DE1932795A1 - Neues Verfahren zur Herstellung von Bufadienolidgeninen durch fermentative Glycosidspaltung - Google Patents

Description

Neues Verfahren zur Herstellung von Bufadienolidgeninen durch

fermentative Glyeosidspaltung

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Gewinnung von Bufadienolidgeninen, wie zum Beispiel von Hellebrigenin, Scillarenin A und Seilliglaucosidin, der allgemeinen Formel I

in der die Reate .

R₁ ein Wasserstoffatom und R₂ eine Hydroxylgruppe oder

R₁ und R₂ zusammen eine Doppelbindung und

X die Methyl- oder Pormylgruppe bedeuten,

durch fermentative Abspaltung des Rhamnose- oder Glucosido-Rhamnoserestes in Bufadienolidgly cosiden der allgemeinen Formel II

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II

in der die Reste R₁, R₂ und X wie oben definiert sind v.:. Rest R einen Rhamnosido- oder einen Glucosido-rhainnosiä:: bedeutet.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur.Herstellung von Bufadienolidgeninen der Formel I durch fermentative Behandlung von Bufa-.dienolidrhamnosiden der allgemeinen Formel II, besteht darin, . daß man Enzyme verwendet, die aus einem aus dem Erdboden :. Isolierten Stamm CHBS 220 von Asporgillus niger, gewinnen wurden* Dieser Stamm ist im Centraalbureau voor^ Schimmelcultu^as, Baarn/ Niederlande, unter der Nummer GBS .38Q«69.. hinterlegt. ;,

Die bei der fermentativen Abspaltung des Restes R aus VerMn*-_ :-_ düngen der allgemeinen Formel II entstehenden Buf ad sind literaturbekannt und wurden schon auf verschiedenen hergestellt. So wurde durch Säurespaltung mit GhlörwässefstolfΦ gas in Aceton (belgisches Patent Nr. 723 921) oder dureh eriäy-^: matische Spaltung mit dem Pilzferment 889 (Penicillltm spec,s J A. Stoll et al,, Ηθίν. Ohim. Aeta %£, 2308 £Ϊ95Ij) aus cillaridin A das Scillarenin A, durch Säurespaltung mit -wasserstoffgas in Aceton (DAS 1 176 794) oder durch Spaltung mit Ciarase (S.U. Kupchan et al,, Tetrahedron j_968, 149) aus Hellebrin und Desglucohellebrin das .Hölle!,.;■-

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genin, durch saure Spaltung mit Schwefelsäure (A. Stoll et al. HeIv. Chiem. Acta 36,, T534· /T9537 oder durch enzymatisch« Spaltung mit_v einem Pilzferment C 1290 (H. Lichti, A.V. Wartburg, HeIv. Ch^*m. Acta 4_3., 1666 (1960)) aus dem Scilliglaucosidind!-D-glucosid und dem Scilliglaucosidin-ß-D-glucosid das Scilliglaucosidin gewonnen.

Es hat sich jedoch überraschenderweise gezeigt,' daß lediglich das aus dem unter der Nummer CBS-380 69 bei obengenannter Stelle hinterlegten Stamm des Aspergillus niger gewonnene Enzym bei allen Bufadienolidglycosiden'eine quantitative Zuckerabspaltung unter Bildung der entsprechenden Genine in guten Ausbeuten und mit relativ kurzen Fermentierungszeiten bewirkt. Es ist somit das erste in gleicher Weise für alle Bufadienolidglycoside anwendbare Verfahren zur fermentativen Abspaltung der Zuekerreste S

en/
in Verbindungfder allgemeinen Formel II.

Zur fermentativen Abspaltung der Glucosido- oder Glucosidorhaiimosidoreste bei Verbindungen der Formel II dient das Enzym eines aus dem Erdboden isolierten' Stammes von Aspergillus niger. Dieser Stamm wurde auf Czapek-Agar (bestehend aus Jg Natriumnitrat, 1 g Dikaliurahydrogenphosphat, 0,5 g Magnesiumsulfat * 7 H₂O, 0,5 g Kaliumchlorid, 0,01 g Eisen (II) sulfat · 7 H₂O, 30 g Saccharose und 15 g Agar im Liter Wasser) bei einer-Temperatur zwischen 20 und 24-⁰C 7 Tage lang bei diffusem Lichtkultiviert.

