

800 mg Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BCC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile- ) GIy-OH, 510 mg H-VaI-GIy-Ala-Pro-NH₂ und 120 mg N-Hydroxy-

SUGCinimid vierden in 9 ml Dimethylformamid unter Rühren bei ° gelöst und hierauf 120 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Das Reaktionsgernisch wird Lei 45° insgesamt 12 Stunden gerührt, wobei nach 3 und 7 Stunden jeweils noch je 20 mg Dicyclohexylcarbodiimid und 20 mg N-Hydroxysuccinimid Zugegeben werden. Dann wird in 200 ml Aether eingegossen und der feine Niederschlag abgenutscht. Zur Reinigung wird das Produkt einer Gegenstromverteilung im Systein Methanol-

Puffer-OhlOi'öform-Tetraijhlorkohlenstoff (10:3:5*$*

._n- ' . ■ , " 109810/2197 wie unter 18) unterworfen.

_₇₉-

56. H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Phe-Äsn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-AIa- _ He-GIy-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂

227 .mg des unter'55. erhaltenen geschützten Docosapeptidamide werden in 10 ml 90^iger Essigsäure gelöst und die Lösung wird in Gegenwart von 100· mg Palladiumkohle (10$ Pd) unter intensivem Rühren hydriert. Nach Beendigung der Wasserstoff-■ aufnahme wird- vom"Katalysator abfiltriert und das Piltrat zur Trockne eingedampft. Den Rückstand löst man in wassergesättigtem n-Butanol und schüttelt dreimal mit kleinen Portionen 5/&S^er Natriumcarbonatlösung und zweimal mit wenig Wasser aus. Dann dampft man die Butanol-Lösung ohne, sie.vorher zu trocknen im Hochvakuum bei 55° Badtemperatur ein und trocknet den Rückstand im Hochvakuum. Man erhält so 185 mg des decarbobenzoxylierten Docosapeptids a3.s farbloses Harz. .

57· BOC-Oys-Gly-Asn-Leu-SerCtBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-GIy-3?hr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Äsp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Bie-His -Thr (tBu) -Phe -Pro-Gln-Thr (tBu ) -Ala-Ile — Gly-Val -

- '-qay-Ala-Pro-NHo - . .

• " I81 rag BOG^
fcetMSly-OH, 28B mg

(tBii)-Ala-lle

E¹ CtB

CtSu)

itBu)3ys-Met- >-GIn-Asp-

GiSICOTTST

und 23 mg l~%droxy-

BAD ORlGINAi

succinimid v/erden in 2 ml absolutem Dimethylformamid tint er Erwärmen gelöst und nach Abkühlen auf Zimmertemperatur mit 31 mg Dicyclohexylcarbodiirnid-versetzt. Das Gläschen·wird sodann mit Stickstoff bespült,·zugeschlossen und während . 15 Stunden bei 45 stehen gelassen. Man filtriert den entstandenen kristallinen Dicyclohexylharnstoff ab, wäscht zweimal mit je 0,5 ml Dimethylformamid, engt das Filtrat im.Hochvakuum auf das halbe Volumen ein und fällt das Rohprodukt durch Zugabe von 20'ml Benzol und 120 ml Petrol-äther aus. Zur Reinigung wird es noch einmal aus Methanol-Benzol-Hexan umgefällt, abfiltriert und bei 45 bis sur Gewichtskonstanz getrocknet. Man erhält so das geschützte ,Dotriakontapeptidamid als amorphes Pulver, das bei der Dünnschichtchromatographie einen Hauptflecken und verschiedene Nebenprodukte aufweist. Es kann in diesem Zustand zur Abspaltung der Schutzgruppen eingesetzt werden*

BAD

109810/2197 -" .

- 81 Beispiel 2

H-Cys-GIy-A snJLeu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-G Iy-Thr-Tyr-Thr-Gin-' Asp -Fhe -A sn -Ly s -Phe -His -Thr -Phe -Pro -Gin -Thr -A la-He -GIy-Val-Gly-Ala-Pro-NH₂ (Calcitonin M)

23 mg BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu) -Tyr (tBu) -Thr (tBu) -Gln-Asp (OtBu) -Phe-Asn-Lys-(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-VaI-GIy-Ala-Pro-HHp werden bei 0° mit 0,6 ml konzentrierter Salzsäure Übergossen, das Gefäss wird mit Stickstoff gespült, verschlossen und bei 0 während 10 Minuten gerührt. Man kühlt dann auf ca. -60° ab, evakuiert im Hochvakuum und engt die Lösung unter -langsamem Steigern der Temperatur bis auf 0° zum Sirup ein. Fach Zugabe von 0,4 ml Wasser wird iyophilisiert* der Rückstand in 0,2 ml 0,1-n. Essigsäure gelöst und zur Umwandlung in das Acetat durch eine Säule (0 s= 6 mm} 1 = 100 mm) von schwach basischem Ionenaustauscher (z.B.Merek Nr.'.1I), der mit 0,1-n. Essigsäure äquilibrlert worden ist, filtriert. Das Eluat wird bis auf ein Volumen von 0,5 ml konzentriert, lyophilisiert, feel 4-0° Im Hochvakuum naehgetrocknei und schliesslioh diwuh Stehenlassen im offenen Gefäss mit der Luftfeuchtigkeit io.üilibrter-t. Mars erhält so das Acetat von Calcitonin M

' . 19A15 IT

■'.■".' - 82 -

als wasserlösliches^.Misses Pulver. ' . .'

Das als Ausgangsmaterial verwendet geschützte Dotriacontapeptidamid kann wie folgt hergestellt werden:

1. H-Gly-Asn-Leu-OMe

2,0 g Z-GIy-Asn-Leu-OMe (vom P. 150-159° nach Um-_T kristallisation aus Methanol-Wasser werden unter Erwärmen. in 20 ml Methanol gelöst und mit 200 mg Palladiumkohle .... (l0$ Pd) bis zur Beendigung der Wasser stoff auf nähme. ; . hydriert.. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtr.at bei 40 Badtemperatur· zur Trockene eingeengt, wobei der».... . Tripeptidmethylester direkt in kristalliner, reiner , -.-; Form (1,34 g; P. 138-139°) erhalten wird. Er kann nöt-igenfalls aus Methanol-Essigester-Petroläther umkristallisiert

werden. 'Rf-. = 0,22 (auf Sillcagel).

- 52 ■ .-.·■:

5,t g H-GIy-Asn-Leu-OMe, 9,2 g BOC-Gys(TRI) -OH und: 4,16 g M-Hydroxysuccinimid werden in 200 ml Dimethyl-formamid gelöst, auf 0° gekühlt und unter Rühren mit 5*5?· g Dicyclohexylcarbodiimid in fester Form versetzt. rührt äoch während 1 Stunde bei 0°, lässt dann über Mi ca. 20° stehen, engt im Hochvakuum auf ein

BAD ORIGINAL

1 9 Ä1 5 1"

. - 83 -

von ca. 100 ml ein und filtriert den ausgeschiedenen Dieyelohexylharnstoff ab.. Das Filtrat wird sodann in Hochvakuum bis zur Bildung einer klebrigen blasse weiter eingeengt, in 200 ml n-Butanol gelöst und nacheinander mit Wasser, 5$iger Weinsaurelösung ,1-n. Natriumbicarbonat, und wiederum mit Wasser gewaschen. Die Lösung wird nun auf ein Volumen von ca. 50 ml konzentriert, und daraus das Tetrapeptid-derivat durch Zugabe von 300 ml Petroläther ausgefällt. Man reinigt durch Umfallen aus Dimethylformamid-Wasser und aus Methanol-Essigester-Petroläther und erhält so das Tefcrapeptidderivät als amorphes Pulver vom Schmelzpunkt 145-1^8 · Es weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel die folgenden !„-Vierte auf:

Rf 115 = 0,68; Rf (Aceton) = 0,59; Rf (Chloroform-Methanol 8:2) = 0,60«

3. BOC-CyS-(TRI)-GIy-A-Sn-LeU-NHNH

2,7 g BOC-Cys(TRl)-Gly-Asn-Leu-OMe werden in 22 ml Methanol gelöst, auf 0° gekühlt und mit 2,2 ml Hydrazinhydrat versetzt. Nach ca. 30 Minuten bei 0° lässt man die Lösung über Nacht bei ca. 20° stehen, kühlt wieder auf 0 ab vind versetzt dann mit 102 ml 3#iger eiskalter Essigsäure. Die Fällung wird gut homogenisiert, abfiltriert und auf der Nutsche mit eiskalter, 3$iger -Essigsäure bis zur Folin-negativen Reaktion der Waschflüssigkeit gewaschen

109810/2187

und anschliessend getrocknet. Man erhält 2,2 gchromatographisch reines Tetrapeptid-hydrazid vom Zersetzungspünkt ca. 195°. Es weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel folgende K" -Werte auf: Rf (Chloroform-Methanol 8:2) = 0,30; Rf'(Aceton-Methanol 9':lj = 0,53·

4. BOC-Met-Leu-GIy-OMe

6,72 g Z-Leu-Gly-ÖMe werden in 50 ml Methanol mit 500 mg Palladiumkohle (l0# Pd) bis zur Beendigung der Wasserstoff auf nähme hydriert. Die Lösung wird vom Katalysator abfiltriert und im Vakuum auf ca. 10 ml eingeengt, mit 3° ml Dimethylformamid verdünnt und im Hochvakuum nochmals auf ca. 20 ml konzentriert. Dazu gibt man unter Eiskühlung 7,7 g BOC-Met-OCP, lasst die klare Lösung^während 6,Stunden' bei 20 stehen und verdampft das Lösungsmittel im Hoch- . vakuum. Der ölige Rückstand wird in Essigester gelöst und nacheinander bei 0° mit 5$iger Pottaschelösung, 0,2-n. Salzsäure und schliesslich mit Wasser gewaschen* die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingeengt. Der ölige Rückstand wird aus Benzol-Petroläther kristallisiert; P. 126-127°; auf Silicagel ist Rf 43 C =0,66; Rf (Toluol-Aeeton IM)' = O/58.

1098 10/2197

5· H-Met-Leu-Gly-OMe, Hydrochlörid ' ' '

"3,24 g BOC-Met-L'eu-GIy-OMe worden'in 13 ml 3,8-n-Chlorwasserstbff in Essigester gelöst Und während 30 Minuten bei 20 stehen gelassen. Durch Zugabe von 100 ml Petrolättier ■ wird das Tripeptidesterhydrochlorid als klebrige Masse ausgefällt und die überstehende Lösung abdekantiert. Durch Zerreiben mit 100 ml peroxidfreiem Aether bei 0° wird ein feinpulveriges Produkt erhalten, das abfiltriert und über Kaliumhydroxid bei Zimmertemperatur im Exsikkator bis zur Gewichtäconstanz getrocknet wird. Die Verbindung ist chromatographisch rein, jedoch amorph und stark hygroskopisch, Sie weist auf Silicagel die folgenden Rf-Werte auf: Rf43G = 0,48; Rf (Toluol-Aceton l:l) =0,35.

6. TRI-Cys(TRI) -Met.-Leu-Gly-OMe ■ .

3,22 g TRI-Cys(TRI)-OH, 1,97 g H-Met-Leu-Gly-OMe-Hydrochlorid undO,t4 ml Triäthylamin werden in 32 ml Acetonitril gelöst und 1,54 g Dicyclohexylcarbodiimid wird in fester Form zugegeben» Die vorerst klare Lösung, aus der sich Dicyolohexyiharnstoff ausscheidet, wird während 16 Stunden bei 20^a stehen gelassen. Man kühlt alsdann auf 0 ₉ gibt 100 all Wasser zu, homogenisiert und filtriert die weiss© Fs-Xitmg ab«. Sie wird mit Masser gewaschen, getrocknet

m. f/ährsnd 5 Minuten bei 40° mit 50 ml Essigestes*

BAD

<Ρδ- ß pi «8 fs / O1 fi η '

fein zerrieben. Der',unlösliche,DicyGlohexylharnstoff ,■-... wird bei Zimmertemperatür: abfi 1 tri§rt;und.mit, 20 ml Essig-, „, ester gewaschen. Aus dem Piltrat wird das Tetrapeptide . ^ _v. _; derivat durch. Zugäbe von, 3OQ; ml. Petroläther als gallertiger,... ., Niederschlag ausgefällt^., abfil.triert und getrocknet.. Beim- _:,. . y Umfallen dieses Rohproduktes .aus" Methan_iol-Essi,ges.ter-Pet.rplr,,..,,. äther erhält man ein chromatographisch einheitliches, Produkt ,. vom P. ca.. 215°·. ,Auf Silicage.1.weist, es folgende Rf -Wjerte. auf; - im System: CHCl^-Metha-nol· .(97OJ- Rf= .0.,57I- , _: . ■ ...: in n-Butylacetat Rf = 0^51/ . . . _.

7. "■ - H-Cys(TP:3)-Met-Leu-Gly-0Me, Acetat ' ' ' ^: ~ ··■_---■·■■---„-j----■.

Zu einer Lösung.von 1,862 g TRI-Cys (TRl)-Met-Leü-Gly- "" OMe in 16 ml Eisessig werden k ml Wasser so zugetropft ₃ dass sich der gebildete Niederschlag jeweils wieder löst. Die klare Lösung wird eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt und. dann bei O mit 12 ml Wasser versetzt, filtriert und der Niederschlag mit kalter 50$iger Essigsäure gewaschen* Das Piltrat wird am Hochvakuum bei JO zu einem OeI eingedampft , dieses mit Wasser verrieben und lyophilisiert. Das erhaltene weisse Pulver wird 15 Stunden über Kaliumhydroxid am Hochvakuum getrocknet. Das Produkt erweist sich im Dünnschichtchromatogramm an Silieagel als einheitlich« la Toluol-Aceton (7;:3).Rf = 0,28, in Chloroform-Methanol (95-5)

\rüf . Sf ^: ■ " ^BAD

8. DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRl)-Met-Leu-GIy-OMe

2,284 gDPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-NH-NH₂ (vgl, Beispiel 1, sub 13) in 15 ml Dimethylformamid werden bei -20° mit 6,5 ml Ij53-n. Chlorwasserstoff in Essigester und 0,51 ml t-Butylnitrit versetzt und 15 Minuten bei -10 gerührt. Nach Zugabe von 1,4 ml Triäthylamin wird die auf -10° gekühlte Lösung von Γ,4θ6 g H-Cys(TRl)-Met-Leu-Gly-OMe-Acetat in 10 ml Dimethylformamid zugetropft. Das pH der Reaktionslösung beträgt dann ^5· Durch Zugabe von 2 Tropfen Triäthylamin in Dimethylformamid [2,8 ml Triäthylamin mit Dimethylformamid auf 10 ml aufgefüllt] wird das pH 7-8 eingestellt. Nach 5, 10 und 20 Minuten wird mit je 2 Tropfen Triäthylaiminlösung das pH wieder auf 7-8 erhöht. Nachher bleibt dieser Wert konstant. Die Reaktionslösung wird eine Stunde bei -10° und 15 Stunden bei 0° gehalten. Dann wird vom ausgeschiedenen Triäthylaminhydrochlorid abfiltriert und das Filtrat bei" 30⁰ am Hochvakuum zu einem OeI eingedampft. Durch Zerreiben mit Wasser erhält man ein Pulver, das mit Wasser gewaschen und dann mit Wasser zerrieben und lyophilisiert wird. Durch zweimaliges Zerreiben mit 10 ml Benzöl-Petroläther (l:2) wird das Hexapeptidderivat rein erhalten. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Toluol-Äceton (7:3) ist Rf = 0,42. .

109Ö10/2197

8a. DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRl)-OH

5,7 g DPC-Ser (tBu)-Thr (tBu)-NH-NiI₂ in 50 ml Dimethylformamid werden bei -15° mit ΐβ,35 ml 1,53-n. Chlorwasserstoff in Essigester und 1,4 ml t-Butylnitrit versetzt und

, 15 Minufen bei -10° stehen gelassen. Nach Zugabe von 3*5 ml Triäthylamin wird eine auf -10 gekühlte'Lösung von 3/63 S H-Cys( TRu)-OH und 1,4 "ml Triäthylamin in 4θ ml Dimethylformamid und ·1β ml Wasser zugetropft, eine Stunde bei -10 ger,ührt und 15 Stunden bei O gehalten. Die kläre Lösung v/ird bei 40 am Hochvakuum eingedampft, der Rückstand in Essigester und Wasser aufgenommen und die organische Phase . mit zu 50$ gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Das nach Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene OeI wird in wenig

k Essigester gelöst und in 3OO ml Petroläther (bei 0 gerührt) getropft. Das Produkt fällt als leicht gelbliches Pulver aus. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System Chloroform-Methanol (7=3) ist Rf = 0,62. .

1098 1 Q/2 19 7

8b. H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-OH

909 mg DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRl)-OH werden in 10 ml Methylenchlorid gelöst, mit 12 ml Monochloressigsäure in Wasser [aus 75 g Chloressigsäure und 25 ml Wasser] versetzt und bei Raumtemperatur 15 Minuten gerührt. Die Lösung wird dann auf 0° gekühlt, mit 50 ml Wasser versetzt und mit konz. Ammoniak auf pH 6,5 gebracht. Dabei fällt das Produkt als OeI aus. Dieses wird noch zweimal mit

Wasser zerrieben, dann iri t-Butanol aufgenommen und lyophilisiert. Zerreiben des Lyophilisats mit Petroläther liefert ein einheitliches Produkt. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Chloroform-Methanol (l:l) ist Rf = 0,40; in Methanol Rf= 0,50. .

