DE1793556B1

DE1793556B1 - 7-Chlor-5-hydroxy-6-desoxy-6-desmethyl-6-methylentetracyclin,6-Desoxy-6-desmethyl-6-methylentetracyclin,5-Hydroxy-6-desoxy-6-desmethyl-6-methylentetracyclin und deren Salze mit Saeuren und Basen sowie diese Verbindungen enthaltende Antibiotika

Info

Publication number: DE1793556B1
Application number: DE19611793556
Authority: DE
Inventors: Rennhard Hans Heinrich; Beereboom John Joseph; Blackwood Robert Keith; Stephens Jun Charles Robert
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1960-05-23
Filing date: 1961-05-19
Publication date: 1972-03-09
Also published as: DE1768971B2; DE1793176B1; DE1768971A1; DE1793176A1; NL6713970A; DE1793556C2; DE1793176C2

Description

Die Erfindung betrifft T-Chlor-S-hydroxy-o-desoxyo-desmethyl-o-methylentetracyclin, 6-Desoxy-6-desmethyl-6-methylentetracyclin, 5-Hydroxy-6-desoxyo-desmethyl-ö-methylentetracyclin und deren Salze mit Säuren und Basen sowie diese Verbindungen enthaltende Antibiotika.

Die Tetracyclin-Antibiotika umfassen eine Gruppe von biologisch aktiven Perhydronaphthacenverbindungen mit den folgenden, wesentlichen strukturellen Merkmalen. Als Numerierungssystem wird das der »Chemical Abstracts« verwendet.

IO

r-OH

^- CONH₂

Unter den biologisch aktiven Gliedern dieser Gruppe sind diejenigen, welche die folgenden Reste enthalten:

Substituenten	übliche Bezeichnung
4-N(CH₃)₂, 6-OH, 6-CH₃, 12a-0H	Tetracyclin
4-N(CH₃J₂, 5-OH, 6-OH, 6-CH₃, 12a-0H	5-Oxy tetracyclin
4-N(CH₃J₂, 6-OH, 6-CH₃, 7-Cl-12a-OH	7-Chlortetracyclin
4-N(CH₃)₂, 5-OH, 6-CH₃, 12a-0H	6-Desoxy-5-oxytetracyclin
4-N(CH₃)₂, 6-CH₃, 12a-0H	6-Desoxytetracyclin
4-N(CH₃J₂, 12a-0H	ö-Desoxy-o-desmethyltetracyclin
4-N(CH₃)₂, 6-OH, 6-CH₃, 7-Br, 12a-OH	7-Bromtetracyclin
4-N(CH₃J₂, 6-OH, 7-Cl, 12a-OH	6-Desmethyl-7-chlortetracyclin
4-N(CH₃)₂, 6-OH, 12a-0H	6-Desmethyltetracyclin

Gegenstand der Erfindung sind 7-Chlor-5-hydroxy-6 - desoxy - 6 - desmethylen - 6 - methylen - tetracyclin, 6-Desoxy-6-desmethyl-6-methylentetracyclin und 5 - Hydroxy - 6 - desoxy - 6 - desmethyl - 6 - methylentetracyclin und deren Salze mit Säuren und Basen.

Die 1 la - Deshalogenverbindungen weisen einen überraschend hohen Grad an Aktivität auf, wenn man sie in vitro gegen eine Vielfalt von krankheitsverursachenden Organismen prüft. Sie sind besonders wirksam gegen antibiotikaresistente Stämme von Mikroorganismen.

Die folgende Tabelle faßt die Aktivität von 6-Methylentetracyclin gegenüber verschiedenartigsten krankheitsverursachenden Mikroorganismen einschließlich antibiotikaresistenten Stämmen zusammen. Die Mindesthemmkonzentration wird durch die bekannte Technik der Verdünnungsreihe bestimmt. In der Tabelle sind auch die entsprechenden Werte von lla-Chlor-o-methylentetracyclin und von 6-Desoxytetracyclin angeführt. Es ergibt sich, daß die Werte für 6-Methylentetracycline im allgemeinen niedriger sind als diejenigen für o-Desoxytetracyclin, was eine größere Aktivität anzeigt, insbesondere gegenüber Micrococcus pyogenes var. aureus 400, einem tetracyclinresistenten Organismus.