Die charakteristischen Merkmale des Stammes sind in der folgenden Tabelle und in der beigefügten Zeichnung, worin in

Figur 1 eine Fußzelle, ih. Figur 2 ein Sterigma und in Figur 3 eine Konidie

dargestellt sind, angegeben.

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Wachstum, Form Farbe

Aussehen

Bemerkungen

Agar-Eolonie

Grundmycel

Luftmyzel Unterseite

Rand, gerade, dünn, diffus

7 Tage 40 mm Dur ehm. 10 Tage 50 mm Durehm.

tief in das Substrat gehend Eonidien im Zentrum dicht, dann diffus, Randzone ' (3-5 mm) ohne Eonidien

weiß-gelblich

(1 A 1 - 1 A 2)

weiß (1A 1)

samtartig

kein Exsudat

hell ocker
(2 A 3) keine
Pigmentabschexdung in das Substrat

Eonidophase Köpfe

Vesiculum Sterigmata

Eoniciiophor

kugelig, 40-45 }x

kugelig, 20-25 p.

zweistufig⁴

primär: 4-5 /x secundär: 5-6 /x ·

250-600 μ lang,10-12 ir Je'¹.i^.'kGi etwo 1 /ι a, Ib- 4.00/1 •dunkeloliv

(3 F 3 - 3 F 4)

farblos
farblos

farblc.-;

Ent f? t e hung auw Fx < zelle, dickwandig (20-30x40-45 ;0

dunV'elbraun(3 ES») r.tUi&pfkegel ige WarsQii
• äquatorial aui¹

der Oberfläche ■ angeordnet

Der Pilzstamm kann in an sich bekannter Weise in Schalenkulturen auf einem festen Substrat, das pektinhaltige Rohstoffe wie, Rübenschnitzel, Apfeltrester oder dergleichen, desweiteren gebundenen Stickstoff und Phosphor enthält und einen Feuchtgehalt von 40 bis 50$ besitzt, bei Temperaturen zwischen 32 und 4O⁰C gezüchtet werden.

Nach 3 bis 4 Tagen werden die Kulturen entweder schonend ge- ' trocknet oder noch in kulturfeuchtem Zustand mit Wasser extrahiert. Aus diesem Extrakt läßt sich durch Aussalzen zum Beispiel mit Ammonsulfat der Träger der enzymatischen Aktivität isolieren. Nach Trocknung und Mahlung der Ausfällung erhält man ein Pulver von grauer Farbe. Für die fermentative Spaltung der Eufadienolid-glyeoside eignet sich sowohl dieses Pulver als auch der wässrige Extrakt selbst.

Die Fermentierung wird, bei Anwendung von viel Wasser, in wässriger Lösung, bei Anwendung von wenig Wasser, in einer Suspension durchgeführt. Der pH-wert der Lösung ist vorteilhafterweise zwischen 5,5 und 7 zu halten. Das Verhältnis Substrat zu Enzym kann zwischen 1:2 und,1 : 4 betragen, die Temperatur vorteilhafterweise 30 bis 45⁰C.

Die Fermentierung läßt sich nicht nur bei reinen Bufadienolid> glycosiden anwenden, sondern auch bei diesen enthältenden r^o» genextrakten. So kann zum Beispiel aus einem etwa 10 $ Helferin enthaltenden Drogenextrakt, der aus" der Droge Helleborus niger gewonnen wurde, in guter Ausbeute Hellebrigenin erhalten werden. Das gleiche gilt für einen etwa 40 bis 50 # Scilliglaucosidin- <X-/-rhamnosid enthaltenden Extrakt aus der Aufarbeitung der Meerzwiebel Seiila maritima L.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern:

009882/2184 bad orig.nal

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Beispiel Ί -.■."..- -. "

3ß,14ß-Dihydroxy-bufa-4,20_f22-trienolid (Scillarenla A)