BAD ORIGINAL

9. H-Ser(tBu) -Thr(tBu) -Cys (TRl) -Met-Leu-Gly-OMe - . . .

2 g DPC-Ser(tBu) -Thr (tBu) -Cys(TRI) -Met-Leu-GIy-QMe werden bei 45° in 40 ml SO^igem Eisessig gelöst und an- ... sshliessend während 1 Stunde bei 45° stehen gelassen. Man engt sodann im Vakuum auf ein Volumen von ca. 10, ml ein und lyophilisiert. Der Rückstand wird zur vollständigen Entfernung von Essigsäure in 15 mltert. Butanol Und 1,5 ml Wasser gelöst und nochmals lyophilisiert. Man erhält einen pulverigen Rückstand, der in 5 ml Methanol und 20 ml Essigester gelöst und durch Zugabe von 150 ml Petroläther wieder gefällt wird. Nach kurzem Stehenlassen bei 0 wird abfiltriert, mit Petroläther gewaschen und getrocknet. Man erhält ein amorphes Pulver vom P. l8o, das nur noch Spuren von 2-(p-Biphenylyl)-propanol(-2) als einzige Verunreinigung enthält. Das Hexapeptid wird in dieser Form zur Weiterverarbeitung verwendet. Es weist im Dünnschicht-chromatogramm auf Silicagel die folgenden R_f-Werte auf: in Chloroform-Aceton (l:l) R.f = 0,48 j in Chloroform-Methanol (9:l) Rf = 0^4 j in Toluol-Aceton (l:l) Rf =0,49·

10/21"9f

10. H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRl)-Met-Leu-Gly-OH

1,4 g Hexapeptid -methylester von 9) werden bei in 16 ml 9ö$agem Methanol gelöst, auf 20 abgekühlt (wobei das Peptid teilweise wieder ausfällt) und mit 4,32 ml 1-n. Natronlauge versetzt. Man rührt die Suspension während 25 Minuten bei 22° (nach ca. 15 Minuten ist alles klar gelöst) und fällt dann das Hexapeptid durch Zugabe von ■ 4,32 ml 1-n. Salzsäure und 3° ml Wasser als feinflockigen Niederschlag aus. Man lässt noch während I5 Minuten bei 0 stehen, filtriert, und wäscht mit Wasser, bis das Filtrat frei von Chloridionen ist. Nach Trocknen über Kaliumhydroxid und Phosphorpentoxid erhält man 1,3 g Rohprodukt, das zur Reinigung während 5 Minuten bei 80 mit einer Mischung von 25 ml Dimethylformamid und 60 ml Benzol homogenisiert und durch Zugabe von 120 ml Petroläther gefällt wird. Nach 10 minütigem Stehenlassen bei 0 wird abfiltriert, mit Benzol und Petroläther gewaschen und getrocknet. Das so erhaltene, chromatographisch reine Hexapeptidderivat weist einen Zersetzungspunkt von ca. 210 auf und ist in vielen Lösungsmitteln sehr schwer löslich. Bei der DünnschichtChromatographie auf Silicagel ist ff 45 = 0,39 ,

R£52 = 0,77 ,

RfIOO = 0,47. .

109810/2197

BAD ORIGINAL

- 92 - "■·'■■ -

11. BOC-Cys(TRI) -Gly-Asn-Leu-Ser (tBu)-Thr (tBu)-Cys(TRl) -

Met-Leu-GIy-OH

1,04' g BOC-CyS(TRI)-GIy-ASn-LeU-NH-NH₂ werden in 8 ml absolutem Dimethylformamid gelöst, auf -25 gekühlt und dazu langsam 0,92 ml 3,6-n. Salzsäure in Dioxan zugetropft, dann 0,179'ml tert. Butylnitrit. Diese Mischung wird während 15 Minuten bei-10 gerührt, auf -15 abgekühlt und in eine auf -15° gekühlte· Lösung von 878 mg H-Ser-(tBu)-Tfcr(t.Bu)-Cys(TRI)-Met-Leu-GIy-OH und 0,588 ml Triäthylamin in 12-ml . · absolutem Dimethylformamid hinein pipettiert. Man rührt während ca. 10 Minuten bei -10° und während 3 Stunden bei 0°. Zur Aufrechterhaltung einer schwach basischen Reaktion (pH ca. 8) gibt man anfänglich noch 2 Mal je 0,065 ml Triäthylamin zu. Die Mischung wird während 15 Stunden bei 0 stehen gelassen und dann im Hochvakuum bis zur breiartigen Konsistenz eingeengt. Durch Zugabe von 50 *nl Methanol wird das Decapeptidderivat ausgefällt. Man erwärmt die Suspension 5 Minuten auf 40°, lässt 10 Minuten bei stehen, filtriert ab und wäscht den Niederschlag mit 20 ml Methanol. Man erhält beim Trocknen im Hochvakuum über Kali'umhydroxid und Phosphorpentoxid reines Decapeptidderivat von unscharfem Zersetzungspunkt bei ca. 220-230. Es weist im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel die folgenden Rf-Werte auf:

109810/2197 _{ßAD nD}

^BAD ORIGINAL

im System Chloroform-Metb anol (t:.2) Rf ^ 0,28;

^{!! !5} 70 Rf = 0,55;

¹¹ " 10^ Rf = 0,75 ϊ

" " 121 A . Rf'= 0,59.

12. BOC-Cys-GIy-Asn-Leü-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-GIy-OH

1,7 g BOC-Cys(TRl)-GIy-Asn-Leu-SerCtBu)-ThrCtBuJ-CysCTRI) Met-Leu-GIy-OH werden in I70 ml heissem Dimethylformamid gelöst und nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur im Verlauf von 1 Stunde zu einer intensiv gerührten Lösung von 2,5 g Jod in 500 ml Methanol getropft. Anschliessend rührt man noch eine weitere Stunde und entfärbt dann die auf 0 gekühlte Lösung'mit 1-n, Natriumthiosulfat fast vollständig. Nach Einengen der Lösung im Vakuum, zuletzt im Hochvakuum bei 40°, auf ca. 100 ml fällt man mit Aether vollständig aus _s wobei das ausfallende OeI rasch erstarrt · Nach Abgiessen der Aetherlösung wird der Rückstand kurz im Vakuum getrocknet und dann mit Wasser zerrieben. Das ausgefallene Dekapeptidderivat wi-rd abgenutscht, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Zur Reinigung wird in 25 ml Chloroform gelöst, wenig unlösliches Material abfiltriert, das Filtrat auf etwa die Hälfte eingeengt und mit Hexan ausgefällt» Man erhält das reine Dekapeptidderivat, das im D-üimschichtchroRiatogramm auf Silioagel Tf,IQQ - 0,48 zeigt.

1©eS10/218f

■ - 94 13. Z-Asp(OtBu)-Phe-OCH

30,3 g Z-ASp(OtBu)-ONF und l8,3 g H-Phe-OCH /HCl werden zusammen in 15O ml Dimethylformamid gelöst, und zu der klaren Lösung 11,8 ml Triäthylamin zugetropft. Die entstandene Suspension wird 20 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt, wobei sie sich tiefgelb färbt. Ahschliessend wird im Vakuum auf etwa 100 ml eingeengt und in 1 Liter Essigester/Chloroform (4:l) dreimal mit ■ 5$>iger Zitronensäure, 19 mal* mit ca. 2-n. Natriumcarbonat und mit gesättigter Kochsalzlösung bis zur neutralen Reaktion ausgeschüttelt. Das Rohprodukt, ein gelbes OeI, wird in Aether mit Aktivkohle, behandelt und nach Animpfen aus 65O ml A-ether/Hexan (l:l) im Kühlschrank kristallisiert. Es bilden sich farblose Nadeln vom P. 74,5 -76,5°. Ira Dünnsehiehtchromatogramm an Silieagei ist der R_f-Wert , ' im System Chloroform-Methanol (95:5)= 0,74-, in Chloroform-' ^: Aceton (75;25) =0,65» '

14-. H-Äsp(tBu)-Piie-OCH

48,6 g Z-Asp|)tEu)-Phe-OCH, werden in 7OO ml Methanol , nach Zusatz von 33*5 ml 3-n. Chlorwasserstoff in Dioxan und 5. g lO^igem Palladiumkatalysator auf Kohle in der .- . 'Schüttelente bei Raumtemperatur decarbobenzoxyliert. Nach Beendigung- der Wasserstoffaufnähme wird'filtriert und ' ■ eingeösBipft» Man erhält 38,7 g eines weissen Schaums=, " . _-■' :

OR/GlNAf.

Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel in Chloroform-Methanol (9:1) ist F{f = 0,60; in Chloroform-Aceton (l:l) ist Rf = 0,58; Rf„_Op_E =0,42 .Das Produkt wird ohne weitere Reinigung zur nachfolgenden Kondensation eingesetzt.

15. Z-GIn-Asp(OtBu)-Phe-OCH

38,6 g des erhaltenen H-Asp(OtBu)-Phe-OCH , HCl werden mit 42,0 g Z-GIn-ONP in I70 ml Dimethylformamid.zu einer klaren, leicht gelben Lösung gelöst und unter Rühren mit-13,9 ml Triäthylamin langsam versetzt. Es entsteht eine orange Suspension, die 24 Stunden bei 30-35 Badtemperatur gerührt wird. Während dieser Zeit gibt man weitere 40 ml Dimethylformamid und ausserdem noch 1,39 ml Triäthylamin zu.

Zur Aufarbeitung wird der Ansatz in 4 Litern Chloroform gelöst und in einer 20-stufigen Gegenstromverteilapparatur (Phasenvolumen: untere Phase 400 ml, obere Phase 200 ml pro Gefäss) nacheinander mit 1 Liter 5$iger Zitronensäurelösung, 400 ml gesättigter Kochsalzlösung, 6 Liter ca. 2-n. Soda und 2,8 Liter gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach dem Trocknen und Eindampfen kristallisiert das Tripeptidderivat aus 1,8 1 Aethanol im Kühlschrank ^ langsam aus. Man erhält Z-Gln-Asp (OtBu)-Phe-OCH, vom

» p. 186-188⁰.*

Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende ^ Rf-Werte erhalten:

% in Chloroform-Methanol (9:1): Rf- 0,39; in Chloroform-Aceton (1:1): Hf = 0,24; Rf 102E- 0,69, Rf.89 = 0,46, Rf43A = 0,65 ^⁰ = -28° ± 1° (c = 1,35b' in Dimethylformamid).

BAO OBIQINAL

l6. H-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OCH -

7,55 g Z-GIn-Asp(OtBu)-Phe-OCH werden in 400 ml Methanol gelöst, mit 4,1 ml J>-n. Chlorwasserstoff in Dioxan versetzt und in Gegenwart von 2 g Palladium-kohle (lO$ Pd) hydriert. Nach Abnutsehen des Katalysators und Eindampfen erhält man H-G In-Asp (OtBu)-Phe-OCH , HCl als farblosen Schaum. Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden " folgende Rf-Werte erhalten: in Chloroform-Methanol (9:l); Rf = Oy13; in Chloroform-Aceton (25:75) Rf = Q,l4;

17·. Z-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Phe-OCH

Die gesamte Menge des Hydrochloride von ΐβ) wird zusammen mit 7,4 g Z-Thr(tBu) -OSU in l4 ml Dimethylformamid bei Zimmertemperatur gelöst, und zu dieser Lösung werden unter Kühlung im .Eisbad 1,72 ml Triäthylamin getropft. Anschliessend wird die. bräunliche Suspension 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach üblicher Aufarbeitung in viel Essigester (je dreimaliges Waschen mit ^%±ger Zitronensäure und ca. 2-n. Natriumcarbonat, Neutralwaschen mit gesättigter Kochsalzlösung, Trocknen über Natrium- ■ sulfat und Eindampfen im Vakuum bei 30-40°) wird das Rohprodukt in Aethanol mit Aktivkohle behandelt und aus 90 ml Aethanol im Kühlschrank kristallisiert. F. 155-I6I⁰.

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Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werts gefunden: in Chloroform-Methanol (9·'ΐ): Rf = 0,52; in Cyelohexan-Aceton (3:7): Rf= 0,48; Rfg = 0,48, Rf_121A-= 0,76.

^° = Λ⁰ -f 0,5° (c = 2_syfo in Dimethylformamid).

H-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OGH

478 mg Z-ThrCtBu)-GIn-ASp(OtBu)-Phe-OCH werden in 150 ml Methanol mit 100 mg Palladiurakohle (lO^ig) bei Raumtemperatur neutral hydriert. Man erhält 395 mg eines farblosen Schaums von H-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Phe-OCH ^ übt ohne weitere Reinigung für die folgende Kondensation verwendet wird. ,. . -

Im Düanschichtchroraatosramra an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten? ' " .■-".

in Chloroform-Methanol (lsl)s Rf = 0,75-5. _ iii ChloLOform-Methginol (9sl)i Rf = 0_Ä17S in Aceton Rf = O.185 Rf,,™ = 0,23;"Rfq_rt = 0,12* ·

Z-TyrCtBu)-TIir(tBu)-GIn-A sp(OtBu)-Phe-OCH.

687 mg Z-TyrftBu)»OH -Dicyelöhexylammoniumsalz werden in Chloroform iaifc wässeriger Zitronensäure, ausgeschüttelt;. iffisa die erhaltene freie Säure, ein klares"OeI, wird in 6.5 ^X !E^;sfcraliy:ipofuran mit O_s139-⁶^ H-Me thylinorpholin. versetzt. E-3I =22"" gibt man O₅IfQ mi ChloraüriSissiisäure-isobutylesfcer ΐ·,5 «n<ä r-UhPfe-ein© aalbm - Sfcuiide bei, -2S bis -10°. Dann ·

f 5 9 8 1 θ / 2 1 S f - ' ■ ■■ ©AD ORIGINAL

■ -98 - -

lässt man-'das oben beschriebene H-Thr(tBu) -Gln-Asp(OtBti) ■Phe-OCEL· in 15 ml Tetrahydrofuran gelöst und vorgekühlt zutropfen und spült mit 5 ml desselben Lösungsmittels.. ; Nach ^-/2 Stunde bei -10 rührt man noch 15 Stunden bei Raumtemperatur. Nachher wird am Vakuum eingeengt und in . Essigester wie üblich aufgearbeitet (vgl,.17)· Das Rohprodukt wird in 15 ml Essigester gelöst, mit 40- ml Aether gefällt und anschliessend aus Methanol im Kühlschrank kristallisiert. Kurze, dicke Nadeln, die beim Trocknen . am Hochvakuum bei 50 verwittern. P. 169-173 ° · Ira.DünnschichtchromatOgramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhaltene in Chloroform-Methanol (9:'l) Rf = 0,Λ6| in ehloroform-Methanol (lsi) Rf = 0,95i in Chloroform-Aceton, ;(ΐ:ΐ)>■ « O₁Wi Rf₈₉ - 0,61;- Rf_Acetm ' « 0,6B. Bf₁₀₂₃₃- -_:Ο_>73_: [elf¹ '«"-54° + 0,5° Cc ="2,0^ In Dimethylfoi-raSrti

20 ο _: ■. ;H-fyr CtBu) -Thr (tBu) -GIn -A sp (OtBu)- -Phe-OCH,

' 2,36 g Z-Tyr CtBu) -Thr (tBu) -Gln-Asp(OtBu) -₃ werden in 450 ml Methanol mit 5OÖ mg lO^iger Palladium- -; Icolile wie üblich bei Zimmertemperatur hydriert.; Mari erhält: einen- farblosen" Schaum _? der dünnschicht ehr oma feagraphis^ch ■ ei-nhei-tlich Ist- und als solcher weiterverwendet;-wird.. lii BünBSGhiciifcchPOma-tograram an-Sill.cagel werden· folgende-Bf-Herte erhaltens in Chloroform-Methanol"(95-5)

^BAD ORIGINAL

- 99 -21. Z-Thr(tBu)-Tyr (tBu) -Thr (tBu) -Gin-Asp(OtBu) -Phe-OCH

Das Produkt von 20) wird-zusammen mit 1,48 g Z-Thr(tBu)-OSU in 3 ml Dimethylformamid gelöst und 21 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Verdünnen der Reaktionslösung mit viel Essigester wird wie üblich aufgearbeitet (vgl.17)· Das Rohprodukt wird in 30 ml Essigester-Methanol (9^;l) warm gelöst und nach Kühlen im Eisbad mit 80 ml Aether gefällt. Man erhält das Produkt als farbloses, amorphes Pulver vom F. l46-l48 . Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte erhalten: in Chloroform-Methanol (9:1): Rf = 0,55;-in Chloroform-Aceton (l:l): Rf = 0,60; ^Rfttn ⁼ °-»^3 [aJrw = + 6 + 0,5° (c = 2,0 in Dimethylformamid)

22. Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(0tBu)-Phe-NH-NH₂

1,91 g Z-Thr (tBu)-Tyr (tBu) .Thr (tBu)-GIn-Asp(OtBu)-Phe-OCH, werden in 80 ml Methanol gelöst und mit 8 ml Hydrazinhydrat vermischt. Nach 22 Stunden Stehenlassen bei Zimmertemperatur wird das ausgefallene Produkt isoliert und am Hochvakuum bei 60 getrocknet. Man-erhält das mikrokristalline Hydrazid vom F. 226-229° (Zersetzung). Im Dünnschichtehromatogramm an Silicagel werden folgende Rf-Werte gefunden: In Chloroform-Methanol (9:l) Rf = 0,32; in Cyclohexan-Aeeton (>:7) Rf = 0,23; ^Ri>Rq ⁼ °>3^' [a]p° = + 4° + 1° (c = 1,0" in Dimethylformamid).