1. 6-Methylentetracyclin,

2. 6-Desoxytetracyclin (bekannt),

3. o-Desoxy-o-desmethyl-o-methylen-S-oxytetracyclin,

4. 7-Chlor-6-desoxy-6-desmethyl-6-methylen-5-oxytetracyclin.

Organismus

Mindesthemmkonzentration (-■ ml)

Micrococcus pyogenes var. aureus 5

Streptococcus pyogenes

Streptococcus faecalis

Diplococcus pneumoniae

Erysipelothrix rhusiopathiae

Corynebacterium diphtheriae

<0,19
<0,19
<0,19
<0,19

<0,19
0,78

0,78
0,39
0,78
3,12
0,39
3,12

0,78 0,78 0,39 0.39 0,39 3,12

0,25

0,03

0,6

0,06

0,125

1,0

ORIGINAL INSPECTED

Fortsetzung

Organismus Mindesthemmkonzentration (y/ml)

Listeria monocytogenes

Bacillus subtilis

Lactobacillus casei

Bacterium ammoniagenes

Streptococcus pyogenes 98

Micrococcus pyogenes var. aureus 209 ρ Aerobacter aerogenes

0,19	6,25
<0,19	0,01
0,78	25
<0,19	0,78

3,12

6,3

0,19 0,09 0,78 0,39 0,09 0,25 6,3

0,19 0,01

0,19 0,01 0,25 1,56

Organismus

Mindesthemmkonzentration (g/ml)

Escherichia coli

Proteus vulgaris

Pseudomonas aeruginosa

Salmonella gallinarum

Salmonella pullorum

Klebsiella pneumoniae

Neisseria gonorrhoeae

Hemophilus influenzae

Shigella sonnei

Brucella bronchiseptica .'

Malleomyces mallei

Vibrio comma

Pasteurella multocida

Streptococcus agalaetiae

Mycobacterium 607

Mycobacterium berolinense

Candida albicans

Sarcina lutea

Antibiotikaresistente Stämme von Micrococcus pyogenes var. aureus

Stamm 376*)

Stamm 400**)

*) = Tetracyclinresistent bei einer Konzentration unter 100 r/ml. **) = Tetracyclinresistent bei einer Konzentration unter 50 y/ml. (p) = Teilhemmung.

Bei Wiederholung dieser In-vitro-Versuche in Gegenwart von Humanserum beobachtet man ähnliche Ergebnisse. Die folgende Tabelle faßt die Aktivität der in der Tabelle genannten Verbindungen bei der Prüfung in 20%igem Humanserum zusammen:

1,56

12,5 25,0 3,12 0,78 1,56

<0,19 <0,19 3,12

<0,19 0,39

<0,19 <0,19 <0,19 <0,19 <0,19

<0,19

6,25 0,78

6,3

100

100 12,5 3,12 6,3 0,78 0,09 3,12 0,19 3,12 0,19 0,39

0,19 100 100

6,3

3,12

100 12,5 3,15(p) 3,15(p) 0,19 0,19 3,12 0,39 1,56 0,78 0,19 0,39

0,78

3,12 1,56 0,78 0,78 0,06 0,03 0,39 0,25 0,25 3,12 0,5

0,78

100 50

100 100

Micrococcus pyogenes var.
aureus 5

Streptococcus pyogen'es ...
Streptococcus pyogenes 98

Micrococcus pyogenes var.
aureus 209 ρ

Mindesthemmkonzentration

(r/ml)

60

0,78 0,39

0,78 0,78

0,39 0,09 0,19

0,39 Es sei bemerkt, daß 7-Chlor-6-desoxy-6-desmethyl-6-methylen-5-oxytetracyclin eine größere In-vitro-Aktivität gegen eine große Anzahl von Mikroorganismen als o-Desoxy-o-desmethyl-ö-methylen-S-oxytetracyclin besitzt.