50 g 3ß-oi-^-Rhamiiosido-3ß,Hß-dihydroxy-bufa-4-,20_t22-trienolid und 100 g Enzymfällung werden zusammen mit 20 g See sand und 75 g Natriumacetat gemischt, mit etwas Wasser versetzt Md in einer Reibschale gut verrieben. Der Brei wird mii; 300 ml Wasser versetzt und die Suspensien unter Rühren 14 Tage "bei 40⁰C -... stehengelassen. Der pH-Wert muss zwischen 5,8 und 6,5 liegen. Die Rhamnoseabspaltung wird dünnschichtchroiaatographissh. ;ver- * folgt. Nach beendeter Reaktion wird die Suspension über 20 g ■Gelite■ 545 filtriert, das Filtrat dreimal mit je 300 nl einer Mischung von Chloroform'mit Äthanol im Verhältnis 8 : T extrahiert, getrocknet und die vereinigten Extrakte zur TroeiceÄe ein gedampft. Es schließt sich eine säulenchroiaatögraphiscfee- Trennung mit Kieselgel (0,2 - 0,5 mm) an, um etwas gleichzeitig gebildetes 14ß-Hydroxy-3-oxo-bufa-4,20,22-trienoliä acäiiMeiüifii Die Elution erfolgt mit Ghloroform/Aceton-Mischungen im Yer-? ■-... hältnis 9 : 1 bis 5' : 1.

Ausbeute; 29,0 g (80 % der Theorie) , ; . Fp.: 245 -25O⁰G. _ ^ :^: ; _:_ ; /

Beispiel 2 .· ; .; . _;., _: .; \ _ ;_{r :} 3ß,14ß-Dihydröxy-19-oxo-bufa-4,20,22-trienolid (Scilliglaacosi-

a) Darstellung aus 3ß-^-^-Rhamnosido-r3ß,14B-dihydroxy-19^QXO- büfa-4,20,22-trieholid. ' -■-- . ■ v,

750 mg 3ß-^-^-Rha]omosidö-3ßv14ß-dihydroxy-i9-öxo-b^ ^! 22-trienolid werden in 1500 ml destilliertem \iasser gelöst, mit 1 g Enzymfällung versetzt und 18 Tage "bei 4-0⁰C "belassen* Der Reaktionsablauf wird dünnschich.tchromatogräphiscii verfolgt. Das zum Teil auskristallisierte Endprodukt wird-abfiltriert, das Filtrat auf ein kleines Yolumen eingeengt ' und vom ausfallenden Niederschlag abfiltriert. Die T@reinigten Niederschläge werden in Aceton gelöst'und nach Zugabe von η-Hexan umkrisitalliaiert. ; 00;988272ΐ84

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— ν —

Ausbeute: 4-25 mg (77,5 i> der Theorie) 3ß,14ß-Dihydroxy-19-oxo-bufa-4,20,22-trienolid vom F.: 24-2 - 247°C.

b) Darstellung aus einem etwa 40 - 50 $ 3ß-ii-/-Rhanrriosido-3ß, 14ß-dihydroxy-19-oxo-bufa-4,20,22-trienolid enthaltenden Drogenextrakttrockenrückstand

800 mg de3 etwa 50 - 60 $-igen Drogenextraktes werden in 500 ml dest. Wasser gelöst, mit 1 g Enzymfällung versetzt und 18 Tage bei 40°C belassen. Nach Einengen der Reaktionslcsung auf etwa 150 ml wird erschöpfend mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten und getrockneten Chloroformextrakte werden auf ein kleines Volumen eingeengt und mit Äther bis zur leichten Trübung versetzt.

Es kristallisieren 240 mg 3ß,14ß-Dihydroxy-19-oxo-bufa-4,20, 22-trienolid vom F.: 240 - 243⁰C aus.