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BAD ORIGINAL

23v Z-Asn-LyS-(BOC) -Phe-His-OMe -

5,4 g H-Lys(BOC)-Phe-His-OMe (vgl. Beispiel l) und 4,5 g Z-Asn-ONP werden in 20 ml DimethyLforamid 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Durch Zugabe von Essigester wird das Peptidderivat ausgefällt, abfiltriert und mit Aether gewaschen. Nach Umkristallisieren aus Methanol schmilzt das Produkt bei 182-I83 . Im Dünnschichtchromatogramm ist Rf₁₀₀ = 0,57 (an Silicagel). ^°° (c = 1 in Dimethylformamid). ■

24. Z-A sn-Lys (BOC)-Phe-His-NH-

3*97 S Z-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-OMe werden in 8 ml warmem Dimethylformamid und 12 ml Methanol gelöst. Zu der noch etwa J>0 warmen Lösung werden 2,5 ml Hydrazinhydrat zugesetzt und es wird während 20 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Durch Zugabe von Wasser wird das Peptidhydrazid ausgefällt, abfiltriert und mit Wasser ■ Hydrazin-frei gewaschen. Das Produkt wird aus Aethanol umkriställisiert, P. = 200-201 . Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf^-,„ =0,5·

25. H-Phe-Prq^QH

Z-Phe-Pro-OH wird durch katalytische Reduktion (Pd-Kohle) in Methanol-Wasser (4:1) in das freie Dipeptid übergeführt. Dieses wird nach Einengen der vom Katalysatoin befreiten Hydrierlösung auf ein kleines Volumen durch Zugabe

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von Aceton kristallisiert erhalten, und zwar als Dipeptid-Monohydrat vom P, 125-128.

26. Z-Thr (tBu).-Phe-Fr QrOH

20,2 g Z-Thr(tBu)-OSU, 13,3 g H-Phe-Pro-OH (Monohydrat) und 6,54 ml Triäthylamin werden in 80 ml Dimethylformamid gelöst, über Nacht bei ca. 20 stehen gelassen und dann im Hochvakuum bis zur Bildung einer klebrigen Masse konzentriert. Diese wird in 500 ml Essigester gelöst und fünfmal mit je 100 ml 5$iger Weinsäurelösung und anschliessend bis zur Neutralität mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird zur Trockene eingeengt und der' zurückbleibende feste Schaum pulverisiert, und im Hochvakuum bei 4.0 getrocknet. Durch zweimaliges Umfallen aus Essigester-Petroläther erhält man 13,3 g amorphes, chromatographisch reines Tripeptidderivat mit unscharfem Schmelzbereich bei ca. 75-85°. Im Dünnschi ehtehromatogramm .-auf Silicagel ist Rf₁₁-C = 0,68;

27. Z-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OMe

1,36 g H-Ala-Iie-Giy-OMe (vgl. Beispiel l) und 2,£ g Z-Thr(tBu)-OSU werden in 3 ml Dimethylformamid während 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Tetrapeptldderivat wird durch Aether ausgefällt, abfiltriert und mit Aether gewaschen. Nach Umkristallisieren aus Aethanol ist

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F. = 229-230^P* ία]^° = -43° (c = 1 in Methanol). Rf =0,55 im System Chloroform-Methanol- (95*5) an Silieagel* ,-_: _

28. H-ThrCtBu)-AIa-IIe-GIy-OMe

5>66 g der obigen Carbobenzpxyverbindung werden in 400 ml Warmem Methanol gelöst und in Gegenwart von Ig Pd-Kohle (10$) hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Methanol im Vakuum bei 40° verdampft. Der feste Rückstand wird sofort weiterverarbeiten Rf = 0,2 im System Chloroform-Methanol (95*5) an "Silieagel.-..'

29- H-Thr CtBü).-Alä-Ile-Gly-OH; ; ■ --

4>3 g des Tetrapeptidmethylesters werden in■ 43 ml ^r Methanol unter gelindem Erwärmen gelöst. Nach Abkühlen · auf 20° werden 12 ml 1-n. Natronlauge äügegeberi. Nach 5 Minuten werden 20 ml Wasser und nach weiteren 10 Minuteii 12 ml 1-h. Salzsäure und 20 ml Methanol zugegeben. Die kristalline Fällung wird abfiltriert und mit 90$igem Aethanol gewaschen. Sie schmilzt ab 240° unter Zersetzung* = 0,15 an Silicägel.

30a. " Z-GIn-ThHtBu)-AIa-IIe-GIy-QH / ; . Das unter 29), beschriebene Tetrapeptidderivat (4>2 g)

wird in 110 ml 90#igem Dimethylformamid suspendiert, mit ■

ο ^J

1,4 ml Triäthylamin versetzt und auf 70 erwärmt,. bis die Hauptmenge gelöst ist. Nach Abkühlen auf 25° gibt man 4,8 g

109810/2197 ■ ■ ·■·

Z-Gift-ONP- zu, rührt l8 Stunden bei Raumtemperatur, gibt weitere 2,4 g Z-GIn-ONP und 0,7 ml Triethylamin zu und rührt noch-20 Stunden bei 50°· Das ausgefallene Produkt wird abfiltriert, die Mutterlauge mit Aether versetzt und das ausgefallene Produkt ebenfalls isoliert. Beide Fraktionen werden zusammen in 60 ml t-Butanol suspendiert, nach Zugabe von 2-n. Salzsäure bis pH 2 gut verrieben und dann durch portionenweise Zugabe von insgesamt 600 ml Wasser gefällt. Das Produkt wird abzentrifugiert, noch zweimal mit je 200 ml Wasser gewaschen und lyophilisiert. Es kann aus viel Methanol umkristallisiert werden.P. ab 230° unter Zersetzung. Das Produkt enthält 5 Mol Wasser. Im Dünnschiehtehromatogramm auf Silicagel ist Rf ₀„. = 0,4.

30b. Z-Gln-Thr (tBu) -AIa-Ile-GIy-OMe

4,6 g des unter 28) beschriebenen H-Thr(tBu)-AIa-Ile-GIy-OMe in 30 ml Dimethylformamid werden mit 3j5 g Z-GIn-ONP versetzt und bei Raumtemperatur gerührt, bis das Gemisch fest wird. Nach Stehenlassen über Nacht wird mit Aether verdünnt, die Fällung abfiltriert und mit Aether .Nitrophenol-frei gewaschen. Das geschützte Pentapeptid zeigt im Dünnschichtehromatogramm auf Silicagel Rf = 0,l4 im System Chloroform-Methanol (95;5). F.:>250°

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1511

31a. H-Gln-Thr(tBu)-A la-Ile-GIy-OH, HCl ■

- 3,7 g Z-G In-Thr( tBu)-A la-I le-GIy-OH werden in I50 ml 80$igem Methanol und 5,5 ml 1-n. Salzsäure suspendiert und in Gegenwart von 2 g Pd-Kohle (10$) hydriert, bis die Substanz gelöst und keine Wasserstoffaufnähme mehr festzustellen ist. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Piltrat bei J>0 im Vakuum stark eingeengt, mit t-Bütanol verdünnt und lyophilisiert. Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel ist Rf₁₀₁ =0,48.

31b. H-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OMe, HCl

l4,4 g des unter 30b) beschriebenen Pentapeptidderivats werden in 8OO ml 80$igem Methanol suspendiert und einige Zeit auf 50 erwärmt. Die Suspension wird auf Raumtemperatur gekühlt, mit 20,8 ml Salzsäure und.3 g ■ Pd-Kohle (lO#ig) versetzt und hydriert, bis die Wasser-Stoffaufnahme beendet und das Ausgangsmaterial in Lösung gegangen ist. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das^: Piltrat im Vakuum bei 40° eingedampft und der Rückstand durch zweimaliges Eindampfen mit Dimethylformamid im Hochvakuum entwässert. Der Rückstand wird ohne weitere Reinigung verwendet. Rf₁₀₀ = 0,33 im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel.

0 98 1 0/2197

32. Z-Thr (tBu) -Phe;-Prp^&in-yhr(tBu)

12,0 g des unter 31b) beschriebenen Pentapeptid-* methylester-hydröohloridaWerden in 8ö ml Dimethylformamid gelost* Nacheinander werden unter Rühren bei Räumtemperatur 13>3 g Z-Thr(tBu)-Phe-Prö-ÖH und 5,75 g N-Hydröxysuöcinimld zugegeben, dann bei 0° 2,76 ml Triethylamin und 6,2 g Dicyclohexylcarbodiimid. Man rührt bei 0°, bis die Mischung dick wird,- dann wird über Näöht bei 0° stehen gelassen» Nach Einengen im Hochvakuum auf ca. 50 ml wiM das Produkt mit 300 ml Aether gefüllt. Das isolierte Material wird mit 0,05-Bh Zitronensäure und Wasser gewasöhen und im HööhväkUüm bei 4ö° getroöknet* Gereinigt wird läWöh Um^ kristallisieren aus Gä* Il isöpropanol. Man erhalt 18,0 g des geschützten ÖctapeptidderivätSi Rfoq = Ö>i7 im iöünn^- Söhichtchromatogramm auf Silicagel*

33* i-fhrCtSü) *-Phe^Pro-Ölti-Thr(tBu) ^-Ala^IΓθ4

IQi9 g des unter 52) beschriebenen Öötäpeptidmethylesters werden in 19Ο ml gO^igem Methanol unter Erwärmen auf 70° gelöst* Nach Abkühlen auf Raumtemperatur werden ~*ß ml 1-n« Natronlauge und lö Minuten später 16Ö ml Wasser in kleinen Portionen zugefügt. Dann wird klar filtriert und aus dem Flltrat das Produkt durch Eingiessen in 600 ml 0,05-n. eiskalte Salzsäure gefällt. Der Niederschlag wird

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1941 Si I

äbfiltriert Und mit Wasser neutral gewaschen. Das im Dü^söhiehtöhrömätögFamm auf Siücagel einheitliche Produkt (Rf₁₀₀ - 0,45J kann'aus. Methanol »Wasser umkriställisiert werden*

34, H-Thr(tBu)>Ptie^Pro-GIn-flhr(tBu) -.Alä-Ile^Glff ^Qg

3/6 g des unter 33) erhaltenen Z-Tiir(tBu5-ihe Thr(tBu)-Ala-Iie^Gly-OH werden in 100 ml Sö^iger Essige säure gelöst und die Losung wird in Gegenwart von Ö-i5 g^: Palladiumköhle (10$ Pd) hydriert* Nach beendeter Wässer« stoffaufnähme nutseht man vom Katalysator äfe und dämpft die IiÖsung zur froekiie ein₄ Das als farbloser Firts_■&%-#τ haitöne egsigsäure Salz des öötapeptidderiväts wird ίίΐ|._;._? Hochvakuum getrocknet* Im DünnsGhichtehrömätögräfnm äil Silicagel ist Rf_ioß, = 0>2l» -■; ^

35* Z-Asn-Lys (BOC)-

ll>25 g Z-Asn4iys(B0ö)-Phe-liis-'hydrä2jiä_J gelöst in 65 ifil Dimethylformamid, werden bei -SO⁰ bis -^5^Ö iii 2 Minuten mit 8,4 ml 4,2-n. Ghlorwässerstoff in Diöxan versetzt, Anschliessend fügt man bei -I5⁰ bis *2Ö° 2,1 ml tert.-Butylnitrit zu und lässt I5 Miriutön bei -I5⁰ stehen. Nach Abkühlen auf -20° werden 4,8 ml iriäthylafflin zugegeben, dann eine Lösung von 9,0 g des unter 34) beschriebenen

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Produktes in 210 ml 90$igem Dimethylformamid. Durch kräftige Kühlung hält man die Innentemperatur auf -15 · Im Laufe einer Stunde wird auf 0° erwärmt, wobei durch gelegentliche Zugabe von Triäthylamin das pH auf 7-8 gehalten wird. Insgesamt werden noch 3*5 ml Triäthylamin zugegeben. Nach Rühren über Nacht bei 0 wird in 3 1 Aether eingegossen, die flockige■Fällung .abfiltriert und zweimal mit Aether und einmal mit Wasser gewaschen.' Das Rohprodukt wird in 500 ml warmem Methanol gelöst und durch Eingiessen in · 1,5 1 l^ige Essigsäure.wieder ausgefällt. Das abfiltrierte und zweimal mit Wasser gewaschene Produkt wird- nochmals auf gleiche Weise umgefällt: Rf₁₀O ^{= Oj}33 (auf Silicagelplatten). ·

36. H-Asn-Lys (BOC) -Phe-His-Thr (tBu) -Phe-Pro-Gln-Thr(tBu) Ala-Ile-Gly-OH

1,7 g des obigen geschützten Dodekapeptids werden in 100 ml 80#iger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von 0,5 g Palladiumkohle (10$ Pd) wie üblich hydriert. Nach Abfiltrieren vom Katalysator wird im Hochvakuum bei 3O⁰ stark eingeengt und der Rückstand mit tert. Butanol lyophilisiert. Das in quantitativer Ausbeute erhaltene, " im Dünnschi cht chromatogramm (Rf _1Q^ '= Ό^;,;i auf Silicagel) einheitliche Produkt wird sofort weiterYerarbeitet.

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- io8 -

37. Z-Thr(tBu) -Tyr(tBu) -Thr (tBu) -Gln-Asp(OtBu) -Phe-Asn-Lys (BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-AIa-

Ile-Gly-OH ^ -

1*73 g des unter 22) beschriebenen Peptidderivats

werden bei 50° in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Nach

Abkühlen auf -20° werden 0,9 ml 4,2-n. Chlorwasserstoff in Dioxan zugetropft. Dann gibt man bei -15 0,22 ml tert. Butylnitrit zu und lässt 15 Minuten bei -15° reagieren. Nun kühlt man wieder auf -20 ab und lässt 0,53 ^ml Trläthylamin und dann eine Lösung von 1,6 g des unter 36) beschriebenen Peptidderivats in 40 ml 9°^igem Dimethylformamid zutropfen. Man erhöht die Temperatur innerhalb 1 Stunde auf 0 , wobei durch portionenweise Zugabe von Triäthylamin das pH auf 7-8 gehalten wird. Insgesamt '-..'-werden 0,25 ml Triäthylamin zugegeben. Nach weiteren 15 Stunden Rühren bei 0 wird das Produkt durch Eingiessen in Aether gefällt, die Fällung abfiltriert und mit Aether und Wasser, gewaschen. Zur Reinigung wird einmal aus Dimethylformamid-Essigester und einmal aus Dimethylformamid -0,02 n. Salzsäure umgefällt. Das reine Material zeigt im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel Rf₁₀₀ =0,40.

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- log -

38, Z-Ala-Pro-

2,28 g H-PrQ-NH₂ und 7,57 g Z-AIa-QNP werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst und die gelbe Lösung l8 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wird im Hochvakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit Aether versetzt und das entstehende Pulver gründlich zerrieben. Nach Abnutsehen und Trocknen werden 5*5 g Z-A la-Pro-NHg von F, 167,5-168,5° erhalten, ^⁰ (g =? l in Methanol).

39. Z-GIy-A la-Pro-NH_g

27,-1 g des obigen Dipeptidderivats werden in 495 ml Aethanol gelöst und nach Zugabe von 85 ml l,Q-"n,wässeriger Salzsäure in Gegenwart von 4,25 g Palladium-Kohle (lQ$ Pd) hydriert. Nach beendeter Hydrierung wird die Lösung bei 40-50° Badtemperatur im Vakuum eingedampft, Der Rückstand wird bei 40° in 40 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung auf 2Q° abgekühlt. Sodann werden 29,1 g 2i-G Iy-QNP zugegeben und nach Lösen innerhalb 45 Minuten 11>2 ml absolutes Triäthylamin unter Rühren zugetropft. Danach wird während 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Suspension wird bei 40° und 0,01 Torr eingedampft und der Rückstand zwischen 600 ml Wasser und 3.00 m,l Aether verteilt. Die wässerige Schicht wird zweimal mit je 30Q ml

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- HO - '

Aether und die Aethej'-Sohicht zweimal mit Je 3OQ ml Wasser extrahiert. Die wägserigen Fraktionen werden gemeinsam im Vakuum bei 40-50° eingedampft und mehrmals durch Zugabe vpn Chloroform und Eindampfen von Wasser befreit, ßer gut getrocknete Rückstand wird bei 40-50 in 5OO ml Essigester aufgenommen, unlösliches Triäthylamin-hydroChlorid abfiltriert und das Filträt bei 3Ο^4θ^Θ mit IQ ml Aether versetzt^ worauf Kristallisation Nach ca, 20-stündigem Stehen bei +5® Mb + 10° Kristalle isoliertj, gewaschen und getrooknet* F.T 1OpIQ^- Das Frodukt enthalt % Triäthylamin^hydrochloridj in dieser Form weiter umgesetzt werden. Zui* Reinifp werden 5,0 g des obigen Rohkristall!sats in 10 mX Wassergelöst und nach Zugabe von 20 ml Methylenchlorid mit Xp BlX gesättigter Kaliumearbonatlösung versetzt, D|e organische Sehicht wird abgetrennt> mit 10 ml gesättigter Kaliunjcarbonatlösung extrahiert^ die wässerige Schicht wird mit 15 ml Methylenohlorid extrahiert. Elie vereinigten Methylenchloridlösungen werden mittels wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird aus 50 ml Essigester kristallisiert. Man erhält 4,4 g; Tripeptidderivatj, F. 109-112°. Nach Kristallisation Aceton-Methanol-A ether (10:4:6) werden Kristalle νοίή

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- Ill -

P. l44,5i-l'45V5° erhalten (Kristallpolymorphie). [α]^⁰= -93° (c = 1,0 in Methanol) Bei der DünnschichtChromatographie.auf Silicagel in Chloroform + Methanol (8:2) ist Rf = Ο/38.

40. H-GIy-Ala-Pro-NH₂

l8,8 g des unter 39) erhaltenen rohen Tripeptidamidderiyates werden in 400 ml.Dimethylformamid gelöst und in Gegenwart von 1,0 g Palladium-Kohle (l0# Pd) hydriert. Nach beendeter Hydrierung wird filtriert und die Lösung nach Kurzem Entgasen in der nächsten Stufe eingesetzt.

41. Z-VaI-Giy-Ala-Pro-NHg ■

Zu der unter 40) erhaltenen Lösung des Tripeptidamids (550 ml) gibt man 20,1 g Z-Val-p-Nitrophenylester und lässt das Gemisch während l8 Stunden bei Raumtemperatur stehen. Danach wird bei 5Ο-6Ο⁰ und 0,01 Torr* zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit 300 ml Aether verrieben und filtriert. Der Pilterrückstand wird getrocknet und in 210 ml absolutem Äethanol während 15 Minuten bei 70^80° •gerührt, auf 0° gekühlt und filtriert. Der Rückstand wird aus einem Gemisch von 17Ö ml absolutem Tetrahydrofuran, 25 ml Wasser und 110 ml Aether kristallisiert. F. = 209-211°, Rf-Wert auf Silicagelplatten' = 0,42 in Chloroform-Methanol (8:2).