Prüft man o-Desoxy-o-desmethyl-o-methylen-5-oxytetracyclin in vivo sowohl bei oraler als auch bei parenteraler Gabe, so zeigt diese Verbindung eine größere Aktivität als Tetracyclin oder 5-Oxy tetracyclin gegenüber einer durch Tetracyclin empfindliche Mikroorganismen erzeugten Infektion. Die ED₅₀ (ED = Schutzdosis) beträgt für die neue Verbindung bei einer Infektion durch Micrococcus pyogenes var. aureus 5, bei oraler Gabe 3,2 mg/kg und bei parenteraler Gabe 0,34 mg/kg. Die entsprechende ED₅₀ für Tetracyclin beträgt bei oraler Gabe 6,4 mg/kg und bei parenteraler Gabe 0,78 mg/kg.

Die 6-Methylenverbindungen können zu einer Vielfalt von Applikationsformen analog den Stammverbindungen verarbeitet werden. Sie sind brauchbar in der Humantherapie, und sie sind therapeutisch in Futtermitteln oder als Wachstumstimulantien, in der Veterinärmedizin und in der Landwirtschaft brauchbar.

Die Ausgangs- und Zwischenverbindungen, die für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen benötigt werden, können wie folgt hergestellt werden:

a) 11 a-Chlortetracyclin-o, 12-hemiketal

Zu einer Lösung von 2,2 g wasserfreiem Tetracyclin in 25 ml Dimethyläther des Äthylenglykols gibt man 800 mg N-Chlorsuccinimid unter Rühren bis zur Lösung. Man läßt die Mischung 7 Minuten stehen und verdünnt sie dann mit 25 ml Wasser. Es kristallisieren 873 mg des Produktes als weiße Nadeln.

Das kristalline Hydrochlorid dieses Produktes erhält man durch Lösen in überschüssiger, wäßriger Salzsäure (pH-Wert ungefähr 1) und Gefriertrocknung der Mischung.

b) 1 la-Chlor-o-desoxy-o-desmethyl-6-methylentetracyclin (A)

Man löst lla-Chlortetracyclin-o,! 2-hemiketal in flüssigem Fluorwasserstoff (in einem Verhältnis von 2 g/15 ml) bei 0⁰C. Man hält die Mischung 10 bis 15 Minuten bei dieser Temperatur. Danach wird der Fluorwasserstoff abgedampft. Der Rückstand wird zur Gewinnung des Hydrofluoridsalzes des 1 la-Chlor-6 - desoxy - 6 - desmethyl - 5 - methylentetracyclins als festes Produkt mit Äther verrieben und das feste Produkt aus Methanol umkristallisiert. 2,74 g des reinen, amorphen amphoteren 7-Chlor-6-desoxy-6-desmethyl - 6 - methylen - 5 - hydroxytetracyclins.

Man kristallisiert das Produkt durch Lösen von 1,6 g in 40 ml warmem Methanol und Kratzen. Die Filtration ergibt 890 mg des Produkts als amphotere Base. Die Ultrarotanalyse zeigt die folgenden Spitzen: 2,96, 3,29, 3,42, 6,06. 6,18, 6,30, 6,58, 6,88. 7,19. 7.43, 7,70, 8,23, 9,06, 9,88, 10,63, 10,92, 11,55 und 11,76 μ. Die Ultraviolettanalyse ergibt die folgenden Werte:

In 0,0In-HCl in Methanol: Maxima bei 247 ma (log f = 4,28) und 346 ηΐμ (log f = 4.02): Inflektion bei 370 ma (log f = 3,98);

In 0,0In-NaOH in Methanol: Maxima bei 234 ma (log t = 4,24), 253 ιυμ (log ? = 4,22) und 389 ma (log F = 4,12); Inflektion bei 284 ma (log e = 4,07);

In 0.0In-MgCl₂ in Methanol: Maxima bei 241 ηΐμ (log t■"= 4,32); 349 ma (log _f = 4,04) und 372 mμ (Schulter) (log f = 4,02).