Beispiel 3

3ß,5ß,14ß-Trihydroxy-19-oxo-bufa~20_s22-dienolid (Hellebrigenin)

a) Darstellung aus 3ß-;£- £-Rhamnosido-3ß»5ß»14ß-trihydroxy-19-oxo-bufa-20,22-dienolid

. 4 g 3ß-ül-^-Rhamnosido-3ß,5ß,14ß-trihydroxy-19-oxo-b■αfa-20, 22-dienolid werden in 2 1 destilliertem Wasser gelöst und mit Natriumacetat-Puffer auf pH- 5,75 eingestellt. Xa.ch Zu-. gäbe von 4 g Enzymfällung bleibt die Lösung 18 Tage bei 40°C stehen. Das zum Teil auskristallisierte Endprodukt \-:Lrd abfiltriert und aus dem eingeengten Filtrat erneut eine Menge Endprodukt erhalten. Umkristallisieren aus I'ethaivC/ Wasser ergibt 2,2 g (82 fo der Theorie) 3ß,5ß,14ß-Trihydroxy-19-oxo-bufa-20,22-dienolid vom F.: 229 - 232⁰C

"b) Darstellung: aus 3-ß-(4'-d-gluco5ido)-cd-/-rhamnosido-3ß , 5ß, 14ß-trihydroxy-19-oxo-bufa-20,22-dienolid (Hellecr-ir.)

2 g Hellebrin werden in 1 1 destilliertem \Iassex gelöst.,- Eit 2 g Enzymfällung versetzt und 14 Tage bei 4O⁰C belassen. Die Reaktionslösung wird zur Trockene eingeengt, und der Rückstand erschöpf end mit Chloroform ausgezogori. DiG vereinigten

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und getrockneten Chloroformauszüge werden auf ein kleines Volumen eingeengt und bis zur leichten Trübung mit Äther versetzt. Man läßt sie auskristallisiereri. Ausbeute: 1 g (37 ^ der Theorie) 3ß,5ß,14ß-Trihydroxy-19-oxo-bufa-20,22-dienolid vom F.: 226 - 231⁰C

c) Dar stellung aus einem etwa, 10 fo hellebrinhaltigen Drogenextrakttrockenrückstana

200 g etwa 10 ^-iger hellebrinhaltiger Drogenextrakttrockenrückstand werden in 10 1 destilliertem Wasser 3 Stunden gerührt, "vom. Niederschlag abfiltriert und mit 30 g Enzymfällung versetzt» DeTi.V/ert soll zwischen 5,3 tmd 6,5 liegen-, A^rach 14-tägigem Stehen bei 40⁰C ist die Reaktion beendet. Der ausgefallene Rückstand, ein Sapogenin, wird abfiltriert, die ;. Lösung 8; mal mit je 1,5 1 Chloroform extrahiert und die vereinigten und getrockneten Chloroformextrakte zur Trock?r.e ,eingeengt. Nach Auflösen des Trockenrückstandes in Acetcn wird durch Zugabe von Äther bis zur beginnenden Trübung äuskristallisiert. Das so anfallende Roh-hellebrigenin wird über einer AIpO,-Säule, Woelm, neutral, Aktivitätsstufe 1, mit Chloroform/Äthanol im Verhältnis 99 : 1 bis 90 : 60 gereinigt.

Ausbeute: 4,37 g 3ß,5ß,14ß~Trihydroxy-19-oxo-bufa-20,22-dienolid
Fp.: 230 - 231⁰C. ·

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Claims (1)

1. P ate η ta η 3 p r ü g he

   ( 1 WVerf ahren zur Herstellung von Bufadienolidgeninen der allgemeinen Formel I - .. : :

   I,

   in der die Reste _:

   R₁ ein Wasserstoffatom und R^ ei^ne Hydroxylgruppe oder

   R₁ und Ε« zusammen eine Doppelbindung und X die Methyl- oder Formylgruppe "bedeuten;, dadurch gekennzeichnet, daß Bufadienolid.-glycoside der allgemeinen Formel

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   -το -

   II

   in der die Reste R^, Rg und X wie oben definiert sind und · der Rest R einen Rhamnose- oder Glucosido-Rhamnoserest bedeutet, durch Enzyme, welche durch den Stamm. CHBS 220 von Aspergillus niger gebildet werden, feraientativ gespalten werden.

   Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die fermentative Spaltung in wässrigem Milieu bei einem pH-Wert zwischen 5i5 und 7,0 und bei Temperaturen zwischen 30 und 45⁰C- durchgeführt wird. _; ;

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