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42." H-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂

1,1 g Z-Val-Gly-Ala-Pro-NH₂ werden in 50 ml 80#igem Methanol gelöst und die Lösung wird in Gegenwart von 0,3 g Palladium-Kohle (lO$ Pd) hydriert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme wird vom Katalysator abgenutscht, die Lösung eingedampft und der Rückstand im Hochvakuum bei 35 Badtemperatur getrocknet. Dabei wird das Tetrapeptid H-Val-Gly-Ala-Pro-NHg als farblose Substanz erhalten, Rf-Wert = 0,20 (Silicagelplatten, System Chloroform-Methanol

43. Z-Thr(tBu) -Tyr(tBu) -Thr(tBu) -GIn-Asp(OtBu) -Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-AIa-He-GIy-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂ .

800mg des unter 37) beschriebenen Peptidderivats, 5OO mg H-VaI-GIy-Ala-Pro-NH₀ und 1?O mg N-Hydroxysuccinimid werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst, im Hochvakuum auf.etwa die Hälfte eingeengt und mit 25O mg TDicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wird mit Aether ausgefällt und das Material isoliert. Gereinigt wird durch Craig-Verteilung im Gemisch Methanol-Puffer ( wie Beispiel 3, ■ 12)-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:3:5:6) , K = 0,29. Dau aus der Verteilung isolierte reine Produkt zeigt im Düimschichtchromatogramm Rf,Q₇ = 0,62 (auf Silicagelplatten)»

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- .115 -

44. H-Thr (tBu) -Tyr (tBu) -Thr (tBu) -G In-A Sp(O tBü) -Phe-Äsn-■ Lys (BOC) -Phe-His-Thr (tBü) -Phe-P ro-G In-Thr (tBü) -AIa-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHg

3OO ^mS des.obigen Peptidderivats werden In 3° ml 80$iger Essigsäure gelbst und in Gegenwart von 100 mg Palladiumkohle (10$ Pd) hydriert. Nach vollständiger Decarbobenzoxylierung wird der Katalysator' abfiitfierti das Filtratim Hochvakuum bei 30° stark eingeengt Und der Rückstand aus tert. Butähol lyophilisierti Der Rückstand wird in 10 ml.Methanol gelost^ durch Zugabe von 1-ii»- iiatriumbicarbonat schwach alkalisch gemacht und durch Eintropfen in.Öjl-h. Natriumcarbonat äüsgefallti» Das Isolierte Produkt wird nochmals gleich umgefallt. Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicägel· ist ^

45» BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBü)-Cys-Met-Leü-" Gly-Thr(tBü)-Tyr(tBü)-Thr(tBü)-Gin-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BÖG)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thf(tBü)-Ala-Iie-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHg

288 mg des obigen Produktes* 181 mg des unter 12) beschriebenen Peptidderivats und 46 mg N-Hydroxysüccinimid werden in 2 ml Dimethylformamid unter Ueberleiten von Stickstoff bei 45° gelöst. Nach Zugabe von 52 mg

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Dleyelohexyioarbodiimid νίίίύ hoch 3 Stunden bei 45° gerührt> darauf tnit peroxidfreiem Aether gefällt, und das Produkt -... .....

isoliert. Gereinigt wird durch eine Craig-Verteilung im System Methanol-Puffer (wie in Beispiel 3 unter 12) beschrieben Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (ll:3:6i7)> K = 0*74» Das aus der Verteilung isolierte reine Produkt zeigt im

Dünnschi cht ehr omat ogramm HFpr₂Ä ⁼ °>^5 ^lOO ⁼ ^'^ (auf Silicagel)_k

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i~'^{; Λ} :? Beispiel 3 :

ι —

H-Cys-Gly-AsA-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-GIn-Asn-Phe-Äsn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-GIy-Ala-Pro-NH₀ (Asn¹⁵-Calcitonin M )

Γ" ■

• 53 ^mS feinst gepulvertes BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser

(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Me t-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHp werden in 2 ml konzentrierter Salzsäure bei 0 gelöst und 5 Minuten umgeschwenkt. Dann entfemtman den gasförmig gelösten Chlorwasserstoff am Hochvakuum während 5 Minuten, verdünnt mit 4 ml eiskaltem Wasser und überführt das Produkt in das essigsaure Salz an einer kleinen Säule Amberlite CG-45 (schwach basischer Ionenaustauscher in Aeetatform) und lyophilisiert. Man erhält das Produkt in Form einesfarblosen Lyophilisats. "

Im UV-Spektrum in lO^iger Essigsäure ist

% = 275 nm (8 = 1700 )· Im Dünnschichtehromatogramm an Cellulose (Selecta) ist Rf^ = 0,48, ^Rf _101A = ®Λ9ί an Aluminiumoxid (AlOX,Camag) ist Rf_?q = 0,57.

In der Elektrophorese wandert die Substanz bei 280 V in 1,5 Stunden auf Cellulose-Selectaplatten in Richtung Kathode bei pH = 1,9 (Essigsäure-Ameisensäurepuffer) : 3,5 cm.

Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:

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1. Z-Gln-Asn-Phe-OCH,

l4>5 S Z-GIn-ONP werden zusammen mit 10,8 g H-Asn-Phe-OCH , Hydrochlorid (Ann. 688, 259 [Ι9β5])ΐη 100 ml Dimethylformamid gelöst und langsam mit 4,55 ml Triäthylamin versetzt. Es entsteht eine dicke Paste, die mit 50 ml Dimethylformamid verdünnt wird. Nach 24 stündiger Reaktion bei Raumtemperatur wird filtriert und der Rückstand mit Dimethylformamid gewaschen. Der so erhaltene Z-Gln-Asn-Phe-OMe kann aus viel heissem Dimethyl· 'formamid umkristallisiert werden. P. 26l-265°(Zers.) [aJj:⁰ = +. 11 ( c = O,'94 in Hexamethylphosphorsäuretrlamid).

2. H-Gln-Asn-Phe-OCH,-hydrochlorid

l4,l g Z-Gln-Asn-Phe-OCH-, werden in 800 ml Methanol unter Zusatz von 8,5 ml J>-n. Chlorwasserstoff in Dioxan und 2,4 g lO^iger Palladiumskohle bei 45° hydriert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme wird filtriert und eingedampft. Der Rückstand wird ohne weitere Reinigung weiterverwendet.

Im Dünnschichtchromatogramm an Silicägel ist

^Rf52A ^{= 0>27; Rf}45 ⁼ °'3l; ^Rf43E ⁼ °'5O.-

3. Z-Thr (tBu)-Gln-Asn-Phe-OCH, '

9,3 g H-Gln-Asn-Phe-OCH -Hydrochlorid werden mit 11,9 S Z-Thr(tBu)-OSU in I50 ml Dimethylformamid zu einer klaren Lösung gelöst. Dazu werden 2,85 ml Triäthylamin in 10 ml Dimethylformamid getropft und 21 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Anschliessend wird am Vakuum eingeengt, der Rückstand-

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In viel Sssigester-Chloroform (9:1) aufgenommen und ausgeschüttelt mit 2 χ 200 ml 5$iger Zitronensäure und 1 χ 100 ml Wasser. Nun filtriert man den unlöslichen Niederschlag ab, schüttelt das Hltrat noch mit 2 χ 200 ml 2-n. Sodalösung und 3 x 100 ^ml Wasser aus, trocknet mit Natriumsulfat und dampft ein. Der Eindampfrückstand wird mit 'dem oben erhaltenen Filtrationsrückstand zusammen aus Dirnethylformamid/Aether (1:1) umkristallisiert. P. 237 - 241° (Zers.); [a]^° = + 8° (c - 1%'in Dimethylformamid)

Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist ₀ = 0,59; ^Rfinot? = 0,59; .an Alumminiumoxld (Alox) ist

4. H-Thr(tBu}-Gln-Asn-Phe-OCH ·

6,31 g Z-Thr(tBu)-Gin-Asn-Phe-OCEL werden in 600 ml Methanol zusammen mit 700 mg lO^iger Palladiumkohle bei Zimmertemperatur in der Schüttelente neutral hydriert. Die Substanz geht allmählich in Lösung. Den amorphen Eindampfrückstand setzt man direkt in der nächsten Kondensation ein.

Im Dünnschichtehromatogramm an Silleagel ist = 0,21, Rf,_Aon = 0,21; an Aluminiumoxid ist Rfw« = 0,19·

5. Z-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-QIn-Asn-Phe-OCH,

Eine Lösung von 5,9 g Z-Tyr(tBu)-OH (freigesetzt aus 8,8 g Z-TyrCtBuJ-OH-dicyclohexylammoniumsalz) in 85 ml Tetrahydrofuran wird mit 1^,84 ml N-Methyimorpholin versetzt und bei -33° mit 2,28 ml Chlorameisensäure- isobutylester zur

■■.■-■■ 19 A1511

Reaktion gebracht. Man rührt eine halbe Stunde bei -20 bis -12. und lässt dann ,die auf -10 abgekühlte ; Lösung des Tetrapeptidderivates H-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-OCTL·· in 25 ml Dimethyl-' formamid hinzulaufen und spült mit 15 ml Dimethylformamid. Nach Reaktion bei Zimmertemperatur während I9 Stunden wird am Vakuum eingeengt, in Essigester suspendiert und 3 ^mal mit Seiger Zitronensäurelösungj 3 mal mit 2-n. Sodalösung und 5 mal mit halbgesättigter Kochsalzlösung ausgeschüttelt. Man filtriert vom suspendierten Rückstand ab und trocknet diesen am Hochvakuum. Das Produkt lässt sieh aus Methanol kristallisieren. P. 216 - 219^Q; [al^° = + 4° ( e = 1,0 in Dimethylformamid).

Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist . Rf₁₅₂ = Q,6A ; ^RfiQ2A ⁼ °-'7°i ^an Aluminiumoxid (Alox) ist

= 0,65 ; Rf₈₉ = 0,17. .

6. H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-OCH

5,1 g Z-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-DCH-. werden in βΟΟ ml Methanol bei Zimmertemperatur mit 8OO mg lO^iger Palladiumkohle wie üblich decarbobenzoxyliert. Das erhaltene H-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-OCH™ weist im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel folgende Werte auf :

RfQ- = 0,15J Rf₁^_n =0,28; Rf in Chloroform-Methanol (9:1) oy lUcü ■

tΜ - -

7. Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-OCH-,

Das unter 6. erhaltene Pentapeptidderivat H-Tyr (tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-OCH wird mit 4,3 g Z-Thr(tBu)-OSU in 40 ml Dimethylformamid gelöst und 18 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Die Aufarbeitung erfolgt wie unter 5< Den. in Essigester schwerlöslichen Rückstand kristallisiert man aus Methanol um. F. 206 - 208°; ta]_D = +15° ( c = 1,7 % in Dirnethylfbr mamid); im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel

ist Rf,„_OTr = 0,69; RfQ₀ — 0,28 ; Rf in Chloroform-Methanol xucüi oy

(9:1) = 0,30.

8. Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-GIn-Asn-Phe-NH-NH₂

2,0 g Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-OCH, werden in 150 Methanol gelöst und mit 10,7 ml Hydrazinhydrat 6 Stunden bei Zimmertemperatur zur Reaktion gebracht. Man filtriert vom Niederschlag ab, wäscht diesen mit Methanol und trocknet am Hochvakuum über konzentrierter Schwefelsäure. ° (Zerx); ta]^° + 4°

F. 231 (Zerr.); ta^_D = + 4 ( c = 0,89 im Dimethylformamid;

Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf₄₃₀ = 0,57; Rf₄₅ = 0,60; Rf_102E =0,58.

9: Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH .

8OO mg Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-NH-NH₂ werden in l8 ml Dimethylformamid gelöst, bei -20° mit

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0,58 ml 3-n. Chlorwasserstoff in Dioxan versetzt und mit 0,l6 ml t-Butylnitrit vermischt. Man rührt 15 Minuten bei -20 bis -15°, gibt dann 0,30 ml Ν,Ν-Diisopropyl-äthylarnin und 855 mg H-Asn-Lys (BOC) -Phe -His -Thr(tBu)-Phe -Pro-Gln-Thr(tBu)-AIa-IIe--GIy-OH (Acetat) in 20 ml Dimethylformamid (90^ig) zu und rührt bei 0 . Nach zweimal einer Stunde gibt man je 0,075 ml N,N-Diisopropyl-äthylamin (insgesamt .0,15 ml) zu und rührt 15 Stunden bei 0 . Dann rührt man den·Ansatz in 600 ml Aether ein, lässt den Niederschlag sich absetzen und nutscht ab. Zur Reinigung, wird das Rohprodukt einmal aus Dimethylformamid-Essigester und einmal aus bimethylformamid-wässerige 0,002-n. Salzsäure umgefällt. .

Im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist

⁼ °'^{β2; Rf}ioo ⁼ °'^{32 ; Rf}45 ⁼ °'^{53 ; Rf}3 ⁼ °'²⁷· 10. Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-Asn-Lys(BOC)-

Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-AIa-IIe-GIy-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂

786 mg Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-Asn-Lys (BOC)-Phe--His-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-Ala-Ile-GIy-OH und 251 mg H-VaI-Gly-Ala-Pro-NHp werden zusammen mit 82 mg N-Hydroxysuccinimid in 10 ml Dimethylformamid aufgeschlämmt' und unter Rühren bei 40 mit 90 ^mS Dicyclohexyl'-carbodiimid in 1 ml Dimethylformamid versetzt. Nach 3 Stunden bei 40 gibt man weitere 65 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und

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rührt insgesamt-21 Stunden bei 40^o» Man verdünnt mit 10 ml Methanol und führt in 350 ml Aether ein, lässt den Niederschlag sich absetzen und filtriert ihn ab,. Das Präzipitat wird durch Craig-Verteilung im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (10:3:5:6) Puffer wie in Beispiel 1 unter l8)gereinigt.

Nach 450 Stufen wird die nach DünnschichtChromatographie einheitliche Substanz isoliert ( K —0,66).

Im Dünnschichtehromatogramm an Silicagel ist Rf₃ = 0,40; Rf₄₅ = 0,42; Rf₁₀₀ =0,32.

11. H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Prο

64 mg Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-Asn-Lys (BOC)-Phe-Hi s-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-lie-Gly-Val-GIy-AIa-Pro-NH^ werden in 100 ml 80$iger Essigsäure in Gegenwart von 16 mg lO^iger Palladiumkohle bei Zimmertemperatur in der Schüttelente während 15 Stunden hydriert. Man nutseht vom Katalysator ab, wäscht diesen mit demselben Lösungsmittelgemisch und lyophilisiert. Man erhält ^k mg des Docosapeptid-amid-acetats. Dieses wird in 10 ml warmem Methanol gelöst, mit einigen Tropfen 1-n. Natriumbicarbonatlösung auf pH ca 7>5 gestellt und in 50 ml 0,1-n. Sodalösung von 0° eingerührt. '

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Man. lasst die milchige Fällung sieh absetzen, nutseht

sie ab, wascht sie mit Wasser und trocknet» \

Im Dünnschichtehromatogrämm an Silicagel ist

= 0,50 ; Rf₁₁₀ -0,61; 'Rf₅₂ = 0,21. . . ■ .

. . j— 1 ■■ . ..

12. Boe-Cys-Gly-Asn-Leu-SeritBuJ-ThritBuJrCys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-

93 mg Boc-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-

Leu-Gly-OH, 95 mg H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asn-Phe-Lys (BOG) -Phe -His -Thr (tBu) -Phe -Pro -Gln-Thr (tBu) -Ala -lie -Gly-Väl-GIy-AIa-Pfο-NHp, 14 mg N-Hydroxysuccinimid und 10 ml Diinethyl- ' formamid werden unter Stickstoff mit 15 mg Dicyelohexylcärböälimid verrührt. Man rührt das Reäktionsgemisch bei 40 insgesamt' 20 Stunden, wobei man nach 2 Stunden nochmals 15 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugibt. Anschliessend tragt man den Ansatz in 30O ml absoluten Aether ein, lässt 2 Stunden im Kühlschrank stehen, nutseht den Niederschlag ab und wascht ihn mit Aether*. Zur- Reinigung wird das Rohprodukt im System Methanol-Puffer-Chlorofbrm-T'eträchlorkohlenstoff (11:3;6:7, Puffer wie in Beispiel 1 unter l8) über 220 Stufen multiplikativ verteilt. Die reinen Fraktionen (Gefässe 104-121 ; K= 1,0 ) werden vereinigt, eingedampft , und am Hochvakuum bei 40° vom Ammoniumacetat befreit*

Im Dünnsehichtchromatogramm an Silicagel ist Rf₄₅ = 0,60; Rf₉₆ = 0,59 ; Rf₁₀₀ = 0,32.

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- 123 Beispiel 4

Ac-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile -GIy-Val-Gly-Ala-Pro-NH₂ (N^Acetyl-Calcitonin M)

100 mg Ac-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-GIn-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH^ werden unter Stickstoffspülung bei 0 in 3 ml 95$iger Trifluoressigsäure aufgenommen und nach vollständigem Lösen 90 Minuten bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Bei 0 wird mit 50 ml kaltem Aether ausgefällt, die Suspension zentrifugiert und der Niederschlag noch zweimal mit Aether verrieben. Das über Aetznatron am Hochvakuum getrocknete Produkt wird zur TJeberführung in die Acetatform in 3 ml Wasser aufgenommen, auf eine mit 0,02-n. Essigsäure äquilibrierte Säule von schwach basischem Ionenaustauscher.(z.B. Merck; 7*5 mm; 20 cm ) aufgebracht und mit 0,02-n. Essigsäure eluiert. Das Eluat wird bei 25° am Hochvakuum eingedampft, der Rückstand in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Das weisse Pulver wird zur Reinigung einer Craig-Verteilung im System n-Butanol-Eisessig-Wasser (4:1:5) (3 ml Phasenvolumen) unterworfen. Nach 600 Schritten werden die nach

Dünnschichtchromatogramm einheitliches: Produkt enthaltenden

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BAD

Fraktionen vereinigt, am Hochvakuum bei 25 .eingedampft, in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Trocknen über Aetznatron amHochvakuum bei Zimmertemperatur ergibt ein amorphes Pulver. . '

Bei der Elektrophorese auf "Selecta" (pH 1,9; 1 V2 Stunden;

280 V) läuft das Produkt -1,8 cm bei pH 4,8 - 1,2 cm. Im Dünn-

schichtchromatogramm auf "Alox" Rf₅₂ = 0,65; Rf^ =0,60; Rf₄₅ = 0/72; auf "Selecta" Rf₄₅ = 0,55; R^_{101A 52} 0,38.

•Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:

1. TRI-Cys(TRI)-GIy-Asn-Leu-OMe

9,1 g TRI-Cys(TRI)-OH und 3,2 g H-Gly-Asn-Leu-OMe wer-· ■ den in 60ml BLmethylformamid aufgenommen und unter Rühren bei 0 mit 3*7 S Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach I5 Stunden bei 0 wird vom Dlcyclohexylharnstoff abfiltriert, das Piltrat zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Chloroform-Petroläther kristallisiert. P. 126 - I30⁰. Im Dünnschichtchromato-' gramm an Silieagel ist Rf = 0,27" im System Chloroform-Methanol (95:5).

2. H-Cys(TRl)-Gly-Asn-Leu-OMe, Acetat . '

1,8 g TRI-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe werden in 16 ml Eisessig gelöst und bei Zimmertemperatur tropfenweise mit 4· ml Wasser versetzt. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur gibt ^j man 12 ml Wasser zu, filtriert vom ausgeschiedenen Trityl-

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earbinol ab und dampft das Filtrat am Hochvakuum bei 40 zur Trockne ein. Der ölige Rückstand wird in tert.-Butanol aufgenommen und lyophilisiert. Es resultiert ein weisses Pulver, welches im Dürnischichtchromatogramm an Silicagel Rf = 0,45 im System: Chloroform/Methanol (.8 : 2) aufweist.

3. Ac-Cys(TRl)-Gly-Asn-Leu-OMe

Zu 1,02 g H-Cys(TRI)-GIy-Asn-Leu-OMe, Acetat und 0,9 ml Eisessig in I5 ml Chloroform werden bei 0 1,9 S Dioyclohexylcarbodiimid trocken zugegeben. Nach ca. 10 Minuten ist das Reaktionsgemisch zu einem Brei erstarrt. Es wird mit 10 ml Chloroform verdünnt und die Mischung 4 Stunden bei gerührt. Nach Zugabe von 30 ml Petroläther wird abfiltriert und der Niederschlag aus heissem Chloroform umkristallisiert. F. 156-158,, Im Dünnsehichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,25 im System ChlorOform_TMethanol (9:1).

4. Ac-Cys(TRI)-GIy-Asη-Leu-NH-

Man versetzt 2",42.g Ac-Cys(TRl)-GIy-Asn-Leu-OMe in 21 ml Dimethylformamid mit 3*75. ml Hydrazinhydrat und lässt die klare Lösung 2 Stunden bei Zimmertemperatur stehen. Dann kühlt man auf 0 ab und gibt unter Rühren I50 ml Wasser hinzu. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit kaltem Wasser gewaschen und über Phophorpentoxid getrocknet. Zur Reinigung wird aus heissem Methanol umgefällt. RiV-z = 0*55 im Dünnschicht· chromatogramm an Silicagel.

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5· Ac-Cys(TRI)-GIy-As η-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBü)-Cys(TRI)-Met■ Leu-Gly-OH

1,44 g Ac-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NHg werden in IO ml Dimethylformamid gelöst und unter Stickstoffspülung bei -10° mit 2,5 ml 2,0-n. Chlorwasserstoff in Essigester und 0,26 ml t-Butylnitrit versetzt. Nach 15 Minuten bei -10 wird eine auf -10° gekühlte Lösung von 1,02 g H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH (essigsaures Salz) und 0,84 ml Triäthylamin in 12 ml Dimethylformamid tropfenweise so zugegeben, dass die Temperatur -10 nie übersteigt.■_ Es wird noch eine Stunde bei -10° gerührt und 24 Stunden

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bei 0° stehen gelassen. Das Produkt fällt als Gel aus. Die Reaktionsmischung wird auf ca. 5 ml eingeengt, durch Zugabe von 20 ml Methanol vollständig ausgefällt, abfiltriert _% und mit kaltem Dimethylformamid-Methanol (l:l) gewaschen. Nach dreimaligem Verreiben mit kaltem Wasser und Trocknen über Aetznatron wird einmal aus Dimethylformamid-Methanol umgefällt, wodurch das schwer lösliche Produkt in reiner Form erhalten wird. Rf = 0,25 im-System Chloroform-Methanol (8:2) an Silicagel. -

6. Ac-Cys-Gly-Asn-Leu-SerftBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-OH

Eine Lösung von 410 mg Ae-Cys(TRl)-GIy-Asn-Leu-Ser(tBu)■ Thr(tBu)-Cys(TRl)-Met-Leu-Gly-OH in 35 ml Dimethylformamid wird bei Zimmertemperatur innert 15 Minuten in eine stark gerührte Lösung von 1,0 g Jod in 150 ml Methanol getropft.. Nach-beendetem Eintragen wird noch eine Stunde gerührt, dann auf 0° gekühlt und die ' . Reaktionslösung durch tropfenweises Zugeben von 1,0-n. Natriumthiosulfatlösung entfärbt. Am Wasserstrahlvakuum bei 30 wird zunächst Methanol abgedampft und dann am Hochvakuum (30⁰) auf ca. 10 ml eingeengt und mit 200 ml Aether versetzt. Vom ausgefallenen Harz wird abdekantiert, dreimal mit Aether und dreimal mit Wasser verrieben und über Aetznatron am Hochvakuum getrocknet. Zur Reinigung

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wird in Chloroform gelöst':, filtriert und das Produkt aus

dem Filtrat mit Hexan ausgefällt. Rf₇₀ = 0,50; Rf43c an Silicagel.

7. Ac-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-GIy-Thr-(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-GIn-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-. Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile. -GIy-.VaI-GIy-Ala-Pro-NH₂

j ι

116 mg Ac-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-

Leu-GIy-OH,.250 mg H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp-(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-. Ala-Ile. -Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHg und l6 mg N-Hydroxysuccinimid werden in 2 ml Dimethylformamid gelöst und dazu bei Zimmertemperatur 30 mg Dicyclohexylcarbodiimid trocken zugegeben und unter Stickstoffspülung 24 Stunden bei 40° stehen gelassen. Der Ansatz wird dann, ohne dass man vom Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, am Hochvakuum zu einem OeI eingeengt und dieses mit Methanol-Aether (.1:1) zu einem Pulver verrieben und abfiltriert. Das Produkt wird gereinigt durch zweimaliges Umfallen aus Methanol-Aether. Rf^p = 0,50; ^Rf52A ⁼ °'30; Rf₁₀₀ - 0,32; Rf₁₀₇ = 0,65 an Silicagel.

10 9 8 10 /.2 19 7

Beispiel 5 : .

Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Prο-GIn-Thr-Ala-He-GIy-VaI-GIy-Ala-Pro-NHp (Desamino-Calcitonin^M)

50 mg Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Phe-Asη-Lys(BOC)-Phe -Hi s -Thr (tBu) -Phe -Pro -GIn -Thr (t-Bi}-Ala -He -GIy -VaI -GIy-Ala-Pro-NHp werden unter Stickstoffspülung bei 0° mit 0,95 ml konzentrierter Salzsäure versetzt» Man lässt noch 5 Minuten reagieren, legt dann unter Rühren ein Hochvakuum an das Reaktio'nsgefäss, gibt nach 5 Minuten 40 ml tert.Butanol zu .und lyophilisiert. Es resultiert ein voluminöses weisses Pulver. Im Dünnschichtchromatogramm an Cellulose ist Rf^c- = 0,5^^ Ri^> ₍-₂ ⁼⁰-»3^ an Aluminiumoxid ist Rf^ = θΛ7χ ^Rf5₂ ^{= 0}^^{1 und Rf}7g =°/66.

Das Produkt hat in der Elektrophorese

auf Cellulose "Selecta" l440 (pH 1,9; 1 1/2 Stunden, 280 V) eine Laufstrecke von-1,8 cm*bei pH 4,8 : 1,2 cm zur Kathode.

Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden;

1. Bmp(TRl)-0H

Man löst 6,37 g frisch destillierte ß-Mercaptopropionsäure in 100 ml Benzol und gibt bei 0° unter StickstoffspUlung-25*1 g Triphenylchlormethan portionenweise zu. Nach

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beendetem Eintragen wird die Eiskühlung entfernt. Aus der zunächst klaren Lösung beginnt das Produkt auszufallen. Nach 2 Stunden wird auf 0° gekühlt, filtriert und mit kaltem Methanol gewaschen. Umkristallisation aus Methylenchlorid-Methanol liefert das reine Produkt vom P. 200 - 201°.

2. Bmp(TRI)-GIy-Asη-Leu-OMe

Zu einer bei 0° gerührten Lösung von 2,62 g Bmp(TRl)-OH .und 1,58 g H-GIy-As η-Leu-OMe in 30 ml Dimethylformamid werden 1,85 g Dicyclohexylcarbodiimid gegeben. Nach 24 Stunden bei 0 wird vom Dicyclohexy!harnstoff abfiltriert und das Filtrat bei 40 zur Trockne eingedampft. Das Produkt wird durch Umfallen aus Methanol gereinigt. Im Dünnschichtchrornatogrammm an Silicagel ist Rf₁^ = 0,67.

3. 'BmP(TRI)-GIy-ASn-LeU-NH-NH₂

1,06 g BmP(TRI)-GIy-ASn-LeU-OMe werden in 30 ml Methanol mit 3 rol Hydrazinhydrat versetzt. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur kristallisiert das Hydrazid bei Animpfen aus. Es wird aus heissem Methanol umkristallisiert. F. I90 - 194 . Rf = 0,35 im System Chloroform-Methanol (8:2).

4. Bmp(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Me t-Leu-Gly-OH

926 mg Bmp(TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NH₂ werden in 8\ml Dimethylformamid bei ^15° mit 2,21 ml 2,21-n. Chlorwasserstoff in

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- 131 - ' .

Essigester und O, l8 ml t-Butylnitrit versetzt. Nach 15 Minuten bei -10 wird eine auf -10 gekühlte Lösung von 1,38 g H-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRl)-Met-Leu-Gly-OH und 0,7 ml Triäthylamin in 10 ml Dimethylformamid zugetropft. Es wird noch eine Stunde-bei -10° gerührt und 15 Stunden bei 0 stehen gelassen. Nach Zugabe von 20 ml Methanol wird abfiltriert, der Niederschlag mit kaltem Methanol gewaschen, dann in Wasser zerrieben, filtriert und über Aetznatron getrocknet. Das dünnschichtchromatografisch einheitliche Produkt liegt zu 40# als Trläthylammoniumsalz vor. Im DünnschichtchromatO-gramm an Silicagel ist Rf = 0,55 im System Chloroform-Methanol ( 7:3 ).

5. Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-OH

Zu einer Lösung von 1,4 g Bmp(TRl)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-GIy-OH in I50 ml Dimethylformamid . gibt man bei Zimmertemperatur 0,3 ml 1,0-n. Salzsäure. Die Lösung wird innert 30 Minuten zu einer stark gerührten Lösung von 2,25 g Jod in 5OO ml Methanol getropft. Die Mischung wird noch eine Stunde bei Zimmertemperatur ge.-rührt, dann auf 0 abgekühlt und durch tropfenweise Zugabe von 1,0-n.wässeriger Natriumthiosulfatlösung entfärbt. Nach Zugabe von 1,6 ml 0,5-n. Natronlauge wird bei 40° Badtemperatur auf ca. 20 ml eingeengt, mit ca. 400 ml Aether versetzt und abdekantiert . Der Rückstand wird mit 20 ml Wasser zerrieben.

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filtriert, mit kaltem Wasser gewaschen und über Aetz- . natron getrocknet. Das Produkt wird-durch Umfallen aus Chloroform-Aether gereinigt. Im Dünnschichtchromatogramm an SiIicagel ist Rf _121A = 0,43; Rf₁₀₀ = 0,34; Rf₄₃ = 0,28.

6. . Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-AIa-Ile-Gly-Väl-GIy-AIa-PrO-NH₂ -

46 mg Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBü)-Cys-Met-Leu-GIy-OH, 8l mg H-Thr(tBu)-Tyr(tBu) -Thr (tBu) -Gin-Asp(OtBu¹)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-AIa-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHp, 9'7-mg N-Hydroxysuccinimid und 13 mg Dicyclohexylcarbodiimid werden in 2 ml Dimethylformamid 3-1/2 Stunden bei 45° gehalten. Die klare Lösung wird dann in 40 ml absolutem Aether bei 0° getropft und das ausgeschiedene

■, f. ('■

Produkt abfiltriert. Gereinigt wird durch Umfallen aus Methanol-Wasser. Rfn-= 0,38 im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel. ■.

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Beispiel 6

H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-OH

120 mg BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu- ' Gly-Thr (tBu) -Tyr (tBu) -Thr (tBu) -GIn-A sp (OtBu) -Phe-A sn-Lys(BOC) -Phe-His-Thr (tBu) -Phe-Pro-Gln-'Thr(tBu) -Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-OtBu werden mit 3 ml 95^iger Trifluore.ssigsäure 1 /2 Stunden unter Stickstoff bei Raumtemperatur aufbewahrt, dann mit peroxidfreiem Aether ausgefällti Das abfiltrierte Produkt· wird mit Aether säurefrei gewaschen,' dann in 0,02-n. Essigsäure, gelöst, durch eine Säule von Merck-Ionenaustauscher Nr. II (schwach basisch, Acetatform) filtriert und das-Eluat lyophilisiert.. Das erhaltene Dotriacontapeptid wandert in der Elektrophorese auf "Selecta" bei pH 1,9 und 280V in lV2 Stunden 3,0 cm zur Kathode, bei pH 4,8' 1,5 cm. Rf₇₉ = 0,45; Rf₅₂ = 0,42; Rf₄₅ = 0,40 an "Alox"; Rf₅₂ = 0,28; Rf₄₅ =0,42; Rf_l01A. = 0,50 an "Selecta". ■ '. - "

Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:
1. H-Pro-OtBu

9Λ5 g Z-Pro-QtBu werden in 100 ml Methanol und 1,0 g Pd-Kohle (lO^) bei Zimmertemperatur hydriert. Die Aufnahme . von Wasserstoff ist nach 30 Minuten beendet. Die Lösung

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190511

. wird vom Katalysator abfiltriert und am Wasserstrahlvakuum bei J)O eingedampft* Das resultierende OeI ist im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel einheitlich. Rf = 0,55 im System Chloroform-Methanol (l:l).

2. ' Z-A la-Pro-OtBu . . ·

10,32 g Z-AIa-ONP und 5,0 g H-Pro-OtBu werden in 10 ml Essigester eine Stunde bei 0° und 15 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Dann verdünnt man mit 100 ml Essigester, wäscht mit zu 50$ gesättigter Kaliumcarbonatlösung und mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft ein. Das resultierende OeI ist laut Dünnschichtchromatogramm an Silicagel einheitlich (Rf = 0,65 im System Chloroform-Methanol (9:l)) und wird direkt weiter . verwendet.

3. H-Ala-Pro-OtBu · -

9,36 g Z-Ala-Pro-OtBu werden in 100 ml Methanol in Gegenwart von 500 mg Pd-Kohle (lO#) bei Zimmertemperatur hydriert. Die Wässerstoffaufnähme ist nach 9° Minuten beendet. Die Lösung wird vom Katalysator abfiltriert und am Wasserstrahlvakuum bei 3°° zu einem OeI eingedampft. Dieses erweist sieh im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel als einheitlich. Rf = 0,35 im System Chloroform-Methanol (1:1),

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4. Z-Gly-Ala-Pro-OtBu . .

1,65 Z-GIy-ONP und 1,09 g H-Ala-Pro-OtBu werden in 20 ml Essigester eine Stunde bei 0 und 20 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Es wird dann mit Essigester verdünnt, mit zu 50$ gesättigter Kaliumcarbonatlösung und mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Es resultieren 2,06 g eines dünnschlchtchromatographisch einheitlichen OeIs. Rf = 0,8 im System Chloroform-Methanol (l:l) an Silicagel.

5. H-Gly-Ala-Pro-OtBu

2,06 g Z-GIy-Ala-Pro-OtBu werden in 30 ml Methanol in Gegenwart von 300 mg Pd-Kohle (10$) bei Zimmertemperatur hydriert. Die Wasserstoffaufnahme ist nach 9° Minuten beendet. Es wird vom Katalysator abfiltriert und das Piltrat auf ca. 5 ml eingeengt. Man gibt 10 ml Aether zu. Ueber Nacht kristallisiert das Produkt aus. F. 132-134° ; Rf = 0,3 im System Chloroform-Methanol (l:l) an Silicagel.

6. Z-Val-Gly-Ala-Pro-OtBu

3,73 g Z-VaI-ONP und 2,99 g H-Gly-Ala-Pro-OtBu werden in 12 ml Essigester eine Stunde bei 0° und 20 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Nach dem Verdünnen mit Essigester wird mit zu 50$ gesättigter Kaliumearbonatlösung und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und am Wasserstrahl-

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vakuum bei 3° eingedampft. Das OeI wird aus.. Methanol Wasser kristallisiert. F. 73-75 < Im"Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist Rf = 0,42 im System Toluol-Aceton (l:l) und Rf = 0,46 im System Chloroform-Methanol (9:1).