Das Produkt zeigt die folgenden R_f-Werte in den angegebenen Lösungsmittelsystemen:

Lösungsmittelsystem

R ,-Wert

0,35

0,33

Mobile Phase

Essigsäureäthylester
mit Wasser gesättigt

Immobile Phase

wäßriger Phosphatpuffer (pH-Wert 3)

Puffer nach Mcllvaine (pH-Wert 4,2)

c) 5-Hydroxy-11 a-chlor-o-desoxy-o-desmethyl-6-methylentetracyclin

Man gibt 5 g lla-Chlor-S-oxytetracyclin-o,! 2-hemiketal zu 15 ml trockenem, flüssigem Fluorwasserstoff und rührt die Mischung 3¹J₂ Stunden bei Eisbadtemperatur. Der Fluorwasserstoff wird durch Erwärmen in einem Stickstoffgasstrom abgedampft, wobei man das Produkt als Hydrofluoridsalz erhält. Das Hydrojodidsalz fällt man aus Acetonlösung des rohen Hydrofluoridsalzes durch Zugabe von 47^0/-wasserstoffsäure aus.

yoiger Jod-Der biologische Versuch (Klebsieila pneumoniae— Oxytetracyclin als Standard) ergibt einen Wert von 6000 5</mg.

Hydriert man das kristalline Perchloratsalz des 7,lla-Dichlor-6- desoxy - 6 - desmethyl - 6 - methylen-5-hydroxytetracyclins und kristallisiert das Hydrierungsprodukt aus Methanol und 70%iger Perchlorsäure, so erhält man das Perchlorat von 7 - Chlor-6 - desoxy- 6 - desmethyl - 6 - methylen - 5 - hydroxy- tetracyclin, das die gleichen Ultraviolettspektren wie die amphotere Base zeigt.

Beispiel 2 Beispiel 1

Man suspendiert 20 g des /2-Naphthalinsulfonats des 7,1 la-Dichlor-o-desoxy-o-desmethyl-o-methylen-5-hydroxy-tetracyclins in 500 ml Methanol, welches 5 g 5%iges Rhodium auf Kohlenstoff enthält, und hydriert die Mischung bei Zimmertemperatur und einem Wasserstoffdruck von 1 at. Nach Aufnahme von 700 ml Wasserstoff filtriert man die Reaktionsmischung, dampft das Filtrat zur Trockene ein und erhält 15,4 g Rückstand.

Man stellt eine methanolische Lösung von 11g des Rückstandes mit Triäthylamin auf den pH-Wert 6,5 ein und gibt die Lösung auf eine Säule (8-100 cm), welche 2 kg Cellulosepulver enthält, unter Verwendung von Wasser als stationärer Phase. Die Kolonne wird mit Essigsäureäthylester, welcher mit Wasser gesättigt ist, eluiert. Man fängt 45-ml-Fraktionen auf. Man verfolgt den Eluierungsverlauf papierchromatographisch und gibt die Fraktionen 132 bis 250 zusammen, dampft sie zur Trockne ein, schlämmt den Rückstand in Äther auf und filtriert. Man erhält lla-Chlor-o-desoxy-o-desmethyl-o-methylentetracyclin (5 mg) wird zu 3 ml Methanol gegeben, und dazu gibt man eine Lösung von Natriumhydrosulfit (20 mg in 2 ml Wasser). Die Mischung wird 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, das Methanol entfernt und mit Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wird eingeengt, wobei man kristallines 6 - Desoxyo-desmethyl-methylentetracyclin erhält. Das Produkt zeigt Ultrarot-Absorptionsmaxima (auf Kaliumbromid) bei 6,0, 6,2, 6,35 und 6,85 Mikron und Ultraviolett -Absorptionsmaxima (in 0,01 normaler methanolischer Salzsäure) bei 260 und 353 ΐημ (Ej* = 278).

Bei der Prüfung gegen Klebsieila pneumoniae weist das Produkt eine Oxytetracyclin-Aktivität von 1200 y/mg auf. Das Produkt zeigt einen R_rWert von 0,6 in folgendem System:

Mobile Phase

Toluol-Pyridin (gesättigt mit
einem pH-4,2-Puffer) (20:3)

Immobile Phase

pH-4,2-Puffer (wäßrig)

Mobile Phase

Immobile Phase

Nitromethan zu Chloroform zu pH-3,5-Puffer
Pyridin (20:10:3) (wäßrig)

Beispiel 3

Man gibt zu einer Lösung von 5 g des Produkts nach c) (als Hydrojodid) in 125 ml verdünnter Salzsäure (1 Teil konzentrierte HCl in 55 Teilen Wasser) bei 20⁰C 2 g Zinkstaub. Nach 10 Minuten Rühren wird das Zink abfiltriert, das Filtrat auf den pH-Wert 0,8 eingestellt und mit Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wird unter vermindertem Druck zu einem Rückstand eingeengt, welcher mit Äther verrieben wird. Der ätherunlösliche Rückstand wird aus einem Gemisch von Methanol, Aceton, konzentrierter Salzsäure und Äther kristallisiert. Man erhält das Produkt als Hydrochlorid-monomethanolat (2,5 g) mit einem Schmelzpunkt von 205° C unter Zersetzung. Die Ultraviolettabsorptionsanalyse gibt folgende Werte:

Es folgt der Lösungsmittelfront in dem folgenden System:

In 0,0In-HCl in Methanol: X_n^_x 252 ΐημ, EU 450 und X_max 345 ΐημ, EJl 302;

in 0,01 n-NaOH in Methanol: X^_x 235 ΐημ, EJl 442; X_max 254 πι_μ, EJl 408; X^_x 385 ηΐμ, EJl 329;
5,._π/280ηΐμ, EU 329;

in 0,01 n-MgCl₂ in Methanol: X^_x 240 πΐμ, EJ* 461; X_max 277 ταμ, EU 326; X^_x 351 ηΐμ, EJl 282.

Die Ultrarotabsorptionsanalyse zeigt hauptsächlieh Spitzen bei 6,03, 6,2, 6,37 und 6,87 Mikron. Der biologische Versuch ergibt einen Wert von 2000 bis 2400 y/mg (K. pneumoniae; Trübungsmessung; Oxytetracyclin als Standard).

Die Elementaranalyse des Produktes ergibt die folgenden Werte: C 55,5%, H 5,2%, N 5,5%, Cl 7,0%, OCH₃ 3,4%. Das Produkt zeigt in den folgenden Systemen R_f-Werte von 0 bzw. 0,35:

Mobile Phase

(1) Toluol-Pyridin (gesättigt
mit pH-4,2-Puffer) (20:3)

(2) Nitromethan, Chloroform,
Pyridin (gesättigt mit
pH-3,5-Puffer) (20:10:3)

Immobile Phase

pH-4,2-Puffer
(wäßrig)

pH-3,5-Puffer
(wäßrig)

209 5Π/430

Claims

Patentansprüche:

1. T-Chlor-S-hydroxy-o-desoxy-o-desmethyl-6 - methylen - tetracyclin, 6 - Desoxy - 6 - desmethyl-6-methylen-tetracyclin und 5-Hydroxy-6-desoxy-6-desmethyl-6-methylen-tetracyclin und deren Salze mit Säuren und Basen.

2. Antibiotikum, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Verbindung gemäß Anspruch 1.