7. H-VaI-GIy-Ala-Pro-OtBu '

533 mg Z-VaI-GIy-Ala-Pro-OtBu werden in 10 ml Methanol in Gegenwart von 300 mg Pd-Kohle (10$) bei Zimmertemperatur hydriert. Nach 20 Minuten ist die Wasserstoffaufnahme beendet. Es wird vom Katalysator abfiltriert und das Piltrat am Wasserstrahlvakuum bei 30 zu einem OeI eingedampft. Rf = 0/52 im System Chloroform-Methanol (l:l) an Silicagel.

8. H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-ⁱ Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH .

270 mg Z-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-GIn-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBut-Ala-Ile ^: GIy-OH werden in 30 ^ml 80^jLger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von 50 mg Pd-Kohle (lO^) hydriert, bis die Abspaltung der Carbobenzoxygruppe beendet ist. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird die Lösung im Hochvakuum bei 30 stark eingeengt und dann aus t-Butanol lyophilisiert. Die Ausbeute ist quantitativ.

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9. BOC-Cys-GIy-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-OH

l8l mg BOC-Cys-Gly-A sn-Leu-Ser (tBu) -Thr (tBu).-Cys-Met-Leu-Gly-OH werden in Ij.8 ml peroxidfreiem Tetrahydrofuran gelöst und bei -10 bis -15 unter Ueberleiten von Stickstoff mit 0,017 ml N-Methylmorpholin und 0,019 ml Chlorameisensäure -isobutylester versetzt. Nach 10 Minuten bei dieser Temperatur wird eine Lösung von 255 mg des unter 8) erhaltenen Octadekapeptidderivats in 5 ml 95$igem Dimethylformamid und 0,02 ml N-Methylmorpholin zugefügt. Man rührt noch 30 Minuten bei -10° und 2 Stunden bei 0°. Durch Zugabe von peroxidfreiem Aether wird das Rohprodukt ausgefällt, dieses wird nochmals in Dimethylformamid gelöst und durch Eintropfen in eiskalte 0,02-n. Salzsäure ausgefällt. Zweimaliges Umfallen aus Dimethylformamid-Essigester liefert ein reines Produkt. Im DünniSchiGhtp.hromatogramm an Silieagel ist Rf_52A = 0j43.

IQ /2197

r — —ι

10. BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu) -Cys-Met-Leu-Gly-Thr (tBu) -Tyr (tBu) -Thr (tBu) -Gin-Asp (OtBu) -Phe-Asn-Lys (BOG) -Pbe-His-Thr (tBu) -Phe-P ro-G In-Thr (tBu) -AIa-He-GIy-YaI-GIy-A la-Pro-Q tBu "

374 rag des unter 9) beschriebenen Peptidderivats, ΐβΟ rag H-YaI-Gly-Ala-Pro-OtBUj 46 mg Hydroxysuccinimid und 3 ml Dimethylformamid werden unter Stickstoff bei Baumtemperatur mit 62 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und über Bacht bei Raumtemperatur .stehen gelassen. Durch Versetzen mit Aether wird das Produkt ausgefällt, abflltriert und gut mit Aether und Essigester gewaschen. Das Produkt wird nochmals in Dimethylformamid gelöst und durch Eintropfen, in eiskalte 0,05-m. Zitronensäure gefällt.

ISQBTIO/21

Beispiel "J :

N- Acetyl-Calcitonin M

100 mg Calcitonin M -Acetat (oder -Hydrochlorid) werden in 5 ml Wasser-Dimethylformamid (2:1) gelöst, mit 77 μΐ einer 1Oxigen Lösung von p-Nitrophenylacetat in Dimethylformamid versetzt und durch Zugabe von 0,5 -m. wässeriger Triäthylaminlösung auf pH 9.» 1 gebracht. Bei diesem pH setzt die Reaktion ein und wird durch kontinuierliche Zugabe von Triäthylamin unter Konstanthalten des pHs in ca. 1 Stunde zu Ende gebracht. Man fügt sodann 150 μΐ Eisessig zu und extrahiert dreimal mit je 10 ml Essigester. Die wässerige Phase wird zur Trockne eingeengt und der Rückstand mittels Craig -Verteilung im System n-Butanol-Eisessig-Wasser (4:1:5) über I70 Stufen gereinigt. Aus den Verteilungselementen Nr. IO9-I38 (r = 122; K= 2,5) erhält man beim Einengen zur Trockne das reine N^-Acetyl-Calcitonin M als amorphes, wasserlösliches Pulver.

Im Dünnschichtchromatogramm an Cellulose ("Selecta") ist Rf₁₀₁A ⁼ °j 67; an Alumminiumoxid ("Alox" der Fa. Camag)

ist Rf = 0,68.

Bei der Elektrophorese auf Cellulose-Dünnschichtplatten ("Selecta") wandert die Substanz bei. I7¹VoIt/cm in 1 1/2 Stunden bei pH 1,9 2,6 cm zur Kathode, bei pH 8,0 0,6 cm zur Anode.

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BAD ORIGINAL

Beispiel 8 : · ^;

Mono- und diacetyliertes Calcitonin M

10'mg Calcitonin .M-Acetat werden in 2 ml absolutem Dimethylformamid gelöst,, mit 0,5 ml einer l^igen Lösung von. p-Nitrophenylacetat in Dimethylformamid versetzt, mit Stickstof f. gespült und das verschlossene Gläschen während 30 Min. "bei 40° stehen gelassen; Man gibt sodann 5 ml 2-n. Essigsäure zu, extrahiert das überschüssige p-Nitrophenylacetat und das gebildete ρ-Nitrophenol mit Essigester (2 χ 30 ml), dampft die wässerige Phase im Vakuum zur Trockne ein, löst wieder in 0,5 ml 95$iger Essigsäure und lyophilisiert. Das Produkt besteht aus einer Mischung von Mono- und Diacetylderivat, neben etwas Ausgangsmaterial. Das Monoacetylderivat ist wiederum ein Gemisch von N— und N^c-Derivat, wie sich in der Elektrophorese -bei pH .8 zeigt.

Die Auftrennung von Äusgangsmaterial, Mono- und Diacetylverbindung erfolgt in der Craig-Verteilung im System n-Butänol-Eisessig-Wasser(4:1:5)\» oder in einer praparativen Dunnschichtelektrophore.se auf Celluloseplatten ("Seleeta") bei pH 1,9 ( 11/2 Stunden bei 17 Volt/cm); Laufstrecken siehe unten. Das auf diese Weise' erhaltene Gemisch der beiden Monoacetylderivatevvird wiederum durch präparative Dünnschichtelektrophorese bei pH 8(Puffer: 0,1m. Triätylaminlösung mit

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Kohlendioxid auf pH 8 eingestellt^ 3 Stunden bei 17 Volt/cm) aufgetrennt. Für grössere Subs t-anzmengen wendet man die kontinuierliche, trägerfreie Elektrophorese an, ebenfalls bei pH In beiden Fällen verhält sich N -Acetyl-Calcitonin M elektrisch neutral, währenddem das. N^-Acetylderivat zur Anode läuft.

Die Verbindungen weisen folgende Rf-Werte auf: N^a-Acetyl-Calcitonin M auf "Selecta"-Cellulose : Rf = 0,67; auf Aluminiumoxid ("Alox" der Fa. Camag) ^Rf52 - 0

N -Acetyl-Calicitonin hat in beiden Systemen die gleichen Rf-Werte wie ^-Acetyl-Calcitonin M (Calcitonin M weist in diesen Systemen Rf\_01A = 0,56 und RiVp ^{= 0}^² auf); N , N -Diacety1-Calcitonin M zeigt in diesen beiden- Systemen Rf₁₀₁- - 0,75 und Rf₁T₂ = 0,73· Bei der Elektrophorese auf Cellulose-Dünnschichtplatten ("Selecta"),ist die Laufstrecke von N - und von N^-Monoacetyl-Calcitonin M = -2,6 cm bei pH 1,9; 90 Minuten; 17 Volt/cm; und die von N^a, N^S-Diacetyl -Calcitonin M unter gleichen Bedingungen - 1,3 cm (die von Calcitonin M -3,7 cm). Bei pH 8,'O wandert N^- Acetyl-Calcitonin M in 90 Minuten bei,17 Volt/cm + 0,6 cm, wahrend N^a-Acetyl-Calcitonin M (ebenso wie Calcitonin M) am Startpunkt bleibt.

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Beispiel 9: Das inf Beispiel 1 beschriebene Äusgangsmaterial BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thf-Cys-Met-Leu-Gly-OH kann auch wie folgt hergestellt werden:·

1. BOC-S er-Thr-OBzI

Man gibt zu einer Lösung von 73,8 g BOC-Ser-Oi^Dicyclohexylammoniumsalz in 5OQ ml Methylenchlorid 47,0 g H-Thr-OBzl, HCl in 3OO ml Methylenchlorid, rührt 10 Minuten bei Raumtemperatur und kühlt dann auf -5 · Bei dieser Temperatur tropft man eine Lösung von 40,1 g Dicyclohexylcarbodiimid in 9O ml Methylenchlorid zu. Man. rührt 3 Stunden bei -5° und die ganze Nacht bei Raumtemperatur. Mach Abfiltrieren des Dicyclohexylharnstoffs und Dicyclohexylamin-Hydrochlorids Viird die Lösung ausgeschüttelt, und zwar dreimal mit 0,1-n. ■ Salzsäure, zv/eimal mit 20^iger Kochsalzlösung, einmal mit lO^iger Natriumbicarbonatlösung und zweimal mit 20$iger Kochsalzlösung und über Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wird auf ca. 600 ml eingeengt, auf 5° gekühlt und von weiterem Dicyclohexylharnstoff abfiltriert.. Nach Eindampfen zur Trockne wird der Rückstand, zur Reinigung aus Essigester-Hexan kristallisierfc. :\ .--.. - " _-■_" ■■'.■-.■""".' '.'"■" F. liö-lil⁰; i<0$ =;-&,5° (c = 2 in Dimethylformamid);

2. H-Ser-Thr-OBzl, TFA

65,7 g BOC-Ser-Thr-OBzl werden gelöst in 100 ml QOJ&iger Trifluoresslgsäure und die Lösung eine Stunde-bei '20 ■belassen. Hierauf wird sie unter Rühren in lOOÖ ml trockenen Aether eingetropft, eine Stunde gerührt und über Nacht bei -10 stehen gelassen. Die entstandene Fällung wird abfiltriert und dreimal mit trockenem Aether-gewaschen und im Vakuum über Aetznatron getrocknet; F. 128-129 ; Rf^ = 0,65; Rf =.0,50 (an Silicagel).

3. BOC-Leu-Ser-Thr-OBzl

52,5 g H-Ser-Thr-OBzl, TFA werden in l45 ml Dimethylformamid gelöst und bei 0 mit einer Lösung von 48,0 g BOC-Leu-ONP versetzt. Man gibt alsdann 21 ml Triäthylamin und .0,75 ml Eisessig zu. Das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden bei 0 und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 2,1 Liter Essigester wird die Lösung ausgeschüttelt, und zwar zweimal mit Wasser,. ■ zweimal mit 0,1-n. Salzsäure, zweimal mit !Öliger Kochsalzlösung, achtmal mit 2Q$iger Kaliumcarbonatlösung, zweimal mit lO^iger und einmal mit 3°$iger

' Kochsalzlösung. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird die Lösung auf ca. 1,4 Liter eingeengt. Ueber Nacht im Eisschrank kristallisiert das geschützte Tripeptid

vom F. Il4-ll6°; [a]_ß = -l4° (c = 2 in Dimethylformamid); = 0,25 (an Silicagel).

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■"4. H -Leu -S er-Thr -ODz 1, TFA

46,1 g BOC-Leu-Ser-Thr-OBzI werden in 92,5' ml 90#iger Trifluoressigsäure gelöst und 1 Stunde bei 20° belassen. Darauf wird unter Rühren trockener Aether (925 ml) zugegeben, eine Stunde bei 0 gerührt und über Nacht bei -10 stehen gelassen. Die entstandene Fällung wird abfiltriert, dreimal mit trockenem Aether-gewaschen und im Vakuum über Aetznatron getrocknet; F. I68-I71⁰; Rf = 0,80 (an Silicagel).

5. BOC-Asn-Leu-Ser-Thr-OBzl

20,8 g BO-C-Ash-OH werden in 208 ml Acetonitril aufgeschlämmt, mit 22,7 g Woodward's Reagenz K versetzt und 30 Minuten bei 20 gerührt. Dann lässt man unter Rühren 12,6 mlTriethylamin so zutropfen, dass die Innentemperatur +32° nicht übersteigt, kühlt auf 20°, und rührt bei dieser Temperatur noch 50 Minuten. Die fast klare Lösung wird auf 0 gekühlt und mit einer ebenfalls auf 0 gekühlten Lösung von 39,1 g H-Leu-Ser-Thr-OBz1,TFA und 10,5 ml Triäthylamin in 257 ^l Dimethylformamid versetzt. Man ■ rührt das bald erstarrende Reaktionsgemisch über Nacht bei Zimmertemperatur, kühlt auf -10° ab und rührt noch 2 Stunden bei -10°. Hierauf nutscht man die kristalline Fällung ab und wäscht das Tetrapeptidderivat einmal mit kaltem Acetonitril, einmal mit Essigester und dreimal mit Wasser^bis es Chlorid-frei ist. Das erhaltene Produkt

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BAD ORIGJMAl

wird kristallisiert aus 370 ml Dimethylformamid, 3>7 ml Eisessig und 370 ml Acetonitril. F. 225-226°; [a]_D = -36° (c = 2 in Dimethylformamid); Rf^ = 0,85 (an Silicagel).

6. H-Asn-Leu-Ser-Thr-OBzl,TFA

32 g BOC-Asn-Leu-Ser-Thr-OBzI werden in I92 ml 90#iger Trifluoressigsäure gelöst und 45 Minuten bei 20 belassen. Darauf wird die Lösung auf ca. 40 ml eingeengt, unter Rühren mit 400 ml Aether versetzt und 20 Minuten bei 35° unter Rückfluss gerührt. Alsdann kühlt man die Kristallsuspension auf -10° ab und lässt über Nacht bei -10 stehen. Die Fällung wird abfiltriert, dreimal mit Aether gewaschen und in Vakuum über Aetznatron getrocknet. F. 125-127 ;

4 = °'33 (an Silicagel).

7. EOC-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-OBzl

26,3 g H-Asn-Leu-Ser-Thr-OBzI,TFA werden- in 100 ml Dimethylformamid gelöst, gekühlt auf 0 ,nacheinander mit 7V5 ml Triäthylamin', 0,54 ml Eisessig und einer Lösung von l4,4g BOC-GIy-ONP in 100 ml Dimethylformamid versetzt, bei Raumtemperatur gerührt, bis die Mischung erstarrt, und zwei Tage stehen gelassen. Alsdann gibt man unter Rühren 300 ml Essigester zu und lässt über Nacht bei -10 stehen. Die Fällung wird abfiltriert, zweimal mit Essigester und zweimal mit Aether gewaschen, eine halbe Stunde mit 200 ml

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1QAI5 1 ί - 146 - ^[Ό ' '

Wasser verrührt, abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. F. 227-228°; [a]_D = -23° (e = 2 in Dimethylformamid) ; Rf- = 0,50 (an Silicagel). . ■ ■

8. BOC-GIy-A sn-Leu-Ser-Thr-OH

17,-0 g BOC-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-OBzl werden in 340 ml Dimethylformamid unter Erwärmen gelöst. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur gibt man J>,K g lO^ige Palladium-Kohle zu und hydriert. Die Reduktion ist nach 4 Stunden vollendet. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird die Lösung am Hochvakuum eingeengt. Dreimaliges Verreiben mit Aether : liefert ein laut Dünnschichtchromatogramm einheitliches Pentapeptid. P. 181-I83⁰; [a]_D =-l6,5 (c = 2 in Dimethylformamid); Rf „ =.0,65·-. (an Silicagel).

9. BOC-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(BzI)-N H₀-Z "'.....

9,2 g H-CyS(BzI)-N₂H₂-Z^HCl werden in 3O.O ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst, mit' 12,2 g BOC-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-OH versetzt und bei Raumtemperatur bis zur Lösung gerührt. Sodann kühlt man die Lösung auf 0 ab, gibt 3-,2.8 ml Triethylamin und 4,88 g N-Hydroxysuccinimid in 100 ml Dimethylformamid zu, kühlt weiter auf -22° ab und gibt 4,36 g DiGyclohexylcarbodiimid in 30 ml Dimethylformamid zu. Man rührt eine Stunde bei -22°',- lässt alsdann die Innentemperatur allmählich steigen, und rührt noch 3 Tage bei Zimmertemperatur, filtriert von ausgefallenem Dieyclo-

1 9 A 1 5

hexylharn&toff ab und dampft am Hochvakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird verrührt mit einer Mischung von Essigester und 5/oiger Zitronensäurelösung, die Fällung abfiltriert, mit Wasser gewaschen, im Vakuum getrocknet, mit trockenem Aether verrührt, filtriert und im Hochvakuum getrocknet. F. 173-178° [α]_β = -25,5° (c -'2 in Dimethylformamid)'; Rf₁ = 0,21 (an Silicagel)..

10. H-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(BzI)-N₃H₃-Z,TFA

13 g BOC-GIy-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(BzI)-N₂H₂-Z werden gelöst in 13Ο ml 90$iger Trifluoresslgsäure und die Lösung wird 2 Stunden bei 22 stehen gelassen. Darauf wird die Lösung eingeengt und der Rückstand dreimal mit Aether verrührt und im Vakuum über Aetznatron getrocknet. F.. I59-I6I⁰. Rfg = 0,63 (an Silicagel).

11. BOC-Cys(Bzl)-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(BzI)-N₂H₂-Z

. 6,69 g BOC-Cys(BzI)-OSU und 12,2 g H-Gly-Äsn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-NpHp-Z, 1,22 TFA werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst. Aus einer Lösung von 15Ο mMol Triäthylamin in 100 ml Dimethylformamid wird unter Rühren soviel Triäthylamin zugetropft, bis das Reaktionsgemisch auf feuchtem Indikatorpapier einen pH-Viert von 6,4 zeigt. Die Lösung wird 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt, darauf

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am Hochvakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird zv/eimal mit 3OO ml Essigester verrührt., ansehliessend dreimal mit einer Mischung von 15O ml Essigester und 30 ml 5Joiger Zitronensäurelösung, abfiltriert-, im Vakuum getrocknet und aus Dimethylformamid-Essigester kristallisiert. Pr 19I-I93⁰; [a]_D = -31,5° (c = 2 Dimethylformamid); Rfg = 0,35 (an Silicagel).

12. BOC-Cys-GIy-Asn-Leu-Ser-Thr-CyS-N₂H- =

β g BOC-Cys(Bzl)-GIy-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(BzI)-N₃H₂-Z werden bei -40 in 7-00 ml trockenem flüssigem Ammoniak gelös.t, Unter Rühren werden beim Siedepunkt des Ammoniaks 973 ^mS Natrium in solcher Weise zugegeben, dass die Farbe des Reaktionsgemisches nur hellblau -wird. Nach 25 Minuten ist die Reduktion vollendet. Man-rührt noch 10 Minuten unter Beibehalten der Blaufärbung, gibt alsdann '2,4 ml Eisessig zu und dampft am Hochvakuum (ca. 1 mm) zur Trockne ein. Der Rückstand wird mit 12 ml V/asser, 3.»2 ml Eisessig und 20 ml Essigester während einer Stunde bei 0 verrührt, die Fällung abfiltriert,.zweimal mit 10 ml l$iger Essigsäurelosung und einmal mit 10 ml Essigester gewaschen und im Hochvakuum getrocknet.
-Rf₁. = 0,65 (an Silicagel).

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13, BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-CyS-N₃H

1,0 g BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-NgH wird gelöst in 100 ml Dimethylformamid und 5OO ml Wasser,, das 1,23 mAeq. Chlorwasserstoff enthält. Mit 3,7 ml einer 0,43-n. Kaiiumhydroxydlösung wird der pH-Wert der Lösung auf 6,8 eingestellt. Unter Beibehalten dieses pH-Wertes werden innerhalb 9° Minuten unter Rühren gleichzeitig zugetropft 247 ml einer 0,01-m. Kaliumferricyanidlösung und 4,9 Wl einer 0,43-n. Kaliumhydroxylösung. Man rührt noch 9° Minuten bei Raumtemperatur, bringt alsdann mit 0,7 ml Eisessig den pH-Wert der Lösung auf 4,0. Darauf wird die Lösung mit 50 ml Dowex-2-X8, Acetatform, anschliessend mit 13 ml Dowex-50W-X8, H -Form, gerührt, filtriert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 50$igem t-Butanol gelöst, lyophilisiert und im Hochvakuum getrocknet. Das Produkt enthält ca. 15$ Kaliumacetat. Es ist einheitlich in Dünnschichtchromatogramm an Silicagel:

Rf₅ = 0,63; Rf₆ = 0,70; Rf₇ = 0,75.

14. H-Leu-Gly-OEt,HCl

Man löst 14 g Z-Leu-Gly-OEt [dargestellt nach J.R. Vaughan & R.L. Osato, J.Am.Chem.Soc. 7^, 5553 (1951)] in 15O ml absolutem Aethanol, versetzt mit 11,5 ml einer 6,9-n· Chlorwasserstofflösung in Aethanol und hydriert in

Gegenwart von 2,8 g Palladium-Kohle (lO$ Pd). Nach 1. Stunde wird vom Katalysator abgenutscht und im Vakuum bei.40 Badtemperatur eingedampft. Der Rückstand ist ein OeI und wird direkt weiter verarbeitet. Rf, = 0,50 (an Silicagel).

15. BOC-Met-Leu-Qly-QEt

10,5 g BOCUMet-NgH in 100 ml Dimethylformamid werden bei 0 mit l4,8 ml Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran (5,39-n; 80 mMol), anschliessend bei -20° mit"5,4 ml iso-Amylnitrit versetzt. Nach 5 Minuten bei -20 wird eine vorgekühlte Lösung von 10,1 g H-Leu-Gly-OEtjHCl und 16j9 ^ml Triäthylamin in·100 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 3 Tage bei 0 belassen. Dann wird vom-ausgeschiedenen Triäthylamin-Hydrochlorid ab- · filtriert und das Piltrat im Hochvakuum zur Trockne eingedampft. Man löst den Rückstand in Essigsäureäthylester und wäscht die Lösung nacheinander mit 3 Portionen verdünnter Zitronensäurelösung, 3 Portionen verdünnter Natriumbicarbanatlösung und mit Wasser. Das nach dem Trocknen und Eindampfen der Lösung erhaltene Rohprodukt wird aus Essigester-Hexan kristallisiert. F. 118-119°; [a]_D =-30° (c = 2 in Dimethylformamid)1 Rf,- 0,72 (an Silicagel). " '_-"■;

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16. BOC-Met-Leu-GIy-OH ·

9,98 g BOC-Met-Leu-Gly-OEt werden in 3OO ml Methanol gelöst. Innerhalb 45 Minuten tropft man bei Raumtemperatur 57 ml 0,59-n. Natronlauge zu und rührt noch 1 Stunde. Alsdann wird mit 0,68-n. Salzsäure der pH-Wert auf 7 gestellt und die Lösung zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Essigester und Wasser gelöst, und der pH-V/er t mit 0,68-n. Salzsäure auf 2 gebracht. Die wässerige Phase wird mit Essig- ' ester ausgeschüttelt. Die vereinigten Essigester-Phasen v/erden mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird aus Esslgester-Hexan kristallisiert.

F. 137-138°; [a]_D = -31° (c = 2 in Dimethylformamid); Rf₇ = 0,74 (an Silicagel).

17. H-Met-Leu-GIy-OH

6,9 g BOC-Met-Leu-Gly-OH werden in 70 ml 90$iger Trifluoressigsäure gelöst und 1 Stunde bei 20° stehen gelassen. Darauf wird die Lösung eingeengt, unter Rühren mit 150 ml Aether versetzt und über Nacht bei -10° stehen gelassen. Die entstandene Fällung wird abfiltriert und aufs neue mit 100 ml Aether verrührt, abfiltriert, zweimal mit Aether gewaschen und im Vakuum über Aetznatron getrocknet. F. 134-135°; Rf₇ = 0,52 (an Silicagel).

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BAD ORIGINAL,

l8. BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-OH

/::1 8OO mg BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-CyS-N₂H [enthält

Kaliumacetat"-] werden in 15 ml Dimethylformamid aufgeschlämmt und 15 Minuten bei 45 gerührt; ein Teil der Suspension geht in Lösung. Nun kühlt man auf 0° ab und gibt zuerst I,45 ml Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran (2,0-n).. zu,- kühlt weiter auf -20 ab und gibt alsdann 0,114 ml iso-Amylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei -20° versetzt man mit 0,24 ml Triäthylamin und gibt anschliessend eine vorgekühlte Lösung von 431 mg H-Met-Leu-GIy-OH, Oj57 TFA in 5 ml Dimethylformamid zu. Von einer verdünnten Triäthylaminlösung in Dimethylformamid wird soviel Triäthylamin zugetropft bis-das Reaktionsgemisch auf: feuchtem Indikatorpapier einen pH-Wert von β zeigt. Die trübe Lösung wird 3i Tage bei 0 belassen, alsdann von der entstandenen Fällung abfiltriert. Das Filtrat wird am Hochvakuum zur Trockne eingedampft; der Rückstand dreimal mit lO^iger Zitronensäurelösung verrührt, das erhaltene Produkt abfiltriert und im Hochvakuum getrocknet.

= 0,68; Rf = 0,75 (an Silicagel). ·

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Beispiel 10 :

N^a-Palmitoyl-Cys-GIy-Asπ-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr -Gin -Asp -Phe -Asn -Ly s -Phe -Hi s -Thr -Phe -Pro -Gin -Thr -Ala-lie Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH^C^-Palmitoyl-Calcitonln M).

171 mg N -Palmitoyl-Cys-Gly-Äsn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Le_u-GIy-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys-(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Prο-GIn-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-GIy-AIa-Pro-NEL werden mit 5 ml eiskalter, analysenreiner, konzentrierter Salzsäure versetzt, bei 0 gerührt his zur Lösung (ca. 2 Min.) und die Lösung hierauf unter Stickstoff weitere 8 Min. bei 0 belassen. Hierauf befreit man vom gasförmig gelösten' Chlorwasserstoff durch 1-minütiges Evakuieren bei 0,01 Torr., gibt dann 100 ml t-Butanol zu und lyophilisiert. Man erhält dabei 138 mg salzsaures Salz des N -Palmitoyl-Calcitonins M als farbloses Pulver. Bei Dünnschichtchromatographie auf Aluminiumoxid .("Alox") zeigt das Produkt Rf^ = 0,52,Rf"= 0,?6. Das Produkt zeigt im Test nach Kumar gegenüber Calcitonin M eine deutlich verlängerte Wirkung.

Das als Ausgangsmaterial verwendete, geschützte N^a-Palmitoyl-Dotriaeontapeptidamid kann folgendermassen hergestellt werden:
1. Palmitinsäure-p-nitrophenylester (PaI-ONP= Hexadekansäure-p-

nitrophenylester);

• Zu 5,0 g p-Nitrophenol in 6o,ml Chloroform-Aether(l;l) wer den unter Eiskühlung zunächst g_sk g Palmitylchlorid und dann

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•5,0 ml Triethylamin gegeben,. Nach 2 Stunden Kochen unter Rückfluss wird in Essigester aufgenommen und die organische Phase mit 0,5 ⁿ· Pottasche und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat ge- , trocknet und eingedampft. Bei Kristallisation aus Aether-'" Petroläther erhält man Blättchen vom P. 64-65 ·

2. Pal-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe

1,32 g H-CyS(TRI)-GIy-ASn-LeU-OMe und 78O mg Palmitlnsäure-pnitrophenylester werden in 20 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst und 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Aus dem nach Abdampfen des Lösungsmittels resultierenden Rohprodukt wird durch Umfallen aus Methanol die Verbindung in, dünrischichtchromatographisch reiner Form erhalten.

3. Pal-Cys(TRI)-GIy-ASn-LeU-NH-NH₂

Zu 1,35g Pal-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe in 40 ml Methanol werden 4,0 ml Hydrazinhydrat gegeben und die Lösung 24 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Am Rotationsverdampfer wird dann bei 25° auf ca. 20 ml eingeengt und 150 ml 0,5 n. Essigsäure zugegeben. Das ausgefallene Produkt wird abfiltriert, mit kaltem Wasser gewaschen und über Aetzhatron getrocknet. Im Dünnschicht ehr omatogramm an Silicagel zeigt das Produkt Rf,_Q0 = 0,45·

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4 . Pal -Cys -(TRI) -G-Iy-Asn-Lc-,ι-Ser (tBu) -Thr (tRu) -Pys (TRI) -Met-Leu-GIy-OH

1,θ8 g Pal-Gys-(TRI)-GIy-Asn-Leu-NH-NHg in 10 ml Dimethylformamid werden bei -15° mit 1,5 ml 2,0 η. Chlorwasserstoff in Essigester und 0,17 ml t-Butylnitr.it versetzt. Nach 15 Minuten Stehen bei -10° wird eine auf -10° gekühlte Lösung von 98Ο mg H-Ser (tßu)-Thr (tBu)-CyS-(TRI)-Ket-Leu-GIy-OiI und Ο/56 ml Triäthylamin in 10 ml Dimethylformamid zugetropft. Nach einer Stunde Stehen bei -10 und 15 Stunden bei 0 werden 30 ml Methanol zugegeben und das ausgefallene Produkt wird abfiltriert, mit kaltem Methanol gewaschen und bei 40 am Hochvakuum getrocknet. Das resultierende Pulver wird dreimal mit je 10 ml Wasser verrieben und dann über Aetznatron getrocknet. Umfallen ■ aus Dimethylformamid-Methanol liefert das Produkt.dünnschichtchromatographisch rein.

5. Pal-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu -GIy-OH

Eine Lösung von 670 mg Pal-Cys(TRl)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr-(tBu)-Cys(TRl)-Met-Leu-Gly-OH in 50 ml Dimethylformamid wird bei Raumtemperatur innert 20 Minuten zu einer stark gerührten Lösung von 1,0 g Jod in 150 ml Methanol getropft. Es wird noch eine Stunde gerührt und dann die Reaktionslösung bei 0° durch tropfenweise Zugabe von 1-n. wässerigem Natriumthiosulfat entfärbt. Die klare Lösung wird zunächst am Wasserstrahl-, dann am Hochvakuum bei J>0 auf ca. 10 ml eingeengt, mit 200 ml Aether-Petroläther (1:1) versetzt und abdekantiert. Der Rück-

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BAD

stand wird nach kurzem Trocknen am Wasserstrahlvakuum dreimal mit je 10ml Wasser verrieben und über Aetznatron getrocknet. Zur Reinigung wird aus Chloroform-Petrolaether umgefällt. Tm Dünnschichtchromatogramm an Silicagel ist RfV-z = 0,50.

6.N^a-Pal-Cys-Gly-Asn-Le u-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Le u-Gly-Thr(tBu) -Tyr-(tBu)-Thr(tBu)-GIn-Asn-(QtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gin-Thr (tBu)-Ala-He-GIy-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂.

Zu einer Lösung zu 4l8 mg N -Pal-Cys-Gly-Asn-Leu-SerCtBu)-Thr (tBuJ-Cys-Met-Leu-Gly-OH, 290 mg des in Beispiel 2 sub 44 beschriebenen geschützten DOCosapeptidamids und 110 mg N-Hydroxysuccinimid in 15 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gibt man unter Rühren und Erwärmen auf 45 Ij55 mg" Dicylohexylcarbodiimid. Man rührt noch" 3 Stunden unter Stickstoff weiter_bei 45°, gibt dann nochmalsjeJO mg N-HydroxysUcciimid und Dicyelohexylcarbodiimid zu und rührt weitere 4,5 Stunden bei 45 . Dann kühlt man auf 0° und giesst in 300 ml eiskalten, peroxydfreien Aether, Nach 12 Stunden bei 0 nutscht man den Niederschlag ab, wäscht ihn / mit Aether und -trocknet in Vakuum bei 4o°. Zur Reinigung löst man das Produkt in Methanol-Chloroform (l:l) und chromatographiert in diesem Lösungsmittelgemisch aufsteigend an einer Säule von "Sepbadex" LHp₀. derDimension 110 χ 4,2 cm. Es werden PraktiOnen: ä 3 ml aufgefangen und dünnschichtchromatographiseh geprüft» Bei Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten·/ist

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Beispiel l3. ί

^-Lauryl-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH₀(N^a-Lauryl-Calcitönin M).

7 mg N^α-L·auryl-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBuj-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys (BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-Äla-Ile-Gly-Val-Gly-AIa-Pro-NHρ werden unter Rühren zu 0,42 ml eiskalter, analysen-.-reiner, konzentrierter Salzsäure gegeben und unter Stickstoff 10 Minuten bei 0° gerührt. Dann wird zur Entfernung des gasförmig gelösten Chlorwasserstoffs 1 Minute bei .0° und 0,01 Torr. gehalten, hierauf 6 ml t-Butanol zugegeben und das Gemisch lyophilisiert. Man erhält 5 mg Monohydrochlorid von N -Lauryl-Calcitonin M.

In der von Kumar et al. (J. Endocrinology, ^, 469 [1965])angegebenen Testierungsanordnung zeigt das Produkt eine gegenüber Calcitonin - verlängerte Wirkung.

Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:

1. ■Laurinsäure-p-nitrophenylester, (Lau-ONP - Dodekansäure-p-Nitrophenolester)

Die Verbindung wird nach dem gleichen Verfahren^ wie ■" für den Palmitinsäure-p-nitrophenylester im Beispiel 10. beschrieben, aus 5,0 g p-Nltrophenol und J,2 g Laurylchlorid hergestellt. 10 9 810/2197

1 9 A 1 5 11

2. Lau -Cys (TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe

.. 1*5 S Laurinsäure-p-nitrophenylester und 1,65 g H-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-QMe werden in 25 ml Dimethylformamid während 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Abdampfen ~ des Lösungsmittels und Umfallen aus Methanol liefert das im Dünnschichtchromatogramm einheitliche Produkte Rf,_ " = 0,60 an Silicagel. . '

3. LaU-CyS(TRI)-GIy-ASn-LeU-NH-NH₂ _.".;. .

1,0 g Lau-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-OMe werden in 40 ml Methanol und 4 ml Hydrazinhydrat 24 Stunden bei Raumtemperatur zum Hydrazid umgesetzt. Die Isolierung erfolgt duch Einengen der Lösung und Fällen mit 0,5 ⁿ· Essigsäure* Rf-, „^ = 0,40 an Silicagel.

4.* Lau-cys(TRI) -Gly-Asn-Leu-Ser(tBu) -Thr(tBu) -Cys (TRI) -Met-Lsu-Gly-CH

1,42 g Lau-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-NH-NH , gelöst-in-10 ml Dirnethylformamidj werden bei -15 mit 1,38 nil 2 ϊΐ. Chlorwasserstoff in Essigester und 0,14 ml t-Butylnitrit versetzt. Nach 15 Minuten Stehen bei -10° werden die auf -10 gekühlte Lösung von 965 mg H-Ser_J(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRl)-Met._: Leu-Gly-OH und 0,525 ml Triethylamin in 10 ml Dimethylformamid zugegeben und eine Stunde bei -XO⁰ und 15 Stunden bei 0 stehen gelassen. Das aus der Reaktionslösung als Gel ausgeschiedene-Produkt wird durch Zugabe von BQ. ml Methanol vollständig aus-

■■ ■".""■■.'. - - 109310/2197 . . - ■- "".· ." \- ' -"

gefällt, abfiltriert und dreimal mit je 10 ml Wasser verrieben und über Aetznatron getrocknet. Zur Reinigung wird aus heissem Methanol umgeiöst.

5. Lau-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu. )- rhr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-OH

Zu einer gerührten Lösung von 1,0 g Jod in I50 ml Methanol werden bei Raumtemperatur 700 mg Lau-Cys(TRl)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Me.t-Leu-Gly-OH in 50 ml Dimethylformamid innert 20 Minuten getropft und dann noch eine Stunde weiter gerührt. Zur Beseitigung des überschüssigen Oxidationsmittels wird bei 0 tropfenweise 1 n. Thiosulfatlösung zugegeben und dann am Wasserstrahl- und Hochvakuum auf ca. 10 ml eingeengt. Durch Zugabe von 200 ml Aether-Petroläther (1:1) wird ausgefällt, der getrocknete Niederschlag dreimal mit Wasser verrieben, über Aetznatron getrocknet und zur Reinigung aus Chloroform-Petroläther umgefällt.

6. N^a-Lauryl-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu) -Tyr(tBu)-Thr (tBu) -Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys (BOC) -Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-Ala-lie-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH_g

Man rührt ein Gemisch von 35 mg des im Beispiel 2 sub beschriebenen geschützten Docosapeptidamids, 24 mg N -Lauryl-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-GIy-OH, 6 mg N-Hydroxysucci nimid und 0,8 ml Dimethylformamid 1 Stunde unter Stickstoff bei 50 , gibt dann 6 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu, rührt weitere 2 Stunden unter Stickstoff bei 50°, gibt nochmals

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- 16O -

je 3 mg N-Hydroxy-suecinimid und Dicyclohexylcarbodlimid zu .' und rührt noch 8 Stunden bei 50 - unter Stickstoff." Dann giesst man das gesamte Gemisch in 60 ml peroxydfreiem Äetherj lässt . 18 Std. bei 0 stehen, filtriert den feinen Niederschlag ab" und trocknet ihn im Vakuum bei 4o°. Ran erhält 30 mg des rohen geschützten N -Lauryl-dotriacontapeptidamids. Zur Reinigung löst man das Rohprodukt in Methanol-Chloroform (1:1) und chromatographiert aufsteigend über eine im gleichen Gemisch bereitete Säule.(1,5 x 30 cm) von Sephadex LH 20. Man fängt Fraktionen a 3 ml auf, dampft sie einzeln ein und prüft auf Reinheit durch Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten (Rf^₂A ⁼ °'55). Man erhält 15 mg gereinigtes, geschütztes Dotriacontapeptidamid. *-—^; '■ ■—

109810/2197

Beispiel 12 :

H-Cys-GIy-Asn -Le u-Ser-Thr-Cys-Me t-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-GIn-Asp-Phe-Asn -Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gin-Thr-Ala-lie-GIy-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂ (Calcitonin M)

32 nigBOC-Qys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr.(tBu) -Cys-Met-Leu-Gly-Thr (tBu ) -Tyr (tBu) -Thr (tBu) -Gin-Asp (OtBu) -Phe -Asn-Lys (BOC ) Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-

Ala-Pro-NH_p werden in gleicher Weise wie im Beispiel 2

beschrieben von den Schutzgruppen befreit. Das erhaltene Acetat von Calcitonin M verhält sich dünnschichtchromatographisch und elektrophoretisch gleich, wie das in Beispiel 2 beschriebene Produkt. Bei Dünnechichtchtomatographie auf Aluminiumoxid "Alox"

(Camag) ist Rf₅₂ = 0,48; Rf₄₅ = 0,4l; Rf₇₉ =.0,55.

Bei Dünnschichtchromatographie auf Cellulose (Selecta-Fertig-

platten S+S Nr. l44o) ist Rf_101A = 0,54; Rf^ = 0,40.

In- der Elektrophorese auf Cellulose (Selecta-Fertigplatten Nr. l440) ist die Wanderungsstrecke zur Kathode bei 280 V In 1,5 Std.

bei pH 9,10 = 4,0 cm, bei

pH 4,85 = 4,2 cm. .

Das als Ausgangsmaterial verwendete geschützte Dotriaconta-

peptidamid kann wie folgt hergestellt werden:

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1. BOC-Cys(TRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOG)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gin-Thr(tBu)-Ala-Ile-Glyr- · VaL-GIy-AIa-PrO-NH₂ ■ , ·

125,6mg BOC-CysCTRI)-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu>-Cys(TRi)-Met-Leu-GIy-OH und 189,0 mg H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr-(tBu)-GIn-ASp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln~Thr(tBU)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH werden zusammen mit 31,²I- mg N-Hydroxysuccinimid in 2,5 ml Ν,Ν-Di-methylform-

amid unter Stickstoff aufgeschlämmt. Man gibt 37 mg Dicyclo- ' hexylcarbodiimid in 1 ml Dimethylformamid. zu und rührt 4,5 Std. bei 45 · Dann giesst man den Ansatz in 250 ml gerührten absoluten Aether, filtriert den flockigen Niederschlag ab und wäscht ihn mit Aether. Man erhält 31**· mg des in Methanol schwerlöslichen Produkts.
Im Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel ist Rf₁₀₀ =0,51*

Rf₁₀₇ = 0,77; Rf_52A = 0,56; Rf_43E = 0,65.

2. BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtSu)-Phe-Asn-Lys(tBu)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-GIy-AIa-PrO-NH₂

219 mg des unter 1 beschriebenen geschützten Dotriaicontapeptidamids werden in warmem Dimethylformamid gelöst und nach Abkühlen auf Raumtemperatur in 30-Minuten in eine Lösung von

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124 mg resublimiertem Jod in 30 ml Methanol eingetropft. Nach zweimaligem Spülen mit je 2,5 ml Dimethylformamid wird noch 1 Stunde bei Zimmertemperatur gerührt und dann bei 0 1,25 ml 1-n. wässerige Natriumthiosulfatlösung langsam zugetropft, bis die Lösung beinahe farblos ist. Anschliessend werden 0/05. ml wässerige 2-n, Natronlauge zugefügt und am ■ Vakuum auf ca. 1/3 Volumen eingeengt. Die Lösung wird in 450 ml peroxydfreien Aether eingerührt und der Niederschlag filtriert. Dieser Filtrationsrückstand wird direkt einer Gegenstromverteilung um System Methanol/Puffer/Chloroform/Tetrachlorkohlenstoff 11:3:6:7 unterworfen (Puffer wie in Beispiel 1 unter l8). Nach 280 Stufen befindet sich die Substanz in den Gefäss'en 100 bis 132. Sie wird isoliert und im gleichen System erneut,über 5βθ Stufen verteilt. Das mittels Dünnschichtchromatographie lokalisierte Produkt wird isoliert (K = 0,69) und im Hochvakuum bei 40 vom Ammoniumacetat befreit. Im Dünnsehichtchromatogramm an Silicagel ist ^ Rf₁₀₀ = 0,35; Rf₈₇ = 0,66; Rf₄₃₅, = 0,59·

Beispiel 13 : '

Das "im Beispiel 2 als Ausgängsmaterial verwendete geschützte Calcitonin M kann aus den Fragmenten 1 - 28 + 29 - 32 wie folgt aufgebaut werden:

1. BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-GIy-QH

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8βθ mg BoC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-f!ir(tBii)-Cys-Met-Leu-Gly-OH in 7 ml Dimethy!formamid werden bei 0° mit 0,1 ml Triäthylamin und 292 mg Trichloressigsäure-pentaehlorphenylester versetzt und eine Stunde bei 0° unter Stickstoff gerührt. Nun gibt man 1,627 S H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-ThrCtBu)-Phe-Pro-Gl·n-Thr(tBu)-Ala-Il·e-Gly-OH · (aus 1,75 g der im Beispiel 1, unter 4-9 beschriebenen Carbobenzoxy-Verbindung durch Hydrierung in 80^iger Essigsäure hergestellt),; .0,0-9-ml Triäthylamin und 7 ml Dimethylformamid hinzu und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Das nach Eintropfen in eiskalte 0,02 n. Salzsäure ausgefällte Rohprodukt wird durch Gegenstromverteilung im System Methanol-Puffer-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (11:3:6:7, Puffer wie in Beispiel 1 unter l8) gereinigt. Verteilungskoeffizient K = 0,8. Die das Octacosapeptidderivat enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, die Lösung stark eingeengt und aus t-Butanol lyophilisiert. Das reine Produkt weist im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel Rf₄₅ = 0,33, Rf₁₀₀ = 0,35 und Rf₁₁₅ = 0,48 auf. .

2. BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His"-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-PrO-NH₂

50 mg BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-SeritBui-ThritBuy-Cys-Met-Leu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(otBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Ile-GIy-OII und 27 mg

H-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₀(Beispiel 2 unter 42) werden in 1 ml

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-■1.65 -

Dimethylformamid gelöst. Zur Lösung gibt'man 2,9 mg N-Hydroxysuccinimid und 8,3 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt die Lösung während 2 Stunden unter Stickstoff. Dann- fügt man weitere 1,7 mg N-Hydroxysuecinimid und 5*5 mg Dicyclohexylcarbodiimid zu (beides gelöst in je 0,1 ml Dimethylformamid) und rührt weitere 3 Stunden bei 45 . Hierauf giesst man die klare Lösung in 50 ml Aether, nutscht die Fällung ab, ■ trocknet, zerreibt in wenig Wasser, nutscht ab und fällt das noch feuchte Pulver aus Methanol-Wasser um. Dadurch wird das im Rohprodukt vorhandene, überschüssige Tetrapeptidderivat abgetrennt. Das erhaltene geschützte Calcitonin M zeigt die im Beispiel 2 unter 45 angegebenen Rf-Werte.

Die Abspaltung der Schutzgruppen geschieht wie in Beispiel 2 beschrieben. Das erhaltene, freie Calcitonin M. enthält Spuren des Sulfoxidderivates, ist sonst aber rein. Die biologische Aktivität des Produktes beträgt 80 E/mg.

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   l^; oder entsprechende Verbindungen, in Vielehen einer oder mehrere der Asparagin- und Glutaminreste durch den Asparaginsäure- bzw. Glutaminsäurerest und/oder der .'■--_ Asparaginsäurerest durch den Asparaginrest ersetzt sind, ihre Dimeren und Derivate der monomeren oder dimeren Peptide sowie Säureadditionssalze und Komplexe der mono- oder dimeren Peptide und ihrer Derivate nach an sich bekannten Methoden herstellt.

   2. . Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man .

   (l) aus Verbindungen der Formel I oder den genannten Analogen oder Derivaten oder Dimeren dieser Verbindungen , · in welchen Verbindungen mindestens eine Aminogruppe oder eine Carboxylgruppe durch eine abspaltbare Schutzgruppe geschützt ist, die Schutzgruppe(n) abspaltet oder

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   - 161 -

   (2) Verbindungen der Formel II

   H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-G In-Asp -Phe -A sn -Ly s -Phe -His -Thr-Phe -Pro -Gln-Thr-A la Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-OH II

   oder die genannten Analogen oder Derivate, worin die Mercaptogruppen frei oder durch die Tritylgruppe geschützt sind, zu Disulfiden oxydiert oder

   (3) Verbindungen der Formel III oder IV

   S-CH

   R-CH-CO-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-OH R-CH-CO-GIy-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-A

   III IV

   worin A 1 bis 21 der auf Cystein folgenden Aminosäurereste mit gegebenenfalls geschützter Seitenkettenaminogruppe und R Wasserstoff oder eine acylierte Amlnogruppe darstellt, mit der restlichen C-terminalen Sequenz des Peptids mit gegebenenfalls geschützter Seitenkettenaminogruppe bis zur C-terminalen Aminosäure (L-Prolin) nach in der Peptidsynthese bekannten Methoden kondensiert mit der Massgabe, dass eine von einer aktivierten Carbonsäuregruppe ausgehende Methode wie die Azidmethode, die Anhydridmethode oder die Methode der aktivierten Ester

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   angewndet wird, wenn die C-terminale Sequenz eine freie Carboxylgruppe aufweist und,
   ■-wenn erwünscht, erhaltene freie Verbindungen in ihre Derivate und/oder Säureadditionssalze, oder Komplexe überführt. ."...--,. -

   3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, zur Herstellung neuer Peptide nach einem in der Beschreibung hervorgehobenen Verfahren.

   4. Verfahren nach einem der Ansprüche l-3> - -. ' dadurch gekennzeichnet, dass man von Verbindungen ausgeht, in welchen die Carboxylgruppen durch die tert.- ·, Butylestergruppe geschützt sind.

   5· Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass man von Verbindungen ausgeht, in welchen die Aminogruppen durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe geschützt sind. .

   6. Verfahren nach einem der Ansprüche l-5> dadurch gekennzeichnet, dass man von Verbindungen ausgeht, in welchen die Hydroxylgruppen in den Seitenketten durch die tert.-Butyläthergruppe geschützt sind.

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   7. Verfahren zur Herstellung neuer Peptide wie in den schematischen Darstellungen gezeigt oder in den Beispielen geschrieben,

   8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - T * dadurch gekennzeichnet, dass man das C-terminale Amid der Verbindung der Formel I oder therapeutisch anwendbare Saureadditionssalze oder Komplexe davon herstellt.

   9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 ~7, da-

   15 ^2
   durch gekennzeichnet, dass man das. Asp , Pro^ -Dimamid

   der Verbindung der Formel I oder therapeutisch anwendbare Saureadditionssalze oder Komplexe davon herstellt.

   10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - T» dadurch gekennzeichnet, dass man.N -Acylderivate des C-terminalen Amids der Verbindung der Formel I oder therapeutisch anwendbare Saureadditionssalze oder Komplexe dieser Verbindungen herstellt.

   11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - ¹J» dadurch gekennzeichnet, dass man das N^a-Acetylderivat des C-terminalen Amids der Verbindung der Formel I oder therapeutisch anwendbare Säureadditionssalze oder Komplexe davon herstellt.

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   194151T

   12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass man das Desaminoderivat des C-terminalen Amids der Verbindung der Formel I oder therapeutisch anwendbare Säureadditionssalze oder Komplexe davon herstellt.

   13... Verfahren nach einem der Ansprüche .1 - 12, dadurch gekennzeichnet, dass man das als Ausgangsmaterial verwendete geschützte Dotriacontapeptid oder Dotriaeontapeptidamid durch Kondensation des geschützten N-terminalen Decapeptids mit dem geschützten C-terminalen Docosapeptid oder Docosapeptidamid herstellt.

   14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 12,- dadurch gekennzeichnet, dass man das als Ausgangsmaterial verwendete geschützte Dotriacontapeptid oder Dotriaeontapeptidamid durch Kondensation des geschützten N-terminalen Qctacosapeptids mit dem C-terminalen Tetrapeptid oder Tetrapeptidamid herstellt.

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   - 171 -

   Peptide der Formel I

   H-Cys'-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-GIy-VaI-Gly-Ala-Prο-OH

   und entsprechendenVerbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparagin- und Glutaminreste durch den Asparaginsäurebzw. Glutaminsäurerest und/oder der Asparaginsäurerest durch den Asparaginrest ersetzt sind, ihren Dimeren und Derivate der mono- oder dimeren Peptide, sowie Säureadditionssalze und Komplexe.der mono- oder dimeren Peptide oder ihrer Derivate.

   l6. Das Dotriacontapeptidamid der Formel

   I I

   H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-

   Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH₂

   und seine therapeutisch anwendbaren .Säureadditionssalze und Komplexe.

   17. ^-Acyl-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-GIy-Thr-Tyr-Thr-Gin-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-Hi s-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHg . -

   und seine therapeutisch anwendbaren Saureadditlonssälze

   und Komplexe.

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   18. N^Acetyl-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cy/S-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Prο-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHp und seine therapeutisch anwendbaren Saureadditionssalze und Komplexe« -

   19· Das a-Desaminoderivat der Verbindung von Anspruch 17j und seine therapeutisch anwendbaren Saureadditionssalze und Komplexe.

   15 ^2

   20. Das Asp , Prcr . -dimaid der Verbindung der Formel I von Anspruch 16, und seine therapeutisch anwendbaren Saureadditionssalze und Komplexe.

   21. Die in den Beispielen beschriebenen,Peptide.

   ²²· BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr-(tBu)-Cys-Met· Leu-GIy-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-lie GIy-VaI-GIy-AIa-PrO-NH₂.

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   19415

   23■ BOC-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met -Leu-Gly-Thr -Tyr-Ihr-Gin-As ρ (CtBu) -Phe-Asn-Lys (BOC ) -Phe -HIs -Thr Phe -Pro -Gln-Thr-Ala -He -GIy -VaI -GIy -Ala -Pro -

   ²^ · BOC -Cys -GIy -Asn-Leu-Ser (tBu) -Thr (tBu) -Cys -Me t Leu-Gly-OH, - '

   Γ — 1

   25- BOC-Cys-Gly-Äsn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-leu-Gly-OH.

   26. H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-OH und seine Derivate, in welchen die Amino- und/oder Carboxylgruppe und/oder Hydroxylgruppen geschützt sind.

   27. H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-OH

   und seine Derivate, in welchen die Amino- und/oder Carboxylgruppe und/oder Mercaptogruppen und/oder Hydroxylgruppen geschützt sind. ;

   28. BOC-Cys(TRI)-GIy-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRI)-Met-Leu-Gly-OH.

   109810/2197

   29. H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gin-Asp(OtBu)-Phe Asn-Lys(BOC)-Phe-His-ThritBuO-Phe-Pro-Gln-ThrCtBuy-Ala-Ile Gly-Val-Gly-Ala-Pro-

   30. " H-Thr-Tyr-Thr-Gin-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC) Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Giy-Val-GIy-Ala-Pro-

   31? Komplexe von Peptiden gemäss den Ansprüchen 16 - 22 mit Zinkphosphat, Zinkpyrophophat und/oder Zinkhydroxyd.

   32· Komplexe von Peptiden gemäss den Ansprüchen 16 - 22 mit Gelatine, Polyphloretinphosphat oder PoIyglutaminsäure. " "

   33· Pharmazeutische Präparate enthaltend Verbindungen gemäss den Ansprüchen J.6 - 22, 32 oder 33·

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